Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

kütle spektrometrisi (MS) büyük çoğunluğu, protein analiz yöntemleri, tipik olarak tripsin ile, saptama için enzimatik sindirim aşamasından önce dahil tabanlı. Bu adım, kütle spektrometrisi enstrümantasyon etkili tarama aralığı içinde MW <3.000-4.000 Da genellikle, küçük molekül ağırlıklı peptid üretimi için gereklidir. Geleneksel protokoller 37 ºC'de O / N enzimatik sindirim içerir. Son gelişmeler, tipik olarak, örneğin, mikrodalga ya da yüksek immobilize enzim ya da bir kaç dakika için proteolitik sindirimi için gerekli zamanı azaltmak tamamlayıcı fiziksel işlemler (bir dizi bir mikroreaktör kullanılmasını içeren, farklı stratejiler, gelişmesine yol açmıştır baskı). Bu çalışmada, bir proteinin hızlı bir enzimatik sindirim elde etmek için herhangi bir laboratuvar uygulanabilir basit ve maliyet-etkin bir yaklaşımı açıklar. Protein (veya protein karışımı) C18-bağlanmış ters fazlı yüksek perf üzerine emdirilirbir kılcal sütununda önceden sıvı kromatografisi (HPLC), silis parçacıkları sergilemiş ve sulu tampon içinde tripsin kısa bir süre için parçacıklar üzerinde demlenir. on-line MS algılanmasını sağlamak için triptik peptidler MS iyon kaynağı, doğrudan artan bir organik içeriğe sahip olan bir çözücü sistemi ile elüt edilmiştir. Bu yaklaşım, yüksek fiyatlı immobilize enzim parçacıklarının kullanımını önler ve işlemi tamamlamak için herhangi bir yardım gerektirmez. Protein sindirimi ve tam bir örnek analizleri sırasıyla ~ 30 dakika az 3 ~ daha dk gerçekleştirilebilir ve yapılabilir.

Introduction

saflaştırılmış proteinlerin belirlenmesi ve tanımlanması, genellikle MS teknikleri kullanılarak elde edilir. Protein bir enzimle sindirilir ve peptitler, basit bir infüzyon deney düzeneği kullanılarak MS ile analiz edilir. Proteolitik sindirim çoğu MS analiz yararlı kütle aralığında düşüş küçük peptid fragmanlarını üretmek için gerekli olan ve kolayca amino asit sekansı bilgi üretmek için düşük enerji çarpışma kaynaklı ayrışma yoluyla parçalanmış olabilir. izole edilmiş proteinler veya basit bir protein karışımları için, MS tespiti önce peptitlerin kromatografik ayrılması için başka bir ihtiyaç vardır. 25-50 peptidlerinin bir karışım, kolayca MS iyonu kaynağı, doğrudan bir şırınga pompası ile örnek infüzyonu ile analiz edilebilir.

kütle spektrometresi analizi yapmak ve kısa zaman çerçevesi içinde bir proteinin dizisini teyit edebilir. modern veri elde etme yöntemleri ile, bu işlem, ağ yapılabilirbirkaç dakika, hatta saniye ithin. Kısa bir süre ölçeğinde tüm süreci tamamlamada sınırlayıcı faktör proteolitik sindirim adımdır. Tipik haliyle, bu işlem birkaç saat süreyle gerçekleştirilir (veya O / N), çözelti içinde, 37 ° C 'de, alt-tabaka kullanılarak: (50-100) enzim oranı: 1 arasındadır. Tarif edilmiştir mikroakışkan reaktörler veya ticari olarak temin edilebilen kartuş formunda, dakika ya da saniye hareketsizleştirilmiş enzim mikroreaktörlerde enzimatik sindirim süresini azaltmak için. 1-6 Tipik olarak enzim kovalent, kovalent olmayan bir fiziksel / adsorpsiyon, kompleks immobilize edilir oluşumu ya da kapsülleme, enzimatik işlemin 3,6 geliştirilmiş verimlilik ile elde edilmiş olmaktadır geniş yüzey-hacim ve enzim için alt-tabaka-oranları. immobilize reaktör diğer avantajları, MS analizinde enzimden otolitik ve parazit azalır enzim stabilitesi ve tekrar kullanılabilirliği geliştirilmiş bulunmaktadır. yaklaşımlar, cam ile ya da polimerik mikrofabrike cihaz çeşitli tarif edilmiştirantikor-antijen etkileşimleri, manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş enzimleri kullanılarak, 7,8 9 titanyum-alümina sol-jel 10 ve nanozeolites, 11 içinde kapsüllenmiş ya da Ni-NTA veya His-Tag kompleks oluşumu yoluyla çekilen altın nano partiküler ağlarında yakalanmış. 6 Alternatif immobilize enzimler ile açık boru şeklindeki kılcal damarlar, hem de geliştirilmiştir. 12 Dahası, gelişmiş proteolitik bölünme 30-120 reaksiyon sürelerini azaltmak için kontrollü mikrodalga ışıması 13 veya basınç destekli veya basınç çevrim teknolojisi (PCT) kullanılarak ortaya konmuştur min. 14

İmmobilize enzim reaktörlerin birden avantajlarına rağmen, ticari kartuş maliyetleri yüksek olduğu, rutin kullanım için mikroakışkan cihazların kullanılabilirliği sınırlıdır ve ek araçları için ihtiyaç mikrodalga veya PCT teknolojileri sonuçlarının kullanılması. Bu çalışmanın amacı, circumve bir yöntem geliştirmektiBu dezavantajların NTS ve kolayca dakika içinde MS analizi için hazırlık proteinlerin enzimatik bölünme gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yaklaşımla araştırmacılar güçlendirmek için, her laboratuarda uygulanabilir. yaklaşım kılcal ya da mikroakışkan cihaz önceden yüklenmiş olan hidrofobik, C18 partiküllerin kullanımına dayanır ve fazla enzimin infüzyonu sırasında enzimatik sindirme ile ve ardından bu parçacıklar üzerindeki ilgili protein (ler) adsorpsiyonu dolgulu yatak ve yakalanan protein (ler). Bu yaklaşımda, alt-tabaka kovalent olmayan etkileşimlerle hareketsizleştirilen edilir ve enzim hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​fazla demlenir. proteolitik sindirim verimliliği, enzimatik işlem, daha az ve parçacıkların yüzeyinden uzaklıkları ve yayılma süreleri için protein açığa büyük bir tanecik yüzey alanı artmıştır kütle transferi, enzim etkinliğine etki eden herhangi bir kovalent bağlanması, yeteneği artar hızla değerlendirme,Farklı enzimler, disposability ve çoğullama e kombinasyonları süreci mikroakışkan biçimde yürütülür ise. Bu yaklaşım, standart proteinler ve ESI-MS tespiti önce proteolitik sindirimi için tripsin en yaygın olarak kullanılan enzim karışımı kullanımı ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tespiti için kullanılan kütle spektrometresi doğrusal bir tuzak dört kutuplu (LTQ) enstrüman oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kılcal mikroreaktör hazırlanması 1.

  1. 100 um iç çap (ID) 360 um dış çap (OD) 7-8 cm uzunluğunda kılcal ve cam kılcal bıçağıyla 3-5 cm 20 um çapa x 90 mm OD kılcal X ekseni; herhangi çıkıntılı çapaklar olmadan, hem kılcal ucu temiz, düz bir kesim var mikroskop altında doğrulayın.
  2. ~ 6 mm uzunluğunda, 100 um iç çap x 360 mm OD borunun bir ucuna 20 mikron iç çapa x 90 mm OD kılcal yerleştirin; ihtiyaç halinde, mikroskop altında bu işlemi dikkate alınmalıdır.
  3. Q-ucu sonu ile 90 mikron OD / 100 mikron ID kılcal damarların birleştiği etrafında tutkal E6000 küçük bir damlacık uygulayın ve oda sıcaklığında tutkal kür O / N izin verin.
  4. ~ 10-15 mm bir uzunluğa eklenir 20 um çapa x 90 mm OD kılcal kesme; Bu elektrosprey iyonizasyon yayıcı olacaktır.
  5. Önceden kesilmiş 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK ve 1/16 "OD PTFE küvetuzunluğunda 4-5 cm parçalar halinde ing; Bu bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için kılcal birlikleri kullanılan kollu olacak.
  6. Bir PEEK birliğe 100 mikron ID x 360 mm OD kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  7. Ekle / birliğin karşısında sonunda içine 5 cm uzunluğunda 1/16 "PTFE tüp ~ bir parça sıkın.
  8. önceden temizlenmiş / 2 ml bir cam şişe kurutuldu C18 (5 um) bir parçacık ~ 4 mg ağırlığında; , 0.5 ml izopropanol ilave şişeyi kapatın ve ultrasonikatör banyosunda bulamaç dağıtmak.
  9. , 250 ul şırınga yaklaşık 200 ul bulamaç ile çekilme PEEK birliği 1/16 "PTFE tüp şırınga iğne takın ve yavaş yavaş 100 mikron ID x 360 mikron OD kılcal içine bulamaç dağıtmak; olarak mikroskop altında gözlemlemek kılcal elde edilir 2-3 mm'lik ambalaj uzunluğu kadar parçacıklar ile doldurur, bu mikroreaktör olacaktır (Şekil 1), 20 μ.m kimliği kılcal bir Keystone etkisi ile mikroreaktör partikülleri tutar. 15
  10. H2O / CH3CN 50:50 h / h 50 ul çözeltisi ~ ile mikroreaktör yıkayın ve daha sonra H2O / CH3CN 98 50 ul çözeltisi ~ ile: 2 h / h.

Örnek Çözümleri 2. Hazırlık

Not: Organik çözücü ve asitler ve çözelti hazırlama kullanımı içeren İşlemler davlumbaz ifa edilecek olan vardır. gözlük, eldiven ve koruyucu giysiler giyin.

  1. CH3 OH ile yıkayın ve bir kaç küçük cam şişeler (4 mi) ve polipropilen tüpleri (15 mi) kuru.
  2. H2O / CH3CN içindeki bir çözeltisine, 10 ml hazırlama (98: 2 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 200 ul CH3CN ile 9.8 mL H2O karıştırarak; sonikasyon ile karıştırın.
  3. Oluşan bir çözeltiye 10 ml hazırlamak H2O / CH3CN (50:50 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 5 ml H2 karıştırılarak </ sub> O ile 5 ml CH3CN; sonikasyon ile karıştırın.
  4. H2O / CH3CN, 4 ml 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş sulu bir çözeltisi (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlanması: Bir 4 ml bir cam şişe içinde (98 2 h / h); sonikasyon ile karıştırın.
  5. 4 ml H2O / CH3CN (50:50 h / h) 'de 4 ml bir cam şişeye 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş, organik çözelti (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlamak; sonikasyon ile karıştırın.
  6. 16 mg NH4 HCO3 tartılır 4 ml bir cam şişe içinde, bir analitik mikro-dengesi ile; (: 2 h / h 98) çözeltisi ve sonikasyon ile dispers, 2 O / CH3CN H 4 ml Bu sulu tampon içinde NH4 HCO3 (pH ~ 7.8), 50 mM çözeltisi ile sonuçlanır.
  7. Standart proteinin 5 mg ağırlığında (örneğin, büyükbaş hayvan serum albümin, hemoglobin α / β, sitokrom c, karbonik anhidraz, α-2-HS-glikoprotein, vs.), bir 4 ml cam tüp içinde bir analitik mikro-dengesi ile; 4 mi DI wate eklemer ve sonikasyon ile dağıtmak; Bu, tipik olarak yüksek bir uM düzeyinde konsantrasyonu çözelti ile sonuçlanır.
  8. NH4 HCO3 (50 mM), sulu tampon, uygun hacimde yüksek uM düzeyinde konsantrasyonu çözeltisi ile seyreltilmesi ile 1 ml protein çözeltisi (1-2 uM) hazırlama; sonikasyon ile karıştırın.
  9. (50 mm) NH4 HCO3 170 ul sulu tampon 20 ug dizileme dereceli tripsin eritilerek tripsin çözeltisi (5 uM) hazırlama; sonikasyon ile dağılır.

3. Deneysel Kurulum

Not: LTQ-MS sistemi, çeşitli örnek giriş yaklaşımlara kütle spektrometresi arabirim sağlayan bir ev yapımı XYZ kademeli içeren değiştirilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır.

  1. PEEK sendikası kılcal mikroreaktör ayırın ve PEEK Tee bağlanın.
  2. PEEK Tee yan kolunda bir ~ 2 cm uzunluğunda Pt tel takın; Bir temin edilmesi için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsinizkaçak ücretsiz bağlantı ve Pt tel yalıtım.
  3. PEEK Tee karşı ucuna (~ 0.5 m uzunluğunda) Örnek transferi kılcal kanallardan 50 mikron çapa x 360 um OD geç; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  4. XYZ-sahnede PEEK Tee Güvenli ve uzak kütle spektrometresi giriş kılcal ESI yayıcı ~ 2 mm yerleştirin.
  5. kütle spektrometresi ESI güç kaynağı kaynağına Pt tel bağlayın.
  6. Paslanmaz çelik birliğe örnek transferi kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için 1/16 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  7. Paslanmaz çelik birliği karşı ucuna 4-5 cm uzunluğunda 1/16 "PTFE tüp bağlayın ve PTFE tüp 250 ul şırınga iğneyi; örneğin (pompa açmak ve istenilen değerde akış hızını ayarlamak, 2 ul / dakika).
  8. MS Enstrüman bir kontrol yazılım paketi içine girdi tandem MS veri toplama parametrelerianalizi yapmak için hazır kurulum için bir yöntem dosyası olarak kaydetmek d; LTQ-MS sistemi için, aşağıdaki veri bağımlı analiz parametreleri kullanabilirsiniz: dışlama kitle genişliği ile 180 saniye süreyle etkin dinamik dışlama 1,5 m / z ±; bir MS bir zoom ardından tarama ve MS ilk 5 en yoğun zirveleri üzerinde 2 tarama, 5 m / z ± tarama genişliği Büyütmek; çarpışma kaynaklı ayrışma izolasyon genişliği 3 m / z, normalize çarpışma enerjisi% 35, aktivasyon Q 0.25 ve aktivasyon zamanında 30 milisaniye olarak belirlenmiştir (CID) parametreleri.

4. mikroakışkan Kur

  1. Cam ya da polimerik substratlardan mikroakışkan cihazı hazırlanması; bir girişine bağlı 16-18 cihazının yerleştirimini Şekil 2A'da verilmiştir bir mikroreaktör oluşan (1) (0.13 mm genişlik x 2 mm uzunluk x 50 mm derinlik) (2 ), çıkışı (3) ve bir yan bağlantı noktası (4); Akışkan manipülasyonları için birbirine kanal ~ vardır110 mikron genişliğinde ve ~ 50 mikron derin; Çok kanallı yapı (5), oluşan ~ 1.5-2 mm derinlik x 10 mm genişlik x yerleştirilmiş 100 mikron uzunluğunda mikrokanallar 25 mikron dışında, mikroreaktör parçacıkları tutmak için bir filtre görevi görür.
  2. Veya sıvı teslim (Şekil 2B) için parçaları barındıran bir polimerik tavır oluşturulması yoluyla giriş delikleri için özel konnektörleri yapıştırma çip sıvı-teslim bağlantılarını etkinleştirin. 16
  3. Aşama 1.8 de tarif edildiği gibi C 18 partikülleri (5 um) bir bulamaç hazırlamak; çip yan bağlantı noktasına bağlı 1/16 "PTFE boru kullanarak bir şırınga ile mikroreaktör bulamaç sağlamak (4) 90 ° C sıcaklıktaki bir fırın içerisinde epoksi yapıştırıcı ve 1 saat için tedavi ile birlikte partikül yüklemeden sonra ağız yalıtım 16.
  4. kür O / N E6000 yapıştırıcı ile mühürlenir, izin, çıkış limanında bir kılcal (20 mikron ID x 90 mm OD x 10 mm uzunluk) yerleştirin; Bu (ESI yayıcı olur
  5. 50 mikron ID x 360 mikron OD bağlayın (~ 0.5 m uzunluğunda) yonga giriş portuna örnek transferi kılcal (2); 3.6-3.7 tarif edildiği gibi, bir 250 ul şırınga ve şırınga pompasına kılcal karşıt ucunu.
  6. Giriş portuna hemen önce numune transfer hattı üzerinde, bir hafif PEEK bağlantı parçası yerleştirin (2) ve T-şekilli yan koluna bir Pt tel takmak, 3.2 de tarif edildiği gibi; Bu ESI elektrot olacaktır.
  7. kütle spektrometresi giriş kılcal ~ 2 mm uzakta konumlandırılmış ESI yayıcı ile XYZ sahnede mikroakışkan cihaz Güvenli; 3.8 de tarif edildiği gibi analiz için MS hazırlar.

5. Numune Yükleme, MS Analizi için proteolitik sindirim ve Elüsyon

Tüm solüsyon / Örnek aktarım basamağı, bir şırınga pompası yardımıyla gerçekleştirilir ve ölü volum telafi etmek için, tamamlamak için bir kaç dakika daha izin vermelidir: Notve mikroreaktör transfer hatları ile ilişkili es; Gerekli zaman ilgili akış oranları bağlıdır.

  1. Mikroreaktör durulayın ve 2 O / CH3CN H sulu bir NH4 çözeltisi HCO3 (50 mM) infüzyonu ile analiz için hazırlayın: 5 dakika için 2 ul (98 2 h / h) / dk; 250 ul şırınga kullanın.
  2. 2 ul örnek çözeltisi infüzyonu ile mikroreaktör protein örneği (1 uM) yük / dakika, 5 dakika boyunca; 250 ul şırınga kullanın.
  3. 1-3 dakika / 2 ul dakika mikroreaktör üzerinde adsorbe protein üzerinde tripsin solüsyonu (5 mcM) demlenmeye.
  4. TFA asitleştirilmiş sulu bir çözelti ile mikroreaktör durulayarak proteolitik sindirim süreci söndürün (% 0.01 hacim / hacim) H2O / CH3CN (98: 2 h / h) 2 ul / dakika, 5 dakika boyunca, 250 ul şırınga kullanın.
  5. (Protein TFA bir asitleştirilmiş organik bir çözüm beslerken tarafından mikroreaktör gelen sindirmek akıtılarak% 0.01 başlath / h) H2O / CH3CN (50:50 h / h), 300 NL / dakika.
  6. MS veri toplama süreci ve ESI voltajı (~ 2.000 V) açın; Adım 3.8 sağlanan veri toplama parametreleri kullanılarak MS veri elde; Triptik peptidlerin elüsyonu izleyin.

6. Veri İşleme

  1. Ham MS veri formatı ile uyumlu bir arama motoru ile tandem MS verileri işlemek.
    1. bir organizmanın belirli minimal gereksiz protein veritabanı kullanılarak LTQ-MS ham dosyaları işlemek; , Arama motoru ham veri yüklemek, sırasıyla 2 ve 1 Da ebeveyn ve fragmanı iyon kütle toleransları ayarlayın ve en fazla iki arama çatışmaları cevapsız ile sadece tam triptik parçaları kullanmak; posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez; sırasıyla% 1 ve% 3, yüksek ve orta-güven yanlış keşif oranları (FDR) ayarlamak ve posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez.
  2. sadece yüksek güven seçmek için verileri filtrelemekpeptid veritabanındaki proteinlere maçları; Protein ve peptid düzeyi sonuçlarını değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proteolitik sindirim işleminin temsili bir sonuç, yukarıda tarif edilen mikroreaktörlerde (Şekil 1 ya da 2), Tablo 1 'de verilmektedir sahip bir protein karışımı, eşzamanlı olarak gerçekleştirilir. Tablo belirli bir protein tespit benzersiz peptid dizilerini ihtiva eder, çapraz korelasyon skoru (Xcorr) (yani, ilgili tandem kütle spektrumunda deneysel-to-teorik maçın kalitesini karakterize bir skor), cevapsız bölünmeler sayısını, peptid şarj durumunu (z) ve kütle / şarj ( protonlanmış peptidlerin m / z). protein düzeyinde, masa protein, protein skoru ve protein kapsamının UniProt protein kimliğini, açıklama (isim) sağlar. Proteolitik sindirim 90 sn için yapılan sonraki tüm proteinler, çoklu peptidler tarafından tanımlanabilir edildi.

için gereken süretüm peptitlerin elüsyonu 300 Nl / dak, nano-ESI uygun işlemle uyumlu bir akış oranında asitleştirilmiş, organik çözelti teslim transferi kılcal uzunluğuna bağımlıdır. In-kapiller sulu ve organik asitleştirildi çözeltilerinin karıştırılması bir kaç peptidlerin erken elüsyonu ile sonuçlanmıştır, fakat büyük bir çoğunluğu, sadece organik çözelti birkaç dakika boyunca yıkandı. Kılcal mikroreaktör oluşturulacak beş protein, çeşitli peptidler temsilcisinin eş elüsyon gösteren bir kitle spektrumu, Şekil 3 'de verilmektedir.

Kılcal mikroreaktör ve O / N sindirimi protokolleri kullanarak beş proteinlerinin proteolitik sindirimi yoluyla üretilen triptik peptidlerin Tablo 1. listesi. Sadece benzersiz diziler, en yüksek Xcorr ile gösterilir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Şekil 1
Şekil 1. Kılcal mikroreaktör. Mikroreaktör imalatı için (A) Deneysel kurulum. MS iyon kaynağı yerleştirilmiş (B) Kılcal mikroreaktör. Mikroreaktör C18-bağlı silika partikülleri ile elle yüklenen ve ESI-MS kaynağında uygun konumlandırma kolaylaştıran bir XYZ-sahnede yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Mikroakışkan mikroreaktör. (A) mikroakışkan reaktörün şematik diyagramı. Bir PEEK stand sabitlenmiş (B) mikroakışkan reaktör. mikroakışkan reaktörü,nd transfer hatları XYZ sahne ile MS kaynağında daha fazla konumlandırma için stand ev yapımı polimerik PEEK olarak tespit edilebilir bir cam substrat üretilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil mikroreaktör proteoliz tabi protein karışımından üretilen triptik peptidler içeren 3. Kütle spektrumu. En yoğun triptik peptit iyonları amino asit dizisi ve ilgili protein tanımlayıcı ile etiketlenir. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada tarif mikroreaktör sağlayan kolay uygulanması en az 30 dakika, MS analizi ve tanılanması için proteinlerin enzimatik sindirim yapmak için deney düzeneği. Geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu sistemin farklı avantajları, basitlik, hız, düşük reaktif tüketimi ve düşük maliyetleri içerir. Özel olarak, pahalı bir hareketsiz tripsin boncuk ve kartuş için bir ihtiyaç vardır. Kılcal mikroreaktör hazırlanması basit (Şekil 1A), ve genel olarak, bir kromatografi laboratuvarda bulunan standart kaynakları, birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ters fazlı C18 parçacıkları adsorbe proteinlerin veya peptidlerin tam olarak temizlenmesi için yüksek organik içeriği çözücü (CH3 CN veya CH3, OH) ile durulanır edilebilir ve mikroreaktör, kolay ve düşük maliyetli bir üretim süreci yeniden kullanılabilir iken tek kullanımlık uygulanabilme tek birimlerinin üretimi için davetations. Kılcal mikroreaktör Şekil 1B de gösterilen veya bir standart iyon kaynağı takılabilen gibi bir ev yapımı ESI kaynağı monte edilebilir. Örnek yakalama ve sindirim için partikül yatağı daha uzun olması gerekmez iken ~ 1-2 mm, MS ile optimum tespiti için yeterli malzeme yakalamak için yeterli, kılcal kendisi uzunluğu herhangi bir boyutuna sığacak şekilde ayarlanabilir iyon kaynağı.

Mikroakışkan cihazları imal etmek yeteneklere sahip laboratuvarlar, MS tespiti (Şekil 2B) arabirim kolaylaştırmak için bir stand içine güvenli olabilir basit bir tasarım (Şekil 2A) sağlanır. mikroreaktör ve transfer kanallarının boyutları, belirli bir uygulamanın gereksinimlerine göre ayarlanabilir ve cihazın tek veya birden fazla mesaj göndermiş biçime geliştirilebilir. en ticari kitle spektrometre için, ancak, iyon kaynağı th izin değişiklikler gerekirkaynak cihazın e yerleştirme. çip üretimi için photomask çizim AutoCAD yazılımı ile idam edildi ve photomask HTA photomask tarafından hazırlanmıştır. Mikroçip imalatı daha önce tarif edilen protokollere göre gerçekleştirildi: UV ışığı (360 nm), ışınlanmış fotorezist ve altta yatan krom tabaka uzaklaştırılmıştır, tampon maddesi ile kanalların ıslak kimyasal Çatlatma photomask, maruz kalma ile alt-tabakanın 17,18 hizalama oksit aşındırma kalan krom tabakanın uzaklaştırılması, erişim delikleri, temizleme sondajı, mikroçip yüzeyinin hidroliz (NH4OH + H2O 2) ve 550 ° C 'kademeli ısıtma ile kapak levhasına alt-tabakanın termal birleştirme. Hem alt tabaka ve kapak plakası numune için derin kanallar için bir sığ mikro-kanallı filtre elemanları (derin 1.5-2 mikron) diğer (~ 20-50 mikron) taşıma ve, kazınmış bulundu. 16

Yukarıda anlatılan mi ile oluşturulan sonuçlarcroreactor alt-tabakanın kullanımı O / N 19, geleneksel sindirim protokolleri elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir H içinde çözülmüş bir peptit infüzyon MS tespiti ile deneyde (300 NL / dak, peptitler, ardından 1: (50-100) enzim oranlarının 2 O / CH3CN (50:50 h / h) CH3 COOH ile asitleştirildi,% 0.1 h / h). Mikroreaktör ve geleneksel protokoller Hem birden fazla eşsiz peptidler (Tablo 1) bütün proteinlerin tanımlanmasını sağladı. Tipik olarak, protein başına benzersiz peptitler biraz daha çok sayıda geleneksel kurulum ile daha mikroreaktör ile gözlemlenebilir idi. Bu durum, belirli bölgelerde yetersiz enzimatik yarılma bir sonucudur. proteolitik sindirim birkaç ek dakika azaltılmış ya da bu sonucu ortadan kaldırmıştır. Ayrıca, mikroreaktör ile oluşturulan bazı enzimatik peptidler nedeniyle C18 parçacıklar farklı sitelerde adsorbe proteinler için enzim t maruz kaldıklarını gerçeği, çözelti içinde oluşturulan olanlardan farklıydıHomojen çözümler han. 20 Xcorr puanları mikroreaktör ile oluşturulan tandem kütle spektrumlarının kalitesi yüksek kaliteli olduğunu, ancak, göstermek ve yeterli protein dizisi kapsama (11-75%) kesin protein kimlikleri için ulaşılabilir olduğunu .

teknik, tarif edildiği gibi, basit bir infüzyon deney ile analiz edilebilir ve bu, MS analizi öncesinde sıvı kromatografik ayırma gerektirmeyen ~ en 25-50 peptit de elde oldukça basit protein karışımları analizi ile sınırlıdır. Başarısı için kritik azaltmak ya da mikroreaktör işletme pH değerinde proteolitik enzim aktivitesi kaybetmemek için, taze çözülmüş ve hazır tripsin çözeltilerinin kullanımı (örneğin, pH-8). Buna ek olarak, uygun bir denge elektrosprey iyonizasyon için optimum akış hızları (150-300 nl / dk) ve deney düzeneği tarafından tolere ve etkinleştirmek olabilir maksimal akım oranları arasında bulunması gerekenmikroreaktör (2-3 ul / dakika) hızlı peptit elüsyon. Optimal ESI akış oranlarından daha yüksek hassasiyet kayıpları ve kötü algılama sınırları içinde sonuçlanır. Bunun bir sonucu olarak, transfer kılcal uzunluğu ≤300 nl / dakika çalışırken mikroreaktör Peptidlerin elüsyonu için gerekli süreyi azaltmak için mümkün olduğu kadar kısa tutulmalıdır. deney düzeneği için kullanılan tüm bileşenler benzer fonksiyonları yerine diğer üreticilerin bileşenleri ile ikame edilmiş olabilir. Bu bileşenlerin boyutsal özellikleri, belirli adımları gerçekleştirmek için olan ve ESI voltajı (uzunluk, çap, hacim), yıkama sıvısı akış oranlarının optimizasyonu, örnek konsantrasyonu, zaman farklı, benzer sonuçlar elde etmek için gerekli olabilir.

Mikroakışkan kurulumu tarafından etkin bir benzersiz bir avantaj stand-al etkinleştirmek için daha çip üzerinde, örneğin bir pompalama sistemi, birleştirmek için yeteneği, bir Elektroosmatik akım tahrik edilen pompa, 21,22 olduğunuBir platformun çalışma ve ek bir ayırma aşamasına entegrasyonu. yetenek gelişmiş algılama sınırları neden olacaktır proteolitik sindirim yoluyla oluşturulan peptidlerin on-chip ayırımları yapmak için, ve hücresel özler kompleks protein karışımları analizini kolaylaştıracaktır. Bu da microfabricated platformları ve biyomedikal uygulamalar için yüksek hızlı MS tespiti faydalanmak iş akışlarında tekniğinin entegrasyonu sağlayacak. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion trap ESI-MS Thermo Electron LTQ The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage Newport Multiple parts The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope Edmund optics G81-278 The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler VWR 46600-204 The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson VWR 33995-540 The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22 Harvard Apparatus 552222 The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system EMD Millipore ZD5311595  The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) VWR 53513-410 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl) VWR 53513-406 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl) VWR 53513-402 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP100375 This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) Polymicro Technologies TSP020090 This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP050375 This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver Supelco 23740-U This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue Eclectic Products E6000 Craft This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue Epo-Tek 353NDT This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm) Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18 These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl) Hamilton 81130-1725RN The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) Valco ZRU1.5FPK This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”) Valco ZU1XC The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) Valco MT.5XCPK The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight) Valco C-NTXFPK This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm) VWR 66260-126 The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD) Valco TTF115-10FT The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union 
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) Upchurch Scientific 1565 The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) Valco TPK.515-25 The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter Valco JR-797 This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml) Agilent  HP-5183-2069 The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry 
Amber vial (4 ml) VWR 66011-948 The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml) Fisher 12-565-286D The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml) VWR 24710-463 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml) VWR 24710-441 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl) VWR 83007-386 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl) VWR 53503-781 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl) VWR 53511-681 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates Nanofilm B270 white crown, 3” x 3” These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”) Upchurch P203X This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly Upchurch N-122H This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards Sigma Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade Fisher A955
Methanol, HPLC grade Fisher A452
Isopropanol, HPLC grade Sigma 650447
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
Ammonium bicarbonate Aldrich A6141
Trypsin, sequencing grade Promega V5111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86, (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390, (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4, (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3, (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7, (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30, (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6, (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3, (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80, (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3, (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11, (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438, (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13, (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64, (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66, (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78, (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74, (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71, (13), 2578-2581 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics