Imaging membranpotential med två typer av genetiskt kodade fluorescerande Spänningssensorer

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Den centrala uppgiften i denna uppsats är att visa optisk avbildning av förändringar i membranpotentialer in vitro med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Imaging förändringar i membranpotential erbjuder spännande möjligheter att studera aktiviteten hos neuronala kretsar. När förändringar i membranpotential resulterar i en fluorescensintensitet förändring, varje pixel i kameran blir ett surrogat elektrod möjliggör nonintrusive mätningar av nervaktivitet. För över fyrtio år, har organiska spänningskänsliga färgämnen varit till nytta för att observera förändringar i membranpotential 1-4. Men dessa färgämnen saknar cellulär specificitet. Dessutom är vissa celltyper är svåra att färga. Genetiskt kodade spänningsindikatorer (GEVIs) övervinna dessa begränsningar genom att ha de celler som skall studeras specifikt uttrycka det fluorescerande spänningskänsliga sonden.

Det finns tre klasser av GEVIs. Den första klassen av GEVI använder voltage Kännande domän från den spänningskännande fosfatas med antingen en enda fluorescerande protein (FP) 5-9 eller ett Förster resonansenergiöverföring (FRET) -par 10-12. Den andra klassen av sensorer använder mikrobiell rhodopsin som en fluorescerande indikator direkt 13-15 eller via elektro FRET 16,17. Den tredje klassen utnyttjar två komponenter, den genetiska komponenten är ett membran förankrad FP och en andra komponent som är en membranbundna härd färgämne 18-20. Medan de andra och tredje klasserna är användbara för in vitro och skiva experiment 19,20, bara den första klassen av sensorer finns för närvarande användbara för in vivo-analyser 6.

I denna rapport kommer vi att visa avbildning av membranpotentialen med hjälp av den första klassen av GEVIs (Figur 1) in vitro. Denna första klass av spänningssensorer är det enklaste att övergången till in vivo imaging. Eftersom GEVIs utilizing en spänningskännande domän fusionerad till en FP är ca 50-faldigt ljusare än rhodopsin klass av sensorer, de kan avbildas med båglampa belysning snarare än att kräva en extremt kraftfull laser. En annan konsekvens av skillnaden i ljusstyrka är att den första klassen av GEVIs lätt kan överstiga auto-fluorescens av hjärnan. De rhodopsin-baserade prober kan inte. Den tredje klassen av sensor är lika ljus som den första klassen, men kräver tillsats av en kemisk quencher som är svår att administrera in vivo.

Vi kommer därför att visa att förvärvet av en sond med en enda FP (Bongwoori) 8 och en sond bestående av ett FRET par (Nabi 2) 12. FRET-konstruktioner i denna rapport är fjärils versioner av VSFP-CR (spänningskänsliga fluorescerande proteiner - Clover-mRuby2) 11 bestående av ett grönt fluorescerande givare, klöver, och en röd fluorescerande acceptor, mRuby2, som heter Nabi 2,242 och Nabi 2,244

Figur 1
Figur 1. Två typer av genetiskt kodade spänningsindikatorer (GEVIs) avbildas i denna rapport (A) En mono FP baserad GEVI har en transmembranspänningskännande domän och ett fluorescerande protein. (B) En FRET baserad GEVI består av en transmembranspänningskännande domän, en FRET donator och acceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: djurförsök Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid KIST djur protokoll 2014-001.

1. Utrustning Setup

  1. imaging inställnings
    1. Placera ett inverterat fluorescensmikroskop på en vibrationsisolering bord. Använd en hög förstoring (60X oljeimmersion objektiv med 1,35 numerisk bländare) objektiv och ett filter kub utrustad med en dikroisk spegel och filter som lämpar sig för de fluorescerande proteiner som används för spännings avbildning.
      OBS: Denna inställning använder ett inverterat mikroskop för att anställa mål med högre NA, men upprätt mikroskop kan också användas. I själva verket är den inverterat mikroskop endast för sond utveckling sedan högre numerisk apertur (NA) objektivlins samlar mer ljus än det en med en låg NA därigenom förbättra signal-brusförhållandet (SNR; kan beskrivas som topp optiska signalen dividerad med standardavvikelse av baslinjenfluorescens) av inspelningen. För icke-utvecklare, rekommenderar vi en upprätt mikroskop för applikationer såsom skiva eller in vivo inspelningar.
    2. Förbereda en ljuskälla, t ex., Xenon båglampa, utrustad med en mekanisk slutare för effektiv epifluorescens brett fält avbildning. Rikta ljuset till mikroskopet via en ljusledare mount. Ljuset kommer att passera genom exciteringsfiltret och reflekteras av den första dikroiska spegeln i filterkuben. Rikta in ljus för att belysa provet jämnt med maximerad ljusintensiteten över synfältet 21.
      Obs: Traditionellt har en 75 watts båglampa används eftersom högre wattal glödlampor skapa större men inte ljusare belysning fält. Lasrar kan användas, men är begränsade till en enda våglängd. Lysdioder blir ljusare och kan visserligen vara ljuskällan om val som erbjuder multipla våglängder och som inte kräver en mekanisk slutare.
    3. Montera de två CCD-kameror till fluorescerrens mikroskop såsom visas i figur 2D.
      Obs: Den första CCD-kameran har hög spatial upplösning och används för identifiering av en cell som uttrycker GEVI i plasmamembranet som skall testas. För avbildning förändringar i membranpotential, se till att den andra CCD-kameran har en hög bildhastighet, såsom 1000 bilder per sekund (fps). Använd en dubbelportskameraadapter (Figur 2D- (3)) för att växla bildvägen mellan de två CCD-kamerorna. Med den här inställningen är en demagnifier används för att passa bilden från objektivet på CCD-chipet i den andra CCD-kamera.
    4. Installera en bild splitter mellan den första (långsam) och andra (snabb) CCD-kameror för avbildning av FRET baserad GEVI. Sätt ett filter kub med en dikroisk spegel (560 nm) och två emissionsfilter (520 nm / 40 och 645 nm / 75) i bilden splitter. Detta kommer att resultera i två synfält, en för givaren fluorescens och den andra representerar acceptor fluorescensen. Ta bort det här ärecond filter kub när avbildning en GEVI med en enda FP.
      Obs! Enda FP baserad GEVI testas i denna metod är Bongwoori som använder FP, super ekliptikan pHluorin A227D (SE A227D). Den excitationsfilter (472 nm / 30), emissionsfilter (497 nm / lång passning) och den dikroiska spegeln (495 nm) valdes baserat på dess excitation och emissionsspektra 5. Allmänt bör de excitations- och emissionsfilter ha den största överlappningen med varje spektrum av fluoroforen för att förvärva en ljus bild, medan den dikroiska spegeln blockerar all excitationsljus som transmitteras genom emissionsfilter. Valet av filter och dikroiska speglar för FRET par 11 baserat GEVI inspelning följer samma princip, förutom att det kräver ett andra filter kub i bilden splitter för samtidig observation av givare och mottagare fluorescens. Den första filter kub placeras i mikroskop filterrutan måste ha ett excitationsfilter (475 nm / 23) för Clover. Då den emitterade fluorescence från båda ramprogrammen kommer att överföras till det andra filtret kuben genom den första dikroiska spegeln (495 nm). Den andra filter kub har en dikroisk spegel (560 nm) och två emissionsfilter (520 nm / 40 för Clover och 645 nm / 75 för mRuby2) för varje FP därmed separera fluorescens från två olika ramprogram.
Enda FP baserat GEVI
(Bongwoori)
FRET par baserad GEVI
(Nabi 2,42 & Nabi 2,44)
Första filter kub placeras i mikroskopet excitationsfilter 472 nm / 30 475 nm / 23
dikroisk spegel 495 nm 495 nm
emissionsfilter 497 nm / lång passning -
Andra filter kub placeras i stråldelaren dikroisk spegel -
emissionsfilter 1 - 520 nm / 40
emissionsfilter 2 - 645 nm / 75

Tabell 1. Två olika filteruppsättningar som används för en enda FP Baserat GEVI och en FRET baserade GEVI Recordings

  1. vibrationsisolering
    1. Montera inte någon utrustning med rörliga komponenter på vibrationsisolering bord. Säkerställa att kablarna som är anslutna till icke-isolerad utrustning är lösa för att undvika vibrationer av provet.
  2. Patch clamp kammare
    1. Försegla botten av patch clamp-kammare med en tunn # 0 täckglas eftersom arbetsavståndet av målet är relativt liten. Detta är en nackdel med den inverterat mikroskop setup.
      Notera: Som en kompromiss av att ha en hög NA objektivlins, minskar arbetsavståndet. För att placera den specimsv inom mycket kort arbetsavstånd, täckglas och täckglas (steg 2) måste vara så tunn som möjligt.
  3. Temperaturkontroll
    1. Se till att badet lösning strömmar genom en temperaturregulator för att hålla de lappade-cellerna runt 33 ° C under hela experimentet.
  4. utrustning anslutningar
    1. Ansluta patch clamp-förstärkare och den mekaniska slutaren av ljuskällan till kommandot Bajonett Neill-Concelman (BNC) låda av den höga hastigheten CCD-kamera. Detta gör det möjligt för bildbehandlingsprogram för att styra förstärkaren, kamera och ljuskällan samtidigt.
      Obs: De elektriska och avbildningskomponenter måste synkroniseras för att ge samtidiga elektriska och optiska inspelningar av elektrisk aktivitet.

Figur 2
Figur 2. utrustningnings Setup för spänning Imaging med GEVIs Arbetsflödet följer ljusstrålen, (A) 75W Xenon båglampa, (B) excitationsljuset från båglampa filtreras genom excitationsfilter och sedan reflekteras av den första dikroiska spegeln innan det når provet scenen, en infälld i det övre högra hörnet visar hela cell konfiguration, (C) den långsamma hastigheten CCD-kameran används för att underlätta både val av en cell och patch clamp, (D) bildförvärvsdelen; (1) den höga hastigheten CCD-kamera, (2) bild splitter för både FRET koppla ihop och mono FP GEVIs, (3) den demagnifier att anpassa bilden på CCD chip i hög hastighet CCD-kamera, (4) den dubbel port kameraadapter för att växla bildvägen och (5) den långsamma hastigheten CCD-kamera med hög spatial upplösning för identifiering av den cell till plåster, (E & F) bilden förvärvet med en enda-FP baserade GEVI (E) och en FRET-baserad GEVI(F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Redovisning av GEVIs

  1. I humana embryonala njur-293-celler
    1. Kultur humana embryonala njur 293 (HEK 293) celler med Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C i en CO2-inkubator (5% CO2). Använda en vävnadsodlingsskål med 100 mm diameter och 20 mm höjd. Starta kulturen med 2 x 03-6 Oktober x 10 3 celler / cm 2 och inkubera tills de når 80-90% konfluens för efterföljande transfektion.
    2. På dagen för transfektion, aspirera cellmedier och försiktigt tvätta en gång med Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning. Dispergera HEK 293-celler med 0,25% trypsin-EDTA-lösning för 1-2 min, aspirera lösningen och knacka försiktigt på sidan av skålen för att lösgöra calnar. Lägg färsk DMEM (10% FBS) och dissociera hopklumpade cellerna genom pipettering. Bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer.
    3. Placera 0,08 - 0,13 mm tjock, täckglas 10 mm diameter förbelagda med poly-L-lysin i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Ympa HEK 293-celler på täckglas med 1 x 10 5 celler / cm 2 celltäthet.
      Observera: Eftersom HEK 293-celler är i stånd att bilda kanalförbindelser med varandra, behöver fröet nummer för att ge isolerade celler.
    4. Transient transfektera cellerna med en lämplig genkonstruktion som kodar för en GEVI genom användning av ett lipofektionsreagens att följa tillverkarens instruktion.
      Obs! Genkonstruktioner som används för detta steg utnyttjade pcDNA3.1 (Bongwoori) och pUB2.1 (Nabi 2,242) som vektorer ryggraden. Mängden DNA som användes var 100 ng för varje täck; emellertid transfektion villkor måste bestämmas empiriskt för varje GEVI som skall testas.
  2. I dissocierade mus höftpocampal primära neuroner
    1. Dissekera hippocampi från embryonala dag 17 C57BL6 / N-möss och sedan dissociera hippocampus nervceller som tidigare beskrivits 22,23.
    2. Plattan de dissocierade neuronerna på poly-D-lysin belagda 0.08-0.13 mm tjock, 10 täckglas mm diameter på 1 x 10 5 celler / ml celltäthet. Inkubera cellerna vid 37 ° C i CO2 inkubator (5% CO2).
    3. Transfektera dissocierade nervceller övergående vid 6 - 7 dagar in vitro (DIV) med en genkonstruktion som kodar för ett GEVI med hjälp av en kalciumfosfat transfektion reagens som tidigare beskrivits 24.
      Obs! Genkonstruktioner som används för detta steg utnyttjade pcDNA3.1 (Bongwoori) och pUB2.1 (Nabi 2,244) som vektorer ryggraden. Mängden DNA som användes var 1 | ig för varje täckglas. Återigen, transfektion villkor måste bestämmas empiriskt för varje testad GEVI.
  3. Kontrollera uttrycksnivån före spänning IMAging
    1. Ta vävnadsodlingsplatta från CO2 inkubator och observera fluorescensen från de transfekterade cellerna under ett epifluorescensmikroskop.
    2. Efter att ha bekräftat fluorescens från membranet, överföra täck till lapp kammaren för spänningen avbildning i avsnitt tre.
      Notera: Spänningen avbildning genomföres 16-24 h efter transfektion. Eftersom olika fluorescerande proteiner har olika mognadstider, vissa GEVIs behöver mer tid i efter transfektion. Exempelvis kan de FRET paren innehållande mRuby2 i detta protokoll ta längre tid för att uttrycka eftersom mognaden av mRuby2 tar betydligt längre tid än Clover 11. bör kontrolleras fluorescens både givare och mottagare.

3. Spännings Imaging protokoll

  1. Välj en frisk cell med god membran uttryck
    1. Med hjälp av mikroskopi, hitta en frisk cell (Figur 4B) som visar starkmembran lokaliserad fluorescens jämfört med intern fluorescens. Försök att inte lappa rundade celler. Cirkulära celler antingen dela eller döende och är svåra att lappa. Applicera en testpuls av 5,0 mV i amplitud och 5,0 ms varaktighet för att underlätta efterföljande patch clamp-experiment.
  2. Förbered cellen för spännings imaging
    1. Efter att ha valt en cell till lapp, placera plåstret kläm pipetten ovanför cellen. Ta pipetten tills den vidrör cellmembranet. I detta steg, observera en MQ - 2 MQ stigande membran motstånd patch clamp programvara 25.
      OBS: Ibland kan en bra giga-ohm tätning ske helt enkelt genom att trycka på cellmembranet. Så länge som giga-ohm tätning är stabil, bör det vara OK.
    2. Upprätta en giga-ohm tätning genom att försiktigt applicera negativt tryck genom pipetten. Ställa pipetten potentialen vid en önskad hållpotential.
    3. Under bibehållande av giga-ohm tätning, bild the cell med hög hastighet CCD-kameran och fokusera den till membranytan.
    4. Spräcka cellmembranet genom att applicera pulser av sug genom munnen eller sprutan försiktigt för att göra en hel cellkonfiguration 26.
    5. Bild plåstret fastklämd cell under en hel cell klämkonfiguration enligt den experimentella designen med hjälp av en programvara för bildbehandling
      1. Starta bildprogram. Klicka på [FÅ FRAM] - [SciMeasure Camera] menyn för att öppna upp "CCD FÅ FRAM sidan.
      2. Skapa en ny datafil för att spara bilderna.
      3. Klicka på [ANALOG OUTPUT] och sedan [Läs en ASCII] för att öppna upp en pulsprotokoll fil för att genomföra bild. Klicka på "genomsnittliga interna repetitioner" om data behöver medelvärde. Stäng sedan "ANALOG OUTPUT sidan.
        Obs: Denna puls protokoll måste utformas och sparas som en ".txt" fil enligt syftet med varje experiment före detta steg.
      4. Ställ specifika regelverkition parametrar från "CCD FÅ FRAM sidan. Mata in specifika värden för "Antal ramar för förvärv" och "Antal försök".
        Obs: Antalet ramar bestäms av hastigheten av förvärv och tidpunkten för pulsprotokollet. Till exempel, om avbildning vid 1 kHz, 1000 ramar motsvarar en sekund av inspelningstid.
      5. Klicka på [TA DATA (Optik + BNC)] för att starta inspelningen. Medan spänningen avbildning äger rum, titta på oscilloskopet fönstret från patch clamp-programvara för att säkerställa stabil helcells-konfiguration i hela inspelningen.
        Obs: För att testa GEVI responsiva spänningsområde, signalstorlek i AF / F värde eller temporal upplösning under fysiologiska spänningsområdet, genomföra en hel cellspänning klämma experiment med en pulsprotokoll med stegade spänningspulser som sträcker sig från -170 mV till 130 mV. För att bestämma GEVI prestanda lösa aktionspotentialer framkallade från odlade primary neuroner, bild cellen under en hel cell strömtång konfiguration.

4. Data Acquisition

  1. Beräkning av AF / F
    1. Starta bildprogram. Klicka på [FIL] - [Läs datafil] för att öppna upp en datafil som skall analyseras. Observera cell bilden i dess Resting ljusintensitet (RLI) på den högra sidan
      Obs: genomsnitt programmet första 5 ramar för att bestämma RLI av inspelningen.
    2. Klicka på "Visa BNCs" att föra ström- och spänningsvärden som uppmätts på skärmen.
    3. Ändra sidan läge från "RLI ram" till "Frame subtraktion" att utnyttja ramen subtraktion funktionen för att identifiera pixlar med responsiva optiska signaler. Detta är den verkliga kraften i bildbehandling sedan kan undersökas varje pixel för eventuella förändringar i fluorescens.
    4. Välja två tidpunkter (F 0 och F 1) för subtraktion. Identifiera vilket område av cellen ärvisar signaler som svar på membranpotential förändring.
      Obs: SNR för ram subtraktion bilder kan förbättras genom att välja flera ramar för varje tidpunkt att temporärt genomsnitt signalen. Programmet subtraherar den genomsnittliga ljusintensiteten som tas från utvalda ramar och beräknar F 1 -F 0 värden (Af). Vanligtvis man väljer en tidpunkt förvärvades i hållpotential och en annan tidpunkt tas under stimuleringsperioden.
    5. Utse de pixlar som behöver analyseras genom att dra eller klicka på varje pixel med datormusen. Observera den grafiska representationen av den genomsnittliga fluorescensintensiteten från de utvalda pixlarna på vänster sida av fönstret programvara. Figurer 4B och 5B visar representativa bilder ram subtraktion analysen.
    6. Fördela de subtraherade pixlar med RLI (F 0). Klicka på [Dividera med RLIs] att förvärva AF / F-värden
  2. exportera data Beräkna AF / F-värden för varje spänningssteg för att ytterligare analysera GEVI spänning avkänning egenskaper. Använd dessa värden för att rita grafer som AF / F kontra spänning för efterföljande dataanalyser.
  3. Ta bort ström- och spänningsdiagram genom unclicking "Visa BNCs meny. Gå till [OUTPUT] - [Save Spår som det visas (ASCII)] för att exportera fluorescens spår i en ASCII-filformat för kurvanpassning analys av standard grafiska program.

5. Dataanalys

  1. Spänningsavkänning egenskap hos GEVI
    1. Rita fluorescensförändring mot spänningskurvan (FV) genom att plotta AF / F-värden jämfört med spänningen i en dataanalys program. Montera kurvan till en Boltzmann funktion (tabell 2) för att bestämma spänningsområdet hos den optiska signalen genom att klicka på [Analys] - [Montering] - [sigmoidal fit] - [dialogrutan Öppna], och välj sedan Boltzmann funktion.
      Obs: Montering till en funktion som gör det possible att karakterisera spänningskännande egenskaperna hos olika spänningssonder eller för att jämföra sina prestationer i olika celler. Boltzmann funktionen kan användas för de testade i detta dokument sonder eftersom FV kurvorna från dessa prober visar sigmoidal mönster.
    2. Normalisera varje AF / F-värdet genom att använda de initiala och slutliga värden (A 1 och A 2) beräknas av funktionen.
      Obs: I Boltzmannekvationen, är det minsta A 1 och högst A2. För normalisering, använder ett kalkylprogram programvara för att justera AF / F-värden genom att definiera en en som noll och A 2 som en. Genomsnitt de normaliserade AF / F-värden och beräkna standardavvikelsen för statistisk analys.
    3. Replot den normaliserade AF / F-värden kontra spänning som tidigare beskrivits i avsnitt 5.1.1).
  2. Hastigheten på det optiska svaret
    1. Öppna ASCII-filen förvärvats från steg 4.2.2) med en dataanalysprogram och rita AF / F spår i förhållande till tiden.
    2. Klicka på "Data väljaren 'i dataanalysprogrammet och väljer en tidpunkt som motsvarar början av en stegad spänningspuls och en andra tidpunkt då den optiska signalen har nått stationärt tillstånd. Montera detta område både en enkel och dubbel exponentiell sönderfall funktion genom att klicka på [Analys] - [Montering] - [exponentiell anpassning] - [dialogrutan Öppna], och välj en exponentiell sönderfallsfunktion. Rapportera bättre passform.
      Obs: Genom att montera de enkel- eller dubbel exponentiellt avtagande funktioner, kan de kvantifierade tidskonstanterna representeras av τ förvärvas. Detta kommer att hjälpa praktiker jämföra kinetiken av sina mätningar gjorda med olika spänningsindikatorer. Fluorescens spår kan visa snabba och långsamma komponenter som kan beskrivas med en dubbel exponentiell sönderfallsfunktion. I detta fall kommer beräkningen att resultera i två tidskonstanter med olika amplituder.
    3. beräkna the vägda x konstanter för att jämföra kinetiken hos prober som uppvisar två tidsmässiga komponenter till prober med en enda komponent.
      Obs: Ett vägt tau beräknas som summan av τ 1 multiplicerad med den relativa amplituden, A 1, plus τ 2 multiplicerat med den relativa amplituden, A 2, såsom den definieras av följande formel; ekvation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transient transfekterade celler kan uppvisa betydande variation i fluorescensintensitet och den grad av plasmamembranuttryck. Även på samma täck vissa celler kommer att ha olika nivåer av intern fluorescens. Detta är troligen på grund av att mängden av transfektion medlet absorberas av cellen. Ibland orsakar alltför mycket uttryck i cellen för att uppleva den ovikta proteinsvar som resulterar i apoptos 27 (ljus, rundade celler med hög intern fluorescens). Försöksledaren är därför varnas för att testa båda ljusa celler och dim celler med så lite inre fluorescens som möjligt, eftersom den interna uttryck skapar en icke-responsiv fluorescens som sänker signalbrusförhållandet (SNR).

Ett annat övervägande är mognadshastigheten för kromoforer. Figur 3 visar skillnaden i fluorescens av acceptormolekylen chromophmalm (mRuby2) som har en längre mognadstid än donatorkromoforen (klöver).

Figur 3
Figur 3. Konfokala bilder från HEK 293-celler transfekterades transient med en FRET Based GEVI, Nabi2.242. (A) Confocal bilder av en HEK-cell som visar membran lokaliserad fluorescensen från FRET donator och acceptor, (B) Confocal bilder som visar en potentiell konsekvens av långsam mognad av mRuby2. Alla fyra celler uppvisar Clover fluorescens medan endast två uppvisar mRuby2 fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bilderna förvärvades av en konfokalmikroskop. För FRET donator, Clover, var 488 nm laser som används för excitering och emission captkonfiguerad med 525/50 nm bandpassfilter. FRET acceptor, mRuby2, belystes med 561 nm laser för excitation och 595/50 nm bandpassfilter användes för utsläpp. Proverna för konfokal avbildning fixerades med 4% paraformaldehyd / sackaroslösning i fosfatbuffrad saltlösning justerad vid pH 7,4 och monterades sedan med en anti-fade reagens.

När väl transfektion betingelser är optimerade, kommer nästa källa till variation från bestämning av regionen av intresse som skall analyseras. Använda ram subtraktion för att identifiera de regioner i cellen med den högsta fluorescensförändring används ofta för att maximera AF / F-värdet. Ett alternativ är att markera alla pixlar som får ljus från cellen. Detta ökar antalet pixlar som resulterar i en minskning av buller, men minskar signalstorleken eftersom icke-responsiva intern fluorescens ingår. Båda metoderna är bra så länge försöks förblir konsekvent.

Figur 4A visar fluorescensförändringen hos en HEK-cell som uttrycker en enda-FP baserade GEVI, Bongwoori. Detta är en typisk fluorescensförändring som svar på stegade spänningspulser. Från dessa data kan man rita spänningskänsligheten hos GEVI och bestämma på och av t konstanter vid olika spänningar genom att montera en enkel eller dubbel exponentiell sönderfallsfunktion. 16 försök vanligtvis genomsnitt när avbildning HEK celler för att förbättra SNR små spänningssteg och för att upptäcka eventuella blekning under inspelningen. Dessa sönder som ger en robust signal vid 100 mV kan testas i dissocierade hippocampala neuroner (Figur 4C). Den fluorescens spår från hippocampus neuron är en enda rättegång.

figur 4
Figur 4. Spännings Imaging med en enda FP Based GEVI Uttryckti HEK 293-celler och hippocampus Primär nervceller. (A) AF / F spår av en enda FP baserat GEVI, Bongwoori, som visar svaren på stegade spänningspulser registreras vid 1 kHz med en höghastighets CCD-kamera. (B) En HEK 293 cell avbildas med hög hastighet CCD-kamera; (Vänster) Vila ljusintensitet (RLI) av en cell som uttrycker Bongwoori & (höger) ramen subtraktionsbild indikerar pixlarna där fluorescensförändring observerades. (C) Optisk inspelning av inducerade aktionspotentialer från mus hippocampus primära neuroner som uttrycker Bongwoori. Åtgärds potentialer framkallat i hela cellen strömtång läge. Den AF / F spår valdes från pixlarna korrelerade till soma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En representativ fluorescence avläsning av donator- och acceptor-kromoforerna visas i figur 5A. Polariteten av fluorescensförändringen är motsatsen för givaren och mottagaren gör det möjligt ratiometrisk analys för att minska korrelerade bullerkällor, t ex., Rörelse. Till exempel, kommer rörelse korreleras brus uppvisar en förändring i fluorescens i samma riktning för både givare och acceptor fluorescensen. Medan FRET baserade sonden är i stånd att kvotmetrisk avbildning är det ofta bättre att endast analysera ljusare kromoforen. Detta beror på att dimmer kromoforen kan väsentligt öka bullret från inspelningen. Figur 5B visar denna effekt. Ramen subtraktion i figur 5B från ljusare Clover visar tydligt där den optiska signalen är i cellen. I kontrast, varvid ramen subtraktion av mRuby2 fluorescens visar högre grader av buller i hela cellen. Därför är endast den givarsignal med Clover visad i ett hippocampus neuron i Figur 5C.

figur 5
Figur 5. Spännings avbildning med en FRET baserad GEVI uttryckt i HEK 293 cell och hippocampus primära neuroner. (A) AF / F spår av en FRET baserad GEVI, Nabi2.242, som visar svaret vid två våglängder till stegade spänningspulser registreras vid 1 kHz med en höghastighets CCD-kamera. (B) Top; givaren (Clover-RLI, Clover-ram subtraktion) och acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2-ram subtraktion) bilder som bearbetats med två olika trösklar för varje FP, botten; samma tröskel användes för både givare (Clover-RLI, Clover-ram subtraktion) och acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2-ram subtraktion) bilder för att illustrera den relativa dunklet av mRuby2. Alla bilder togs från samma HEK 293 cell som uttrycker Nabi2.242. (C) Den 520 nm våglängd tress inducerade aktionspotentialer från en mus hippocampus primär neuron uttrycker Nabi2.244 sensor. Den AF / F spår valdes från pixlarna korrelerade till soma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Konsekvenser av varierande ljusnivåer för AF och AF / F-värden. (A) En bild av en HEK 293 cell som uttrycker en enda FP baserad GEVI, Bongwoori, som visas i Vila ljusintensitet (RLI), (B) fluorescens spår visar kärnan i genomsnitt AF (F x -F 0) värden från tre olika regioner, region 1: membranregion med väl lokaliserade fluorescenssignal, region 2: en region med ljus inre fluorescens, end region 3: region långt från optisk signal, (C) fluorescens spår som visar kärnan i genomsnitt AF / F-värden från samma områden i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

begrepp ekvationer Anmärkning
Fractional fluorescens förändring (AF / F) ekvation 2 F 1 = ljusintensitet mäts vid en tidpunkt, F 0 = ljusintensitet uppmätt vid hållpotential
Boltzmann-funktion ekvation 3 y = AF / F, V = membranpotential i mV, är V 1/2 membranpotentialen i mV vid halvmaximal AF / F, A 2 = maxvärdet dx = lutning
Dubbel exponentiell sönderfallsfunktion y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 t 1, τ 2 = tidskonstanter, A 1, A 2 = amplituder, t, t 0 = två tidpunkter, y 0 = förskjutning

Tabell 2. Ekvationer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nervsystemet använder spänning på flera olika sätt, orsakar inhibering en liten hyperpolarisation orsakar synaptiska mata in en liten depolarisation och en aktionspotential resulterar i en relativt stor spänningsändring. Förmågan att mäta ändringar i membranpotential genom GEVIs erbjuder lovande potential analysera flera komponenter av neuronala kretsar samtidigt. I denna rapport visar vi en grundläggande metod för avbildning förändringar i membranpotentialen med hjälp av GEVIs.

En viktig nyckel för avbildnings förändringar i spänningen är effektiv expression av GEVI i plasmamembranet. Intracellulärt uttryck skapar en icke-responsiv fluorescens som minskar SNR av sonden. Optimera transfektion villkor avsevärt förbättrar konsistensen av de optiska mätningarna. I själva verket är det lämpligt att också testa en känd sond vid provning av en ny GEVI att säkerställa att skillnader i optisk aktivitet beror helt och hållet på new sond och inte villkoren i cellerna.

Figur 6 visar effekten av interna fluorescens i att minska känsligheten för spännings avbildning, Figur 6B visar AF / F-värdet. AF värderar en HEK-cell som uttrycker den enkel FP baserade GEVI, Bongwoori. Trace två kommer från region 2 (blå färg) där relativt ljus inre fluorescens ses i Figur 6A. Detta spår har liknande nivå av AF värde som spår 1. I figur 6C där spåren i figur 6B delades av RLI värden för AF / F-värden, spår 2 droppar kraftigt på grund av den ljusa inre fluorescens som minskar AF / F värden. Fluorescens spår 3 har en mycket liten AF utan även har en mycket liten RLI värde (F). Resultatet är en missvisande AF / F-signal som har en avsevärd ökning av bullret från inspelningen. Detta exempel ingick att visa AF är ocksåviktig. En stor förändring i AF / F är inte bra om F är mycket låg till att börja med.

Användningen av en bild splitter möjliggör samtidig mätning av två våglängder på en enda CCD-kamera. Detta hjälper avsevärt mätning av FRET beroende fluorescerande förändringar för sond utveckling och minskar kostnaden för installationen. Men på grund av kromatisk aberration, kommer dessa två bilder vara något oskarp nödvändiggör behovet av en apokromatiska mål. Ju mer ljus desto bättre SNR, så att välja mål med den högsta numeriska bländaröppningen förbättrar också fluorescens avbildning. Dessutom kan en använda starkare ljuskällor såsom Ijusemitterande dioder (LED) eller laser för att öka SNR. Lysdioder kräver inte en mekanisk slutare.

I denna rapport visar vi de optiska signalerna från en enda FP GEVI och en FRET-baserad GEVI. Den största fördelen med en FRET-baserad GEVI är att ratiometrisk avbildning möjliggör minskning av korrelerade brus due till andning och blodflöde in vivo. Motsatt polaritet av de fluorescerande signalerna bekräftar en verklig förändring i membranpotential. Eftersom fluorescensintensiteterna hos de två kromoforer varierar ofta avsevärt, SNR kommer också att variera. Detta förvirrar den kvotmetriska analys och begränsar dess användbarhet 28. Det kan också vara en FRET oberoende signal 29. Det är därför ibland bättre att använda endast ljusare fluorescerande kromoforen vid användning av FRET att analysera förändringar i membranpotential.

Spännings avbildning är mer utmanande än kalcium avbildning på grund av hastighet och variationen av förändringar i membranpotential i förhållande till kalcium avbildning som mäter kalciumflöde. Membran potentiella förändringar i mycket snabba tidsskalor jämfört med kalciumjoner flux, och under tröskelvärdet händelser i nervceller kan inte mätas med kalcium avbildning 30. Vidare måste spänningssond vara i plasmamembranetför att vara effektiv som reducerar mängden prob tillgänglig för optiskt rapport förändringar i membranpotentialen. Följaktligen är antalet fotoner som faktiskt kan komma fram till CCD-chipet relativt få. Detta kräver att det behövs en hög hastighet och låg läs-brus-kamera med hög kvantverkningsgrad och en sond som framkallar en hög SNR på förändringar i membranpotential. Genom att avbilda celler in vitro, kommer forskarna bättre förstå de potentiella fördelarna och fallgropar GEVIs innan in vivo-mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics