유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

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Summary

유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록

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Bingham, K. N., Lee, M. D., Rawlings, J. S. The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells. J. Vis. Exp. (106), e53533, doi:10.3791/53533 (2015).

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Abstract

적절한 면역 반응 동안 대기 T 세포는 항원 특이 적 T 세포 수용체에 대한 항원 제시에 따라 활성화된다. 이 항원을 인식하는 수용체를 부담 만 T 세포 클론의 증식을 이끈다. 염색질 decondensation는 T 세포 활성화의 특징이며, T 세포는 항원 결합 후에 증식하는 능력을 획득하기 위해 요구된다. 염색질 응축의 변화는 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하여 검출 할 수있다. 이 항체는 활성화 된 T 세포에서뿐만 아니라 그들이 할 수 나이브 T 세포에서의 항원에 결합 할 수 없습니다. 우리는 동시에 고칠 수 죽은 세포 얼룩 T 세포의 특정 표면 마커, 추적 가능성을 얼룩 및 히스톤 H3 단백질의 세포 내 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 염색 된 세포는 유세포 분석되고 염색질 응축 상태는 히스톤 H3 염색의 평균 형광 강도 (MFI)로 측정된다. ChromatT 세포의 활성화 과정에서 decondensation MFI의 증가로 입증된다

Introduction

유동 세포 계측법은 세포 집단의 다수의 물리적 파라미터의 형광 분석을 위해 개발 된 레이저 기반 기술이다. 이 기술이나 세포 내 유체 스트림의 만남에 현탁 세포로서 레이저 흥분 형광 마커를 작동한다. 이 마커는 감지 광전자 증 튜브에 의해 정량화 빛을 방출한다. 유동 세포 계측법은 전통적 세포 집단을 식별하는 데 사용 되었으나, 이는 세포막의 무결성, 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 거래 1-3 포함한 전지 특성의 배열을 연구 할 때 유용한 기술로 입증되었다. 우리는이 기술들은 시험 관내 (4)에서 활성화 될 때 T 세포의 염색질 상태를 검출하는데 사용될 수있는 프로토콜을 개발했다. 우리는 또한 T 세포 (5)의 활성화를 유도 염색질 decondensation의 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

T 세포 activati​​on 및 확산은 적절한 면역 반응에 중요하다. T 세포, 면역 시스템 내 림프구의 특정 서브 세트는 적절한 면역 반응 및 면역 학적 메모리의 개발에 요구된다. 항원 (6에서 검토)의 무부하 T 세포의 세포 표면에있는 T 세포 수용체 (TCR)에 주요 호환성 착체의 컨텍스트에서 제공 될 때 활성화가 개시된다. 이는 세포의 Ca2 + 농도 (7)(8-10에서 검토)의 활성화에 필요한 전사 인자의 핵 전좌의 증가 남중 T 세포 내의 동적 고도로 정렬 된 분자 일련의 이벤트를 트리거한다. 일단, T 세포는 인터루킨 -2 (IL-2), JAK (야누스 키나제) / STAT를 이용하는 강력한 성장 인자에 반응하는 능력을 획득 활성화 (신호 변환기와 전사 액티베이터) 경로가 활성화 T의 클론의 증식을 구동 셀 (11). 간략하게, IL-2 자극STAT 단백질 세포질 잠상 전사 인자의 계열의 인산화 결과. 인산화되면 STAT 단백질은 이량 화, 핵으로 이동시키다 및 세포주기 진행에 관련된 것들을 포함하는 유전자의 발현을 구동한다. T 세포, T 세포의 증식에 필요한 12,13 STAT5 통해 IL-2 신호.

활성화 된 T 세포의 클로 날 팽창을 달성하기 위해, 항원 - 결합 TCR (나이브 T 세포)를 경험하지 아니한 세포는 IL-2의 강력한 효과를 무시하는 메커니즘을 가져야한다. 이것은 염색질 상태의 규제를 통해 달성된다. 나이브 T 세포는 IL-2 자극에 응답 STAT5-DNA 결합을 금지 응축 된 염색질을 갖는다. 활성화되면, 염색질 decondenses 및 STAT5는 클론 증식 4를 허용, 표적 유전자의 프로모터에 액세스 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 염색질 상태의 변화는 히스톤 PROTEI의 후생 유전 학적 변형에 의존하지 않는다NS (검토를 위해, 14 참조) 우리는 T 세포 활성화 4시 히스톤 수정에는 글로벌 변화를 관찰하지 않기 때문에.

이 연구를 수행하는 동안, 우리는 히스톤 단백질에 대해 제기 항체는 순진 세포에 자신의 에피토프를 액세스하는 어려움을 가지고 있다는 것을 발견,하지만 활성화에 따라 그보다 쉽게 자신의 항원 결정기 (4)를 결합 할 수 있습니다. 따라서, 히스톤에 결합하는 항체는 염색질 응축 상태를 판독 역할을한다. 여기서 우리는 방법 T 세포에서 염색질 상태를 평가하기 위해 형광 접합 된 히스톤 H3 항체를 검출하는 유동 세포 계측법을 사용하도록 제안한다. 세포 집단 내의 염색질 응축은 히스톤 H3 염색의 평균 개화 강도 (MFI)로 측정된다. 염색질의 decondensation를 나타내는 T 세포 활성화, 히스톤 H3 염색 증가 MFI, 문맥에서. 히스톤 H3 세포 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 이외에,이 프로토콜은 또한 incorporaTES는 세포의 소집단의 분석을 허용, 염색 및 살아있는 세포에 대한 정착 얼룩 표면.

Protocol

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 동물 프로토콜은 퍼먼 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: A3242-01 허가 번호)에 의해 승인되었다. 사용 된 버퍼가 버퍼 및 솔루션의 표에서 확인할 수 있습니다 동안이 프로토콜에 사용되는 모든 재료와 장비, 재료 및 장비의 표에서 확인할 수 있습니다.

마우스 비장에서 림프구 1. 단일 세포 현탁액

  1. CO 2 질식을 통해 마우스를 희생. 자궁 전위에 의해 안락사를 확인합니다.
    참고 : 같은 성별의 (예를 들어, / 6 C57B)이 6-8주 된 동종 마우스에서 비장을 사용합니다. 일반적으로, 두 비장 처리됩니다.
  2. 풍부 70 % 에탄올 수용액 및 헤드가 왼쪽 직면하도록 동양으로 동물 스프레이.
  3. 집게를 사용하여 위쪽으로 멀리 t에서 동물의 피부를 리프트그는 몸. 가위를 사용하여 동물의 복부 주변의 피부를 통해 작은 홈을 잘랐다. 손가락을 이용하여 뒷다리의 시작 목 복막을 노출시키는 절 결부의 양쪽을 당긴다. 비장은 복막 바로 아래에 표시되어야합니다.
  4. 집게를 사용하여 복막을 들어 올려 비장을 노출 할 수있는 작은 절개를합니다. 집게와 비장을 제거하고 지방과 결합 조직을 멀리 애타게 가위를 사용합니다.
  5. 2 % 태아 소 혈청으로 보충 된 10 ml의 PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 비장을 배치 (이하 PBS + 2 % 이상으로 함). 단일 세포 현탁액을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다.
    참고 : 일반적인 복구 비장 당 60-90000000 사이의 세포이며, 일반적으로, 2 백만 세포 샘플 당이 필요하다. 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행한다.
  6. 멸균 100mm 조직 배양 접시에 비장을 가만히 따르다.
  7. T 두 프로스트 현미경 슬라이드를 얻어 개최두 거친 프로스트 표면이 서로를 향해 안쪽으로 마주 보도록 그는 슬라이드. PBS + 2 % 용액에 슬라이드를 습윤 페트리 접시에 붓고.
  8. 여전히 침수 가장자리에, 슬라이드의 프로스트 표면 사이의 비장을 잡고 서로 (그림 1A)에 대해 앞뒤로 슬라이드를 움직여 부드럽게 비장 갈기. 세포는 배양 접시에 빠질 것입니다. 모든 셀이 출시과 비장의 유물 (그림 1B) 흰색 표시 될 때까지 연마를 계속합니다.
  9. 피펫으로 세포 현탁액을 그려 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 필터를 통해 천천히 필터링합니다. 빨간 펄프의 작은 조각이 필터 (그림 2A)에 존재할 수 있습니다.
    1. 필터가 상승하면, 부드럽게 필요에 따라이 과정을 반복, 유체를 통해 드레인과 50 ML 원뿔 관에 다시 필터를 배치하고 계속 할 수 있도록 약간 들어 올려. 5 개 이상이면 처리 spleENS, 두 개의 배치에 나누어 각각 새로운 필터를 사용하는 것이 필요할 수있다.
  10. 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부를 사용하여 부드럽게 스트레이너 (도 2b)를 통해 나머지 세포를 포함하는 적색 펄프를 누른다. 모든 빨간 펄프 필터 (그림 2C)를 통과 한 것을 확인하기 위해 필터 바닥과 측면을 모두 눌러해야합니다.
  11. 조직 배양 접시에 10 mL의 PBS + 2 %를 추가하고 남아있는 세포를 복구하기 위해 슬라이드, 주사기 스토퍼, 그리고 요리를 세척 할 때 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 같은 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 이 단계가 필요한만큼 반복합니다.
  12. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기.
  13. 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. PBS + 2 %의 미량이 튜브에 남아있을 것이다. 튜브 캡과 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 펠릿을 가볍게.
  14. 광고로를 Lyse 적혈구ACK 용해 버퍼의 딩 2 용액 (0.15 M NH 4 CL, 1 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, 4 ° C에서 7.2, 저장소의 pH) 원뿔 튜브에 비장 당 회전 보장하기 위해 튜브를 반전 모든 세포 ACK 버퍼와 접촉. 부드럽게 실온에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이 친다.
  15. PBS + 2 % ACK 버퍼 중화 튜브를 첨가하여 50 ml의 세포 현탁액의 양을 준비한다. 4 ℃에서 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고 10 시간을 전환. 원심 분리가 완료되면, 펠렛을 백색 (도 3)이어야한다.
  16. 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. 튜브에 PBS + 2 %의 미량 남기기 튜브를 캡핑하고, 재현 탁을 위해 펠릿을 가볍게.
  17. T 세포 배지 [10 % FBS, 10 mM의 HEPES (PH 7.0), 2 mM의 루타, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 또한 10 ㎖를 추가 부드럽게하여 펠릿을 재현 탁로 pipetting 아래. 그런 다음 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 새로운 70 μm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링 할 수 있습니다.
  18. 원래 튜브 헹구고 여과 셀의 나머지 부분을 포함하는 튜브에 70 μm의 필터를 통해 통과하는 T 세포의 다른 매체를 사용하여 5 ~ 10 mL로. 두 개 이상의 비장을 처리하면, T 세포 배지의 부피는 회복을 최대화하도록 증가 될 수있다.
  19. 준비가 염색 할 때까지 얼음에 세포를 유지합니다. 세포 계산과 생존에 액세스 할 수 있어야합니다.
    1. 세포를 계산하려면 24 PBS + 2 % ㎖의 3 ㎖ 0.4 % 트리 판 블루로 세포의 3 ㎖을 결합한다. 로드 향상 노이 바 우어의 혈구의 각 챔버에이 10 ㎖. 트리 판 블루 배제에 의해 평가로 생존은 85-95% 사이에 일반적입니다.

2. 생존과 표면의 얼룩

  1. 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 1 × 107 세포 / ml의 농도로 T 세포 배지에서 세포를 재현 탁. TRANSFU 바닥 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 200 만 ER 셀 (100 ㎖).
  2. 4 ° C에서 300 XG에서 10 분 동안 96 웰 플레이트를 원심 분리기.
  3. 잘 싱크대에 웰 플레이트에서 액체를 쓸어 넘겨 각각의 상층 액을 분리합니다 (세포 펠렛은 잘 유지됩니다) 깨끗한 종이 타월에있는 플레이트에 뿌리며 마치. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하여이를 세포 씻어 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리 하였다. 별도의 표시가없는 한, 모든 세척이 방법을 수행합니다.
    참고 :이 고칠 PI 얼룩 방해로 PBS + 2 %를 사용하지 마십시오.
  4. 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 각 웰에 새로 제조 된 상업 얼룩 (예를 들어, 고칠 붉은 죽은 세포 얼룩) 100 ㎖를 추가합니다.
    1. PBS에서 1:10 희석 한 다음 DMSO의 반응성 염료 원액의 1:10 희석하여 얼룩을 확인합니다. 빛으로부터 보호 30 분 동안 4 ° C에서 접시를 품어.
  5. P를 원심 분리기후반 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안. 이 시점에서, 오프 조직 문화 후드 라이트와 함께 접시에 모든 작업을 수행합니다.
  6. 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 다음의 Fc 블록 용액 100 ㎖를 추가합니다. 된 Fc 블록 원액 1 희석 된 Fc 블록 솔루션을 확인하십시오 : PBS에서 100.
  7. 희석 된 항체를 PBS에 대해 표면의 오염 (예를 들어, 항 CD4 또는 CD8 항)를 사용하고, 각 웰에 100 ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 4 ℃에서 30 분 동안 96 웰 플레이트를 품어.
    참고 : 표면 얼룩 항체가 최적의 성능을 위해 역가해야합니다. 제조업체의 프로토콜 당 400 희석 : 200 또는 1 : 일반적으로 1을 사용합니다.

히스톤 H3 3. 세포 내 염색

  1. 표면 얼룩의 부화 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
  2. 마지막 세척 후, 각 웰에 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 96 웰 플레이트를 배양한다. dilut 4 % 파라 포름 알데히드를 확인PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드를 보내고. 이 신선합니다.
  3. PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
  4. 파마 / 차단 솔루션을 확인 (주 파마 솔루션은 PBS + 인 2 % + 0.02 % 트리톤 X-100, 저장 4 ° C에서) 100 ㎖ 주식 파마 액 당 정상 토끼 혈청 2 ㎖를 결합하여. 60 ㎖ / 샘플에 대한 충분합니다.
  5. 부드럽게 거품을 만드는 않도록주의하면서, 아래로 피펫 팅에 의해 잘 잘 각 샘플에 40 ml의 파마 / 블록을 추가하고 혼합한다. 어둠 속에서 45 분 동안 실온에서 접시를 품어. 단계 3.6 파마 / 벽돌 남은 저장합니다.
  6. 단계 3.5에 예약 파마 / 차단 솔루션에 형광 접합 히스톤 H3K4me1 항체를 희석하고 각 웰에이 희석의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다. 4 ℃에서 1 시간 동안 어둠 속에서 96 웰 플레이트를 품어.
    참고 : 제조업체의 지침에 따라 R-피코 에리 트린의 결합 키트를 사용하여 결합 H3K4me1 항체를 사용합니다.
  7. 두 번 PBS + 2 %의 세포를 씻으십시오.
  8. (200)에서 세포를 재현 탁PBS + 2 % μL 및 유동 세포 계측법 분석을위한 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 샘플은 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최적의 결과 두 가지 일 이내에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 단독 스테인드 샘플 보상 유세포 컨트롤로서 사용될 수있다.

Representative Results

C57B / 6 마​​우스에서 림프구 프로토콜에 따라 단일 세포 현탁액으로 처리하고 표준 혈구를 사용하여 계수 하였다. 세포를 2 × T 세포 배지에서 6 / ㎖ 15 ㎖의에 중으로 원추형 튜브에 시딩하고 방치하거나, ​​37 ℃에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체 (클론 4C11)로 자극했다 표준 조직 문화 인큐베이터. 죽은 세포를 염색 한 후 세포는 프로토콜에 따라 FITC-CD8 및 APC-CD4 항체를 사용하여 염색 표면했다. 히스톤 접근성 유동 세포 계측법 (그림 4)을 통해 분석 하였다. 두 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포, 평균 형광 강도 (MFI)를 축합 염색질 상태를 나타내는, 낮다. 세포를 항 CD3과 활성화되면 염색질이 decondensed 것을 나타내는 (p <0.001, 학생 t 검정) 상당히 MFI 증가 항체.

그림 1

젖 현미경 슬라이드를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 비장을 처리하기위한도 1 기법. (A) 비장 두 현미경 슬라이드의 표면에 대하여 가압 젖된다. (B) 슬라이드 비장의 유물이 흰색 때까지 100mm 페트리 접시에 앞뒤로 서로 해제 림프구에 대한 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2

비장 후에 남아 70mm 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 눌러 스토퍼 주사기를 사용하여도 2. (A) 펄프 나 레드 단일 세포 현탁액으로 처리되고 70mm 세포 여과기를 통과 s는. (B) 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 누르 사용된다. (C) 주사기를 사용한 후 거의 셀 스트레이너에 남아있는 빨간 펄프가 없어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3

적혈구도 3 ACK 용해. 용해 ACK로 종래 단일 마우스 비장으로부터 생성 단일 세포 현탁액 (A) 원심 분리. (B) 적혈구 ACK 용해 후, 세포 펠렛은 백색이어야한다.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4

도 4 프로토콜의 대표적인 결과. (A) 게이팅 방식은 CD4 + T 림프구에 염색질 상태를 분석하기 위해 사용했다. (BC) T 세포를 방치하거나 (삼중)에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체로 활성화 하였다. 세포는 CD4 + 세포 (B) 및 CD8 + 세포 (C) 내의 염색질 응축을 결정하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 H3K4me1 염색의 평균 형광 강도의 표준 편차 ± 수단이다. * P <0.001 (학생의 T- 테스트) 시간을 클릭하세요감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

표 1

표 1. 문제 해결 설명서 일반적인 문제와 가능한 해결책에 대한 빠른 참조.

Discussion

우리는 T 세포의 염색질 응축의 평가를 허용하는 프로토콜을 개발했다. 그것은 히스톤 H3 항체는 나이브 세포에서 용이하게 그 에피토프에 액세스 할 수없는 간단한 관찰에 의존하지만, T 세포가 활성화되면, 이러한 항체는 동일한 에피토프에 결합 할 수있다. 처리 군 사이의 MFI 히스톤 H3의 염색과 비교하여, 또는 축합 decondensation의 상대적인 정도를 결정할 수있다. 우리는 흉선 세포 발달 동안 및 T 세포 활성화 4 중 상대적 응축 상태를 결정하기 위해 이러한 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 decondensation 과정 (5)을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

이 프로토콜은 염색질 응축 상태를 검출하는 히스톤 H3 항체의 사용에 의존한다. T 세포 활성화 4 동안 히스톤 변형 전역 변화가 없기 때문에, 우리는 염색질을 평가 H3K4me1 항체를 사용할 수있다이 프로토콜의 상태. 우리는 수정되지 않은 히스톤 H3에 대해 제기 항체를 사용했다; 그러나, 생성 된 신호는 매우 약하다 전체였다. 수정되지 않은 히스톤 H3에 대한 항체는 웨스턴 블롯에서 더 잘 작동하는 동안 우리의 경험에 의하면, 수정 히스톤 H3에 대해 제기 항체는 면역에 더 잘 작동하고 세포 계측법 분석 흐름. 이는 우리가 시도되지 않은 것이 있지만, 다른 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하는 것이 가능하다는 것을 주목해야한다.

파마 / 벽돌과 히스톤 H3 항체 단계는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 사용 파마 / 블록 용액의 양은 스톡 파마 액 이루어질 때마다 최적화 될 필요가있다. 이것은 스톡 용액의 상이한 희석 성능을 비교함으로써 수행 될 수있다. 전형적인 실험은 3 시간 (그림 4)에 대해 활성화 된 것과 순진한 T 세포의 염색질 상태를 비교하는 과정이 수반됩니다. 하나는 위에 MFI에 가장 큰 변화를 생산 희석을 선택해야합니다시간 분석. 원액 첫번째 단계 3.5 파마 / 블록을 추가 단계 3.4 이후만큼 ml의 100 PBS + 2 %에서 세포를 재현 탁하고 의해 파마 / 블록 강도 저하 PBS + 2 %로 희석 할 수있다. 유사한 파일럿 실험은 형광 공액 히스톤 H3 항체의 항체의 새로운 배치가 표시 될 때마다 다른 희석액을 테스트하기 위해 사용되어야한다. 이러한 단계 (활성화 3 시간 이내, 예) 초기 T 세포 활성화에 축합 차이의 성공적인 검출에 특히 중요하다. 때때로, 히스톤 H3 항체로 염색하지 않습니다 때문에 투과성이 도착하지 않는 세포가있다. 이 파마 / 블록을 추가 할 때 세포가 잘 재현 탁하지 않은 경우 발생할 수 있습니다 또는 파마 / 벽돌이 지탱할 수없는 경우. 이 세포는 히스톤 H3 염색의 히스토그램을 시각화 할 때 축에 가압 이벤트로 나타납니다. 전체 MFI를 왜곡 할이 사건 이후,이 이벤트는 gatin에 의해 분석에서 생략 할 수있다G 히스톤 H3 양성 세포의 정규 분포. 추가 지원은 문제 해결 설명서 (표 1)에서 찾을 수 있습니다.

고칠 수 죽은 세포 얼룩의 포함은 분석에서 세포 생존 능력의 평가를 할 수 있습니다. 특정한 자극은 세포 사멸을 유도 할 수 있기 때문에, T 세포 활성화를 조작하는 경우에 절대적으로 중요하다. 이러한 경우, 히스톤 H3 항체 결과 오해로 이어지는 생균 다르게 사균에서 히스톤 결합 할 수있다.

이 프로토콜은 염색질 상태의 높은 처리량 분석을 가능하게, 96- 웰 플레이트 형식으로 사용하기 위해 설계된다. 6-8 주령 암컷 마우스에서 비장은 일반적 프로토콜을 사용 60-90000000 간 세포를 수득한다. 염색 프로토콜은 샘플 당 2 백만 세포를 필요로하기 때문에, 용이 한 단일 96- 웰 플레이트에 단일 비장 중으로 여러 처치 군과 시점을 분석 할 수있다. 그것은 P에있다샘플 당 더 적은 세포와 프로토콜을 erform; 그러나, 원심 분리 단계의 수와 각 단계에서 세포의 고유 손실, 훨씬하여 세포의 수를 낮추는 것이 바람직하지 않다. 우리는 성공적으로 샘플 당 1 백만 세포와 프로토콜을 완료했습니다.

우리는 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + 세포 독성 T 세포의 염색질 상태를 검사하기 위해 사용되는 프로토콜. 프로토콜은 표준 표면 얼룩을 포함하기 때문에 가능 이루어진다. 프로토콜 용이 인구 특정 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 다른 림프구 아 집단에서 염색질의 검사를 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜은 쉽게 관련 표면 마커를 인식하는 항체로 오랫동안 다른 세포 유형에 사용할 수 있고 적절한 고정 / 투과성으로 조건 알려져 있습니다 적용 할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 국립 보건 연구소 (5 P20 RR016461 8 P20 GM103499)에서 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (EPS-0903795). 퍼먼 대학의 연구 및 전문적인 성장과 퍼먼 이점 상에 의해 제공 또한 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture dish BD Biosciences 353003
Precleaned frosted microscope slides Fisher Scientific 12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip BD 309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube Corning 352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit Life Technologies L23102 Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block BD Biosciences 553142
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Normal rabbit serum Sigma-Aldrich R9133
Anti-H3K4me1 antibody Abcam ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit Abcam ab102919 Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used

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References

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