HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

İnsan Bağışıklık Yetmezliği Virüsü 1 (HIV-1) virüs enfeksiyonunun akut fazında beyni işgal ve verimli onların aktivasyon yol mikroglia ve beyin ikamet makrofajlar hem bozar - ve her iki konak kaynaklı inflamatuar mediatörlerin ve çözünür HIV-1 serbest bırakma Böyle Tat ve (1,2 gözden) gp120 olarak virotoxins. Sonuç olarak, kronik nöroenflamatuar devlet HIV-1 İlişkili Nörokognitif Bozuklukları (EL) 3-5 patogenezine katkıda düşünülmektedir MSS içinde kurulmuş olur.

HIV-1 Tat veya farelerin merkezi sinir sistemi içinde, interlökin (IL) -17A arasında kronik aşırı mikrovasküler seyrelmesi 6,7 ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu kronik Nöroenflamasyon serebral damarlarda üzerindeki etkileri yoluyla EL patogenezine katkıda bulunabileceği ihtimalini yükseltir. Ayrıca bu soruyu incelemek için, biz serebral vasküler yapıda çalışılmıştır ölçmek için yöntemler geliştirmişlerdirtures.

Bu kağıt, kademeli bir uzunluğu, toplam kademeli bir uzunluk ve ortalama kılcal çap ve ince bir kafatası kortikal pencereden kılcal ağ şebekeleri in vivo görüntüleme kullanılarak total kılcal hacmi ve ortalama kılcal düğümleri, kılcal kesimlerinin sayısı ölçülmesi için bir yöntem tarif eder (daha önce tarif edilen modifiye protokolleri) 8,9, hem de iki foton mikroskopi kullanılarak beyin bölümlerinin ex vivo görüntüleme. In vivo ince kafatası kortikal pencere serebral çevrenin korunması için izin verir çünkü beyin dilimleri kılcal ağları ex vivo görüntüleme rekonstrüksiyonu sağlarken Bu kombine yaklaşım, serebral vasküler parametrelerin bütünsel bir kantitatif sağlar üç boyutlu, tam kılcal ağ şebekeleri, - daha sonra ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan Kaynakları Rochester Üniversitesi Komitesi Üniversitesi Bu yazıda yapılan tüm işlemleri onayladı.

1. Ön cerrahi hazırlanması (ve fare)

  1. Gerekli tüm ekipman ile cerrahi alan hazırlayın. Önceden% 70 etanol kullanılarak işlem sırasında kullanılan tüm araçları sterilize edin. İsteğe bağlı olarak, bir cam boncuk sterilizatör kullanın veya araçları sterilize etmek otoklav.
  2. Bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odasında fare yerleştirin. 1 L / dakikalık bir hızda 4% izofluran seviyelerini ayarlayın.
    Not: astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgen, burada bildirilen deneylerde, fareler için 10 HIV etkisini incelemek için kullanılmıştır Daha önce tarif edildiği gibi 7,10 -1, serebral vasküler yapısı üzerinde nöro-inflamasyonu neden olmuştur.
  3. Yavaşça ve fare gözlemlemek için indüksiyon odasına ipucu# 39; ın düzeltilmesi refleks. Düzeltilmesi refleks bastırılmış edildikten sonra,% 2 izofluran düzeyini ayarlamak ve cerrahi tezgah burun konisi indüksiyon odasından hava akışını yönlendirmek.
  4. Hızla su infüzyon ısıtma pedi indüksiyon odasından fareyi hareket ettirin. Burun konisi ile izofluran (% 1.5-2) uygulanmaya devam. Solunum hızı (RR) izleme yoluyla değerlendirilen bireysel fare toleransına göre anestezi ayarlayın.
    Not: RR depresyon serebral kan akımı ve damar çapı değerlendirmesini değiştirerek fizyolojik gaz parametrelerini perturb olabilir. Dakikada 55-65 nefes arasında RR tutmaya çalışın. Kalp atım hızı (KAH), aynı zamanda anestezi derinliği değerlendirmek kullanılabilir; damar çapı fizyolojik değişiklikleri önlemek için dakikada 300-450 atım arasında HR tutun. Tipik olarak, anestezi verilen bir fare 1 L / dk 1.5-2.0 izofluran% arasında yeterli olacaktır.
  5. Ayrıca anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin. Fare, iletişimi yanıt vermezsecerrahi girişim rüler.

İnce kafatası Kranial Window 2. Hazırlık

  1. Fare gözlerine yapay gözyaşı jeli uygulayın. Tamamen makas veya elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare derisi saç kaldırmak.
  2. Povidon-iyot çözeltisi uygulayarak saç derisini sterilize; kurumasını bekleyin. Sonra, bir ışık mikroskobu altında, tamamen parietal kemikler işaretleme, kuyruk frontal kemik ve Bregma açığa fare derisi deri kaldırmak.
  3. Kolay çıkartılması için membranlar kurutmak için kafatasına% 10 ferrik klorür solüsyonu az miktarda uygulanır. Yavaşça kafatası kazıyarak # 5/45 forseps ile kurutulmuş membranlar çıkarın.
  4. Headplate pencerenin etrafında tutkal ince bir tabaka sürün. Yavaşça pencereye merkezindeki ilgi alanı tutmak, fare kafatası karşı headplate basın. Tutkal polimerize etmek headplate dental çimento bir damla uygulanır.
  5. Ince bir tabaka sürünheadplate penceresinin kenarında tutkal tuzlu tutmak için bir rezervuar oluşturmak için. Tutkal kuruduktan sonra, fare headplate koşum içine headplate vida.
    Not: Bu prosedürde kullanılan fare headplate kablo demeti, bir metal taban ve iki metal sütunlu bir yapıdır. Her sütunda bir bahar ve bir kanat somun var. Headplate bahar üstüne yerleştirilir ve baş seviyesi ve hareket etmiyor kadar kanat somun sıkılır.
  6. 6000 rpm'de Microtorque matkap bağlanmış bir matkap ucu ile headplate penceresinden herhangi bir tutkal çıkarın. Gemilere yapısal hasarlara neden olabilir fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için her 10-15 saniyede durdurun.
    1. Yeni bir matkap ucu yardımıyla, orta hatta (headplate penceresinin çapının üçte biri) yanal olarak Microtorque matkap 1,5 mm yerleştirin. 4000 rpm'de ince bu konum etrafında kafatası başlayın. Doğrudan aşağı yönlü baskı ile kafatası arasında hafifçe matkabı hareket ettirin.
    2. Kes drilling her 10-15 sn fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için. Bu süre zarfında, bir sıkıştırılmış hava spreyi kullanarak birikmiş kafatası tozu temizleyin.
    3. 5-10 saniye kafatası soğumaya RT tuzlu su damla. Yavaşça kafatası inceltme devam etmek yumuşak bir doku ile tüm sıvıyı çıkarın.
  7. Kafatasının son incelme için, headplate haznesindeki tuzlu küçük bir hacim yerleştirin ve hafifçe küçük damarlar açıkça görülebilir kadar ilgi alanı üzerinde diş MicroBlade süpürün.

Fizyolojik Parametrelerinin 3. İzleme

  1. Kafatası tamamen inceltilmiş sonra, sahibinden fare ayırmak ve sırtında üzerine yerleştirin. Yavaşça açıkça medial uyluk açığa her iki arka bacaklarını aşağı bantlayın.
  2. Makas veya elektrikli tıraş makinesi ile hem medial uyluk üzerinde saç çıkarın. Povidon-iyot ile uyluk kapsayan cerrahi siteyi dezenfekte edin.
  3. Femoral ven üzerinde medial sağ uyluk cilt üzerinde Pinchve arter 5. forseps kullanarak. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın.
    Not: Sol uyluk cerrahi komplikasyon (vasküler anomaliler, rüptüre damarlar) durumunda saklıdır.
  4. Cerrahi siteye% 0,9 tuz yaklaşık 3-5 damla uygulayın. Bu damarların büyük büyütme, hem de damarların nemli sitesi tutmak ve önlenmesi kurutma sağlar. Açık açık iki # 5/45 forseps kullanılarak femoral nörovasküler demet içine diseksiyon ile arter femoral ven ayırın.
  5. Yaklaşık 1 cm arayla femoral arter altında cerrahi sütür iki, 3 cm'lik parçalar yerleştirin. Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemek için yardımcı olacak bir damar turnike oluşturmak için üst dikiş saat yönünde çevirin.
  6. Yaylı makas kullanılarak femoral arter küçük bir kesi yapmak. Kateter arter içinde sıkıca kadar kesi ve peşin yoluyla arter kateteri yerleştirin.
  7. Kan pıhtılaşmasını önlemek için kateter ile heparin 10 ul (100 lU / ml) enjekte edilir. Sonra, cerrahi basit bir kesintiye desen 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sağ uyluk kapatın.
  8. Intraperitoneal sağ alt kadranda içine üretan 50 ul (1.2 mg / g) enjekte edilir. Beş dakika sonra intraperitonal üretan 100 ul bir toplam sol alt kadrana bir 50 ul enjeksiyon ile tekrarlayın. Eşzamanlı anestezi derinliği için fare tekrar kontrol ederken yavaşça yaklaşık% 0.25 izofluran seviyesini düşürür.
    Not: bağırsakları perfore kalmaması arka karın duvarı boyunca periton boşluğu içinde yüzeysel iğne tutun. Bu karın rektus mu kısma yapılabiliruzak iç organlardan ve sonra enjekte scles.
  9. Kılcal tüp kullanarak, kateter arter kan 40 ul örnek toplamak. Bir tuzlu dolu dört yollu ve heparin şırınga ile donatılmış kan basınç dönüştürücü kateter takın.
  10. Kateterin istenmeyen kaldırılmasını önlemek için cerrahi alete tansiyon dönüştürücüyü bantlayın. Ortalama arter basıncı izleme başlayın.
  11. Bir kan gazı analizörü giriş portuna kan dolu kılcal tüpü yerleştirin. Tüm kan ekstre edildikten sonra, giriş portundan kılcal tüp kaldırmak. O 2 ve CO 2 kan gazları, kan gazı analizörü yazdırılan bir kağıt üzerinde görünecektir.

Floresan Boya 4. Enjeksiyon

  1. 5. forseps kullanarak medial sol uyluk üzerinde cilt sıkıştırın. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Dekstran konjuge kırmızı yayan rhodamine boya hazırlayın(70 kDa) (serum fizyolojik içinde eritilmiş 10 mg / kg).
  2. Femoral bağlı bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga vein.Using bulun şırınga 130 ul hattına görüntüleme için uygun bir floresan boya daha önce hazırlanan çözelti çizin. Şırınga içine tamamen boya çizim ve sıkıca şırınga duvara iterek tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
    1. Viraj sert bir yüzey konik tarafı yukarı bastırarak yaklaşık 30 derecelik bir açıyla 30 G iğne. Boya ile iğne doldurun ve 100 ul örneği bırakarak, herhangi bir aşırı sıvı atın.
  3. Yavaş yavaş femoral ven içine boya 100 ul örneği enjekte edilir. İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon siteye sürekli hafifçe baskı uygulayın. Boya 5 dakika dönmesine izin verin.
    Not: alternatif, sağ femoral ven başka cerrahi sitenin yaratılması yoluyla daha fazla kan kaybını önlemek için floresan boya enjeksiyon için yerine kullanılabilir. Buna ek olarak, eğerHayvan cerrahi siteden kontrolsüz kanama, bu çok fazla heparin kateteri yıkamak için verildiğini bir göstergesi olabilir. Orada 10-15 dakika içinde hiçbir pıhtılaşma ve fare kanama hala devam ediyorsa, yeni bir fare ile deney yeniden başlatmayı düşünün.
  4. Daha sonra dikkatli bir şekilde mide üzerine fareyi çevirmek, 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sol uyluk kapatın ve fare headplate koşum içine yerleştirin.

Vivo İki-Foton Görüntüleme 5.

  1. Sürekli anestezi seviyesini korumak için emin olun, iki foton mikroskop cerrahi cihazı taşıyın. Headplate rezervuar içine% 0,9 tuz az miktarda koyun ve tuzlu su ile temas, böylece mikroskop objektif indirin. Aydınlık görüntüleme objektif kullanılarak ilgi alanı bulun
  2. Floresan boya için uygun bir dalga boyuna iki-fotonlu lazer uyarımı ayarlayın. 25x o kullanan iki foton görüntüleme başlayınbjective.
    Bu deneylerde 780 nm'lik bir dalga boyunda heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan unutmayın. Emisyon filtresi bandpass 607/36 bir boya floresans tespit etmek ve emisyon filtresi bandpass 480/20 arteryal otoflüoresan tespit etmek için kullanıldı
  3. Görünümü ekranda yatak bir kılcal bulun ve iki foton görüntüleme yazılımı kullanarak kılcal damarların optik zoom 2. Edinme görüntüleri kullanarak bu bölgeyi büyütmek.
  4. Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, dekapitasyon servikal dislokasyon ile fare kurban.

6. Ex Vivo İki Foton Görüntüleme

  1. Ekstra ince makas kullanarak, fare frontal kemikler interparietal kemikleri kafa derisi bir kesi yapmak. Işaretçi parmak ve başparmak ile kafatası kenarlarına cilt sabitleyin.
  2. Medial interparietal kemik altında ekstra ince makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca kafatası kesti. Bregma işaretleme sonra yaklaşık 3 mm kafatası kesme durdurun.
    Not: Beyni kesilmesini önlemek için kafatası keserken yukarı yönlü baskı uygulayın.
  3. # 5 forseps kullanarak, beyinden gelen kafatası ayırmak ve dikkatle beynin yüzeyine herhangi meninksler kaldırmak. Kalan Meninksler yanlışlıkla beyin lacerate olabilir; Aşırı bakım Bunu önlemek için alınmalıdır. Beyin kafatası boşalana kadar yavaşça yavaşça ileri ilerleyen beynin altında 5. forseps kaydırın.
    Not: aşağı yönlü baskı beyin delinmesiyle önlemek için kullanılması gerektiğini söyledi.
  4. Fareler için belirli bir beyin kesit aracı beyin yerleştirin. Beynin üzerinde yapay beyin omurilik sıvısının damla uygulayarak beyin yıkayın.
  5. Bregma bregma 0 dan beynin 2 mm koronal bölümü çıkarın -2. Yukarı bakacak 0 bregma ile yapay beyin omurilik sıvısı içeren içbükey cam slayt üzerine koronal bölümü (bölümün en kafatası parçası) yerleştirin. Yavaşça beyin sl kapakBir cam kapak slip ile buz.
    Not: Bu damar mimarisini deforme olabilir bir kez beyin bölümünde yer cam basarak kaçının.
  6. Mikroskop sahneye slayt aktarın ve kapak kayma% 0,9 tuz az miktarda koyun. Bu tuzlu su ile temas edene kadar mikroskop objektif indirin. Aydınlık objektif kullanarak beynin orta hat bulun.
  7. İki foton görüntüleme başlayın ve tekrar 25x objektif kullanarak orta hat bulun. Koronal bölümün kortikal yüzeyinde boyuna fissür arayarak bunu gerçekleştirmek. Orta hat üzerinde görüntüleme ekranın sağ kenarına yerleştirin ve yanal üç tam kare (orta hattan yaklaşık 1.5 mm) izleyici ekran üzerinde hareket.
    Bu deneylerde, görüntüleme parametreleri adım 5.2 not belirtilenlerle aynı olduğunu not edin.
  8. Kılcal damarlar görünümü ekranda zorlukla görülebilir hangi derinliğe bulun. Odak ilave 20 uçağı düşürünmikron z-yığınının üst belirlemek için.
  9. 1 mikron görüntü kalınlığı ayarlayın. 100 um için görünüm ekranı indirin ve piksel% 1'den az doygun olduğu gibi boyunca lazer gücünü ayarlamak.
    Not: z-yığın görüntüleri 100 ardışık 500x500x1 um görüntülerin bir dizi derlenmektedir. Daha doğru post işleme hesaplamaları olacak z yığın büyük. Genellikle, 100 mm veya daha büyük bir z-yığını toplamak için çalışmayın.
  10. Bitişik XY simgesi ardından XY tekrarlayın simgesine basın. Z-yığın tamamlandığında, Seri Bitti simgesine basın ve dosyayı kaydedin.

7. Veri İşleme

  1. ImageJ yazılım in vivo kapiler görüntüyü açın. Elle iki foton yazılımı elde edilen değerlere dayalı uzaktan oranı piksel olarak ayarlayın.
    1. Araçlar menüsünden * düz * simgesini seçin. Oppo bir kılcal duvardan uzanan bir çizgi çizinsitesi kılcal duvar ve ImageJ tarafından sağlanan uzunluğu kaydedin.
      Bu açık bir şekilde, kapiler duvarlardan kenarlarını görselleştirmek amacıyla görüntüyü yakınlaştırmak için gerekli olabileceğini not edin.
    2. Kılcal boyunca farklı yerlerde adımı yineleyin 7.1.1, yanı sıra görüntüde birden kılcal damarlar.
  2. Böyle Amira gibi analitik yazılım içine z yığın dosyasını açın. Alt uygulama araç çubuğundan Filament Editör simgesini seçin
    1. Üst veya z-yığının altına ya yaklaşık 20 Move izleyiciyi izleyici kalınlığını ayarlayın.
    2. İz simgesini seçin ve yüklenen görüntü üzerine imleci. Şekil 2C açıklanan yerlerde kılcal damarların yerleştirin düğümleri; segmentler otomatik komşu düğümler arasında görünecektir. Tüm z-yığınının boyunca kılcal Trace.
      Not: thr kılcal izlemek için uç noktaları ve şube noktaları arasında düğümleri yerleştirmek için gerekli olacaktırZ-yığın oughout.
    3. Bu düğümler kaldırmak için, Ara Kaldır simgesini tıklatın.
      Not: Bu Kaldır Seçili simgesini seçerek Seç Tek simgesini kullanarak döngü seçerek ve elle kaldırılması gerekir hatalı döngüye segmentleri oluşturabilirsiniz. Döngüler izleme sırasında aynı bölgede görünmeye devam ederse, bu düğümlerin farklı kılcal damarların yerleştirildi olasıdır.
    4. Izleme tamamlandıktan sonra, otomatik olarak ayıklanır vasküler parametreleri içeren bir elektronik tabloyu açmak için Graph Bilgisi simgesini seçin. Düğümleri ve segment sayısının ana görünümü ekranda mevcuttur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnce kafatası kortikal pencere kortikal kılcal damarların in vivo iki foton görüntüleme (Şekil 1) sağlar. Görüntüye uygun alan çok sayıda, farklı kılcal (Şekil 1A) gösterir. Aynı görüş alanında, herhangi bir arteryel hücre duvarı otofloresansı vardır ve ikinci harmonik üretimi 11 (Şekil 1B) ile indüklenen örneğin kolajen floresan gibi diğer floresan sinyalleri, söz konusu olabilir.

Beyin dilim hazırlanması işlemi tamamlandıktan sonra, yaklaşık 1.5 mm orta hat bulunan bir görüntüleme alanı (Şekil 2A). Bir 100 um z yığın Witt analitik yazılım (Şekil 2B) analiz için kullanılan üç boyutlu bir görüntü elde edilir. Kapiller ağ daha sonra elle başında ve bir kılcal sonunda, ya da herhangi bir yerde, bir kılcal b düğümleri koyarak izlenirBaşka (Şekil 2C) içine çiftliklerde. Bu morfolojik parametreleri otomatik olarak ekstre edildiği, tamamen iskeletize görüntü (Şekil 2D) üretir. Kılcal düğümleri, segment sayısı, bölüm uzunluğu, toplam bölüm uzunluğu ve fare beyin dilimleri iki foton ex vivo görüntüleme kullanarak elde edilebilir toplam kılcal hacmi (Şekil 2) anlamına gelir.

Şekil 3 bu yazıda sunulan yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, HIV nöro bir transjenik fare modeli 10 kullanılmıştır. Tat virotoxin HIV üretimi 12 hafta boyunca doksisiklin infüzyon gıda Tat + farelerinde indüklenmiştir. Kontrol grubu aynı yemek beslenen Tat- littermates oluşuyordu. Ölçülen kılcal parametrelerden herhangi Tat + ve Tat- fareler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Böylece, beynin 12 haftalık maruziyet tisHIV-1 Tat dava beyin mikrovasküler yoğunluk azalmasını oluşması için yeterli değildir. Buna karşılık, bizim önceden yayınlanmış veriler daha serebral damarlarda 7 rarefaction Tat sonuçları kronik CNS ifadesini uzamış (20 hafta) olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, burada gösterilen veriler (Şekil 3), merkezi sinir sistemi içinde, farelerin Tat ile indüklenen vasküler yeniden kinetiği açısından değerli, yeni bilgi sağlar.

figür 1
Kortikal kılcalın Şekil 1. kazanılması. (A) ince bir kafatası kortikal penceresi hazırlanmasını ve intravenöz fluoresan boya enjeksiyonu takiben, iki foton mikroskopi görüntüsü serebral damar için kullanılmıştır. Deneylerde, biz 780 nm'de heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan ve floresans emisyon filtresi bandpass 607/36 bir geçiş görselleştirildi. 11 üzerinden görünmesini neden olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Iskeletize kılcal ağ şebekeleri Şekil 2. nesil (A). Fareler damardan bir floresan boya ile enjekte edildi ve kurban edildi. Beynin bir 2 mm koronal kısmı bregma 0 ve bregma -2 arasında alındı ​​ve görüntüleme orta hat 0 bregma yaklaşık 1,5 mm gerçekleştirilmiştir. A Bir C57BL / 6 fare görüntüleme (kara kutu) için seçilen kortikal konumu temsili görüntü gösterilir. Bu bölge, somDaha önce Tat + farelerinde 12 bu bölgede oluşabilir, serebral kan bu düzensizliği göstermiştir, çünkü atosensory korteks seçildi. (B) kılcal ağ şebekeleri Temsili üç boyutlu z yığın ve görüntüler. (C) Diyagram yönteminin El ile izlemek için kullanılan damar ölçümü sırasında kılcal damarlar. (D) iskeletize z-yığın görüntü Temsilcisi görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Tat Besin virotoxin aday HIV maruz kalan farelerin karşı Tat- farelerde serebral vasküler mimari Şekil 3. Kantitasyonur 12 hafta sonra. astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgeni olan fareler üzerinde HIV-1'in neden olduğu nöro etkisini incelemek için kullanılmıştır serebral vasküler bir yapı olarak tarif 7. Bu fareler (Tat +, n = 3) Tat indüksiyon kronik (12 hafta) rejimine maruz bırakıldı (DOX yani., 12 hafta). Tat- fareleri (n = 4), (bu fareler, HIV-1 Tat eksprese etmeyen nedenle Tat + farelerin transgenik olmayan littermates karşılık gelir ve) yaş uyumlu kontrol olarak kullanılmıştır. Tat + fareler gibi, Tat- fareler de DOX maruz kalma 12 hafta aldı. O Tat (Tat-) maruz kalmamış karşı 12 hafta (Tat +) için Tat maruz kalan farelerde, düğümler (A) sayısında anlamlı bir fark, segment sayısı (B), bölüm uzunluğu ortalama oldu (C), ya da toplam kapiler uzunluğu (D), kılcal çap (üzereTat + fareleri, biz 6 görüntüleme alanlarında 14 kılcal damarları incelendiğinde; Tat- fareler için), biz 4 görüntüleme alanlarda 7 kılcal) (E) analiz, ya da toplam kapiler hacmi (F. Veriler normal (Shapiro-Wilk testi ile belirlendiği gibi) dağıtılan değildi bu yana, tam Wilcoxon rank sum testi (p <0.05 olarak bu durumda belirlenen) istatistiksel olarak anlamlı. Hesaplamak için kullanılan büyük halini görmek için tıklayınız bu rakam. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen yöntem, deneysel modeller / ayarları geniş bir beyin mikrovasküler yapılarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı olması için, üç kritik adım hakim olması gerekmektedir. İlk olarak, ince kafatası penceresi kafatası ya da altta yatan beyin zarar vermemelidir. Bu inceltme sırasında kafatası delinme ya da ısı kaynaklı damar kaçağa neden kolaydır. Floresan boya odak düzlemi içine sızabilir ve kılcal belirsiz gibi bu görüntüleme engelleyebilir. Kafatası sık ince kafatası hazırlanması sırasında bozulursa, büyük olasılıkla çok büyük bir aşağı yönlü baskı neden olur. Çapak mümkün olduğunca yakın Microtorque matkabı Holding kafatası üzerinde aşağı yönlü baskı azalacak fazla dokunsal kontrol sağlar.

İkincisi, arteriyel kateterizasyon mümkün olduğunca çabuk arter kesilmiş edildikten sonra yapılmalıdır. Hızla kateter eklemek için başarısızlık zorunlu olacak aşırı kan kaybına neden olabilirFare fizyolojik bütünlüğü romise. Kateterin yerleştirilmesi güçlüğü femoral artere göre kateterin nispeten büyük bir boyuta genellikle. Bu onun çapını azaltmak üzere kateter germek için gerekli olabilir. Ayrıca, 5. forseps ipuçları kateterin yerleşim kolaylığı arter yapılan açılış kapmak ve büyütmek için kullanılabilir.

Üretan anestezisi kısa sürede tatbik edilebilir ve böylece Üçüncü olarak, in vivo cerrahi prosedürler süresi en aza düşürülmesi gerekmektedir. Izofluran anestezisi böylece kılcal çap verileri skewing, serebral kan damarlarının 13 vazodilatasyona neden olabilir.

Bu Amira analitik yazılımı otomatik olarak elle takip gemilerin yarıçapına ayıklamak kabul edilmelidir; ex vivo beyinleri z-yığın görüntüleri analiz etmek için bu özelliği kullanırken, ancak değer yanlış olur. Bu af, çünkübeyin çıkarmadan ter, beyin kılcal damarlar artık basınçlı, ve morfolojik bozulabilir. Kılcallar, normal fizyolojik koşullar altında, basınca dayanıklı olduğu in vivo kılcal çap ölçümü, bu problemi aşılmaktadır.

Ayrıca, bu yöntem, bir kısıtlama olmaksızın olmadığını belirtmek gerekir. İlk olarak, bir çok eğitim in vivo görüntüleme hazırlığı ana için gereklidir. Bir araştırmacı verimli iki teknik olarak zor teknikleri (ince kafatası kortikal pencere ve arteriyel kateterizasyon) gerçekleştirmek için öğrenmek gerekir; Her iki teknikte bir hata deney uzlaşma ve verileri geçersiz olabilir. İkincisi, ex vivo z-yığınlarının analizi zaman yoğundur. Tek z-yığın görüntü iskeletleştirme 2.5 saat kadar sürebilir. Bu analiz dikkatli manuel tr içeren iskeletleştirme sürecinin tutarlılığını (sağlamak için deneyimli bir araştırmacı tarafından tamamlanmış olması Dahası, bu tavsiye edilirkan damarlarının Acing).

Bir kez bu protokolün tüm yönleriyle elde edilen veriler görüş alanı başına birim hacim başına kılcal veya kılcal damarların olarak kılcal yoğunluğunu gösteren diğer geleneksel olarak kullanılan yöntemlere göre daha derinlemesine ve vasküler parametrelerin fizyolojik doğru kantitatif sağlamak, hakim edilir. In vivo görüntüleme yöntemi de dahil olmak üzere diğer parametrelere çalışması için izin verir, aynı zamanda uzunlamasına çalışmalarda incelenmelidir mümkün olabilir, kırmızı kan hücresi hızı, arteriol genleşme ve kırmızı kan hücresi akı 7,12 ancak bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, kolayca adapte ve beyin mikrovasküler yapısı ile ilgili araştırma soruları incelemek için modifiye edilebilir. Bu tür çalışmalar, diğer bilişsel hastalıklarda kılcal morfolojisi patojenik değişiklikler miktarlarının veya kılcal yoğunluğunda yaşa bağlı değişiklikleri ölçerek içerebilir. Bu nedenle, bu makalede sunulan yöntem Quantität için çok yönlü ve güçlü bir araçtırserebral damar yapılarının ive analizi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64, (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
  3. Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69, (18), 1789-1799 (2007).
  4. Clifford, D. B., Ances, B. M. HIV-associated neurocognitive disorder. The Lancet. Infectious diseases. 13, (11), 976-986 (2013).
  5. Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5, (3), 294-309 (2010).
  6. Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8, (2), e57307 (2013).
  7. Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21, (7), 664-676 (2014).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
  9. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (26), 15741-15746 (1998).
  10. Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56, (13), 1414-1427 (2008).
  11. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (17), 11014-11019 (2002).
  12. Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
  13. Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87, (5), 1191-1198 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics