从小鼠皮肤使用酶消化和梯度分离提取白细胞浸润的

Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

皮肤状况,从接触性皮炎,湿疹,牛皮癣,蜂窝组织炎,真菌感染和脓肿,以非黑色素瘤皮肤癌被认为是世界范围内的50个最流行 ​​的疾病之一,非致命疾病于2010年1第四全球领先的原因。因此,底层的多样皮肤病理学分子和细胞机制的调查是研究的一个必要的和活跃的领域。啮齿动物模型已在炎性皮肤状况的了解非常有用的,例如特应性皮炎2,牛皮癣3,金黄色葡萄球菌感染 4。对于小鼠皮肤组织的酶消化廉价,高效,且简单的协议可以提供细胞,它可以用于各种下游应用,以便更好地了解皮肤疾病的病理生理的制剂。这里,一个简单而经济的方法被描述为小鼠皮肤的酶消化组织和皮肤浸润白细胞的隔离,可以用来进行细胞培养, 在体内继转移,流式细胞仪分析和分选或基因表达研究。此过程的总的目标是制备皮肤浸润白细胞单细胞悬浮液与高细胞生存力,同时尽量减少通常与定制试剂盒和机械dissociators相关的成本。

现有的皮肤组织裂解方法5-7可能导致低细胞活力及表面标志的完整性,或需要定制酶试剂盒和昂贵的组织分离机8-11。而鼠耳皮肤组织的消化是合理流行12-13消化高度角化皮肤组织(例如,从侧面)可导致污染大量非细胞碎片的细胞制剂。在最近的一项研究中,扎伊德和同事在2.5毫克消化鼠标侧面的皮肤90分钟/ ml的分散酶,弗洛45分钟,在3毫克/毫升胶原酶7结婚。在另一项研究中,这些研究人员使用的多个孵育,用2.5小时的结合消化,包括使用胰蛋白酶/ EDTA,胶原酶III的和分散酶5。不推荐用于酶促消化皮肤使用胰蛋白酶,与来自不同制造商的胰蛋白酶治疗已经显示出可测量的影响对哺乳动物细胞14-15的细胞表面蛋白的完整性。此外,分散酶可以对CD4和CD8αT细胞增殖的能力显著作用和影响的至少20分子的表面丰度,包括常见的T细胞活化标记物如CD62L 16。其他协议使用RPMI 1640在消化介质 6。然而, 离子和离子的在RPMI的存在会引起广泛的细胞聚集17。

一个理想的协议,用于组织分离的目标应该是高细胞活力,低细胞聚集,和损害最小的水平与细胞表面蛋白。高质量淋巴结基质细胞的准备工作已经完成,从而使用较短的酶孵育,钙2+和Mg 2+免费媒体协议,并避免胰蛋白酶和分散酶18。然而,这种类型的协议尚未建立用于全鼠皮肤的解离。

这里,一个协议描述以解离,隔离和从过敏原挑战小鼠侧翼皮肤丰富皮肤浸润白细胞。简言之,将切下的皮肤是预孵育中Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中,用10%胎牛血清1小时,以软化组织的消化和除去任何过量的死皮或脂肪组织。这之后是30分钟的酶消化步骤与0.7毫克/毫升胶原酶D.胶原酶D具有对细胞表面标记物密度的影响最小,并在体外 16,18对T细胞增殖没有影响,使得它非常适用于涉及表面蛋白的表征的应用程序。下列酶消化,不连续密度梯度离心法从单细胞悬浮液除去上皮细胞和碎片和富集造血细胞。重要的是,此过程避免了昂贵的基于列的磁性细胞分离试剂和组织离解机8-11,并且可以与设备和材料在碱性生物医学研究实验室发现来执行。此处这个协议是用于分离白细胞从侧翼皮肤挑战三次半抗原恶唑酮(牛)在先前致敏ND4 Swiss小鼠(改编自19)。使用多参数流式细胞仪分析细胞。这种技术产生了细胞悬浮液以最小的碎片和分离的淋巴细胞的> 95%的存活率这是由多参数流式细胞术分析来测量的T淋巴细胞和嗜中性粒细胞渗入影响SK在。

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Protocol

注:8-12周龄雌性ND4 Swiss Webster小鼠,传统安置与免费获得食物和水,用于这些研究中使用(B13S1)实验方案经麦卡莱斯特学院的IACUC。

1.致敏和用恶唑酮

  1. 0天
    1. 通过加入3ml异氟烷来放置网格下方在一个4升带盖玻璃瓶的底部吸收巾制备麻醉室中。对于这里使用的ND4雌性小鼠,时间在腔室是30-60秒直到物体被适当麻醉;优化麻醉给药所使用的小鼠品系。
    2. 剃须每个麻醉小鼠的背部和侧面使用动物毛发修剪。
  2. 第1天
    1. 使4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-恶唑啉-5-酮(牛)成绝对乙醇的2%溶液,孵育在50℃下15分钟上的旋转板在培养箱中。
    2. 简言之麻醉使用如1.1.1所述,并应用100微升2%,牛年要在各约20微升多个串行应用剃光回异氟烷麻醉小鼠。等待串行应用之间5-10秒,将溶液干燥。
    3. 小心避免溢出上的区域比背面以外的2%牛溶液,并等待该溶液应用程序之间进行干燥。
  3. 5-7天
    1. 使(牛)的无水乙醇的1%溶液,孵育在50℃下15分钟上的旋转板在培养箱中。
    2. 轻轻但稳固地固定所述小鼠在同腹颈部和尾部基颈背朝上和颈部稍稍倾斜向下(类似于一个保持为腹膜内注射)和应用100微升1%牛到剃侧翼在几个串行应用和抽空皮肤干燥之后,如上所述。
    3. 对于对照小鼠,应用100微升无水乙醇车辆到剃坯ķ。

2.侧翼皮肤丰收

  1. 安乐死使用二氧化碳气体对小鼠,并小心地切除皮肤侧面(〜25毫米×25毫米的皮肤)和10厘米手术剪的希望的区域。
  2. 使用干净,锋利的手术刀片,刮去从侧翼皮肤多余的脂肪和结缔组织。
  3. 放置3个侧面皮肤的来自3只小鼠到50毫升锥形管含有10ml的RT的HBSS [用酚红,不含钙或镁,5mM的乙二胺四乙酸(EDTA),10mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES),和10%胎牛血清(FBS)。

3.预消化组织清洗

  1. 地方管含有皮肤片段上的旋转板30分钟在保持在37℃的干燥的非充气培养箱。
  2. 涡大力10秒在温育期结束。
  3. 通过一个70微米的应变的管中的内容过滤器丢弃洗涤缓冲液和收集组织。一个单一的过滤器可以在整个过程中重复使用生物处理组中。
  4. 用一对镊子,传送从过滤侧翼皮肤进入一个新的50ml锥形管中含有10毫升新鲜,RT的HBSS培养基(如上所述含有EDTA,HEPES,和FBS)。
  5. 用12.5厘米一对浸入管外科解剖剪刀的,剁碎每片侧翼皮肤使平均片组织是约2.2毫米×2.2毫米的区域。
  6. 地方管含有皮肤片段上的旋转板30分钟在保持在37℃的干燥的非充气培养箱。
  7. 涡大力10秒在孵育结束时

皮肤4.胶原酶消化

  1. 通过一个70微米的滤网过滤管的内容物,收集和侧翼皮片转移到一个新的50ml锥形管含有10ml FRE的sh,RT HBSS介质补充有0.7毫克/毫升胶原酶D。
  2. 地方管含有在保持在37℃的干燥的非充气培养箱消化介质和皮肤片段上的旋转板30分钟。
  3. 管剧烈10秒的在温育结束涡流内容。
  4. 管通过一个70微米的过滤器过滤的内容到一个新的50ml锥形管;保持流通含有消化的组织并丢弃过滤器和侧翼皮肤碎屑。
  5. 5分钟,在350克在50毫升HBSS介质,离心机通过流洗,倾倒出上清液。

5.密度梯度离心

  1. 使用血清吸管,在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入3 ml的室温的67%的密度梯度离心介质为一个新的15毫升锥形管,用于每个样品。
  2. 重悬细胞沉淀在5ml RT 44%的密度梯度离心介质在HBSS与酚红。
  3. 根特LY层5毫升含有在67%的密度梯度离心介质样品的顶部的细胞用血清吸管的44%密度梯度离心介质。确保设置移液器最慢的速度,然后将吸管沿着锥形管的壁上。要小心,不要动摇,破坏或反转梯度。
  4. 设置加速到最低设置,松开刹车,离心梯度在931 XG 20分钟,在室温确保离心机是平衡的。
  5. 离心后,小心地从离心机取出梯度,并轻轻地运送到实验台上拿着管子直立。使用5毫升塑料移液管,在44%和67%的密度梯度离心介质和传输的界面除去细胞层,以一个新的15毫升锥形管中。如果接口是不可见的,只需在67%-44%的边界取出约2毫升的液体。
  6. 填充锥形管从INTE含有细胞rface有2%FBS在1X冰冷的PBS,离心细胞5分钟,在350×g离心,倾倒出上清液。
    注意:这是第一次发现的细胞可以被冷却/保冷自消化步骤是在37℃和密度梯度离心介质的步骤是在室温。细胞可以在一个1被再悬浮:1台盼蓝稀释和计数和活力的信息可以在此时获得。

6.阻塞和染色的流式细胞仪分析

  1. 块FcγRII/ III受体的细胞上,以防止非特异性抗体染色。对于这里描述的实验中,使抗体预混在PBS,2%FBS的含1:100稀释抗CD16 / 32(2.4G2)未结合的抗体结合和块FcγRII/Ⅲ受体。
  2. 孵育阻断细胞的抗体对CD3ɛ(145-2C11),CD4(RM4-5),CD8α(53-6.7)的CD11b(M1 / 70),表面CD11c(N418),CD44(IM7),CD45(适当的预混30-F11),CD45R(RA3-6B2),CD62L(MEL-14),和LY-6G / LY-6C(GR-1)(RB6-8C5),以及亮紫510活/死染色,以确定死亡细胞。使用所有抗体无论是在推荐的制造商或以前的研究人员优化稀释。对于这里所描述的实验中,使用的所有抗体以1:100的稀释。
  3. 在50μl的1X PBS染色缓冲液含2%FBS洗涤细胞,重悬。保持在冰上,直至荧光数据可以在流式细胞仪上获得。
    注意:有补偿参数预先优化采集荧光数据的前一个淋巴组织和一个共同的细胞表面抗原(如CD4或CD8)是很重要的。
  4. 以增加细胞数量为下游流式细胞分析,从染色的细胞的整个样品采集数据。

7.使用标准方法来完成下面列出的步骤分析流式细胞仪数据

  1. 首先,对前向散射的淋巴细胞区域栅极(区)通过侧散射(区)的情节。
  2. 然后,选择使用前向散射(宽)由侧散射(宽)的单细胞,避免分析双峰。这也可以实现与由侧向散射高度情节前方散射高度。
  3. 然后,在谱系栅极(细胞CD11b,CD11c的,和CD45R / B220)阴性和CD3阳性事件,要排除的巨噬细胞,树突细胞,和B细胞,分别和局限分析到T细胞区室,如果目标是,因为它是在这里,以评估浸润T细胞。
  4. 接着,在活细胞排除活/死染色栅极。
  5. 最后,在所感兴趣的细胞群栅极(见代表性结果部分)。

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Representative Results

胶原酶D处理的脾细胞显示出的CD4和CD8 T细胞上的 α 类似的水平 相比,媒体处理的对照
首先,胶原酶D对的对T细胞亚群谱系和活化标记的频率和表面丰度的任何潜在影响使用次级淋巴组织作为对照进行了评估。从ND4小鼠得到洗涤1小时用HBSS介质脾细胞悬浮液。接着,一半的细胞进行0.7毫克/毫升胶原酶D(如上述第4节中所述)。剩余的细胞重新悬浮在HBSS中控制平台。接着,这两个脾细胞级分使用密度梯度离心如上述第5节中描述进行处理。然后将细胞用抗表面CD4和CD8α染色,并在流式细胞仪分析。单身,住,CD45 +,非T系- (B220 -细胞CD11b -的CD11c - ),CD3ɛ+ 细胞进行门控以进行分析,以排除B细胞,巨噬细胞,树突状细胞。细胞和30%的CD4 - - CD4和CD8α蛋白脾细胞的表面上对已进行胶原酶ð消化和那些尚未曝光用约60% CD4 +CD8α酶上同样检测到检测CD8α+细胞与任一处理( 图1A)。因此,胶原酶ð消化并没有影响CD4和CD8α的相对频率。表面的CD4和CD8α几何平均荧光单位(GMFI)对这些子集的强度也比较的两种治疗之间; GMFI值的CD4分别为2271分别酶处理和2243为控制脾细胞,并GMFI值CD8α分别为536酶处理的和520进行控制的脾细胞。酶处理也对T细胞活化的表面密度没有影响标记物ÇD44或CD62L在CD4 + T细胞 图1B)。为CD44几何平均荧光强度值分别为669酶处理和654控制脾细胞; GMFI值的CD62L是1523为酶处理和1517为控制脾细胞。作为胶原酶ð消化保留在分离的细胞表面蛋白的完整性,这里描述的方案可以用于对下游流式细胞分析信心。

酶消化和侧面的皮肤细胞产生高细胞活力梯度净化
上述获得的细胞悬浮液的细胞产量和百 ​​分比生存力用台盼蓝染料排除20评估。这种消化和梯度分离协议产生约250可行的每侧翼组织毫米2牛年攻击小鼠的免疫细胞,约4可行的每毫米组织的2车辆攻击小鼠的免疫细胞先前致敏牛( 表1)。

酶消化和侧面的皮肤细胞产生强劲复苏的免疫细胞的梯度纯化
接着,在皮肤的免疫细胞浸润的程度通过分析细胞的牛挑战的小鼠和对照小鼠,以评估使用此处描述的方法皮肤浸润免疫细胞恢复的侧面分离的CD45表面蛋白的丰度进行测定。 CD45是一个泛造血谱系标记21。 95%的低前向和侧向散射,单细胞(选通未示出)在牛攻击小鼠,并且这些细胞在车辆挑战对照的71%为活CD45 +细胞( 图2)。在侧翼皮肤以下使用本文描述的方法表1)3每日牛挑战检测浸润CD45 +免疫细胞阿〜67倍的增加。

=“1”>三侧翼牛挑战导致T细胞和嗜中性粒细胞的显着浸润
我们的技术产生了从侧面皮肤的细胞群,可用于检测多种骨髓和淋巴细胞亚群的诸如的Gr-1 +嗜中性粒细胞22,CD4 + T细胞和CD8αT细胞。我们观察到〜6倍,7〜倍,和〜73倍增加,中性粒细胞,CD4 + T细胞,和CD8αT细胞,分别以下3每日牛挑战( 表1)。我们所获得的活细胞的总数乘以计算这些增加由给定的免疫细胞片段的百分比出存活细胞栅极的期间流式细胞分析(使用台盼蓝排除计数)。然后我们将活总免疫细胞在牛处理的小鼠的数量,的Gr-1 +,CD4 +,CD8α+细胞由相应的数字为车辆的对照小鼠,使我们倍增加淋巴细胞亚群。的Gr-1 +嗜中性粒细胞占单,现场CD45 + B220 42% -的CD11b - CD11c的-细胞在牛治疗的小鼠和该群体在EtOH处理的小鼠的10% 图2B)。在牛处理的小鼠,〜门控CD3 + T细胞的52%是CD8α+和 〜34%为CD4 +,而在车辆的控制,〜T细胞的9%为CD8α+和 57%的患者 CD4 +(图2C) 。因此,利用该技术此处描述的,过敏性和非过敏性皮肤侧翼可被处理,以产生适合于浸润免疫细胞亚群的高分辨率流式细胞表征单细胞悬浮液。

从鼠标侧面的皮肤细胞亚群 牛/牛(3) 牛/乙醇(3) 折叠扩展(牛/ Ethanol)
每mm 2组织
细胞的总数量 262.7 5.3 49.3
CD45 +免疫细胞 250.7 3.8 66.7
CD4 + CD8 -细胞 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 +细胞 10.6 0.1 72.9
中性粒细胞 8.6 1.5 5.6

从表中ND4雌性小鼠过敏性皮肤的侧翼1.细胞的产量 。使用台盼蓝排除活细胞从侧面皮肤中分离进行计数,并且标准化为细胞基于皮肤分离的区和小鼠的数目/ mm 2的组织每那朵汇集起诉的准备。我们计算出的总的免疫细胞产量的基础上检测基于谱系特异性表面标志物的造血抗原CD45在细胞表面上,和淋巴细胞亚群的产量。然后我们把细胞在牛年治疗的小鼠的数量由车辆控制老鼠的数量,给我们折增加淋巴细胞亚群。示出的数据表示来自每个治疗2-3只小鼠汇集的数据,和代表两个独立的实验。

图1
脾细胞的图1.酶消化和梯度纯化保存细胞亚群和细胞活化标记。脾细胞洗涤1小时用HBSS介质,孵育或者胶原酶D或单独的HBSS介质和使用密度梯度以除去碎片和红血细胞中纯化。 T细胞被确定为住,CD45 +,血统(B220,细胞CD11b,CD11c的)<SUP> - ,和CD3ɛ+。 CD4和CD8αT细胞的频率酶消化(A)的后没有改变。 CD44和CD62L在CD4 + T细胞表面密度并没有改变下列酶促消化(B)中。显示的数据表示从2-3只小鼠的治疗从单一的实验汇总数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.酶消化和皮肤细胞的梯度净化揭示控制与过敏原的挑战鼠标侧面的皮肤明显的免疫细胞浸润。三翼牛挑战产生皮肤浸润的免疫细胞在以前致敏ND4瑞士小鼠(A〜67倍A)。三牛的挑战还提供图片oked中的Gr-1 +嗜中性粒细胞(B)的一个〜6倍的增加,和〜73-和〜7倍CD8α+和 CD4 + T细胞,分别(C)的增加。现场CD45 +免疫细胞从单一的,低正向和侧向散射单元门;中性粒细胞和T细胞B220门-细胞CD11b - CD11c的-活的单个细胞。 1台盼蓝稀释以下梯度密度分离:计数采用一个1执行。显示的数据表示,从2-3小鼠各治疗组汇总数据,并代表了两个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

表征变化,皮肤的居民白细胞皮肤疾病的啮齿动物模型,如特应性皮炎或银屑病是理解炎症细胞大量涌入和疾病病理之间的机械连接非常重要。在这里,我们描述了一个经济的技术来隔离皮肤组织的白细胞在大多数生物医学研究实验室发现基本设备。这种较快的技术避免了使用昂贵的组织分离机和自管和试剂,有助于节约资源,同时尽量减少手工操作时间在实验室工作台上。温和酶促消化和不连续梯度分离除去大部分上皮细胞和碎片,和分离的细胞可用于各种的下游应用,包括流式细胞仪分析,细胞分选,转移,细胞培养和体外刺激测定法。消化酶与胶原酶D有对T细胞表面标志完整,preser无影响VES细胞活力。这个协议可以很容易地修改,以处理从区域比侧翼其他皮肤。

在此过程中的最重要的步骤是:1)彻底除去任何脂肪和结缔组织而收获皮肤,2)的处理和加工组织迅速仔细最大化浸润细胞产量,同时最小化的细胞死亡,3)轻轻分层的梯度,和4)提取渐变的接口。在开始大规模的实验它练密度梯度离心介质分层和接口去除是重要的。一个可以练习从一个不连续密度梯度收获细胞,通过70微米过滤器进入的1X PBS染色缓冲液破碎整个鼠脾脏和按照步骤5如上所述进行密度梯度这是很容易地看到和提取之间的界面44%的密度梯度离心介质和使用藻67%的密度梯度离心介质lenocytes,由于大量存在的免疫细胞。

当使用密度梯度工作,气泡应避免同时移液,和梯度中断应最小。锥形管含有梯度应轻拿轻放,并在任何时候都保持垂直。密度梯度离心媒体解决方案应始终在室温,设置为最慢的释放速度,保持在室温的离心机,设置为低加速度脱开制动,并仔细血清学移液器纺前平衡。当皮肤制剂能产生白细胞浸润的少量工作,细胞并不总是在梯度界面中可见。因此,重要的是,使44%的密度梯度离心介质用HBSS含有酚红使得接口能够容易地可视化,甚至当层细胞不能被分辨。此外,要温柔,但解压时迅速,清洗是非常重要的和处理皮肤组织,以避免细胞死亡之前的皮肤被放置在HBSS介质。

如果细胞活力或纯度低,更短的(约20分钟)的消化时间,胶原酶D(〜0.5毫克/毫升),或更精细切碎的组织稍低浓度可能会有所帮助。由于过度消化和组织的退化可能导致细胞的死亡,调查人员将需要优化的最小消化时间,提供了一个足够大的细胞样本量17。这个过程可能会需要在个别研究者的手上多轮优化,标准化的技术。胶原酶D活性水平还可以制造大量的和调整,以消化时间之间变化将有每批酶用来制成。在优化过程中,重要的是要进行纯化,用和不用的酶消化步骤与可靠的活/死染色以及免疫细胞染色林参考细胞悬浮液(例如脾)EAGE标记(例如CD45,CD3ɛ,细胞CD11b,CD11c的,等)以确保细胞群和感兴趣表面标志物穿过组织消化过程被保留。如果可能的话,它是有帮助的上一个流执行优化仪,可以测量正向和侧向散射的宽度或高度,以及面积,以排除细胞聚集。最后,细胞悬浮液应在光学显微镜的视觉可行性评估和一般的细胞形态下进行检查。所述细胞可以手动使用光学显微镜下或在流式细胞仪上使用计数珠0.4%台盼蓝染料排除进行计数。对于需要特定细胞类型的更严格的定量,在切除的组织的研究中,研究人员可以权衡或之前和消化后测量组织碎片的体积,并用消化的程度,以更准确地估计本细胞亚群数量在组织中的存在进行分析。

这方面的一个限制协议是,它特别适用于免疫细胞的纯化。如果一个人的爱好分离,纯化,和另一细胞群体(例如,皮肤上皮细胞)的分析,密度梯度的设置和酶促消化协议都将有可能需要进行修改和优化,以最好的隔离感兴趣的细胞。然而,该协议允许隔离两个淋巴样和髓样细胞亚群和纯化,因而可以适应大多数免疫的应用程序。另一个限制是,此协议不能使用的细胞群渗入真皮与皮肤的表皮之间进行区分。为了实现这种区别水平,该协议将必须进一步适于与额外的步骤来酶促分离真皮和表皮的前或代替此处所述的步骤。这里,将样品从〜3只小鼠汇集,以促进多参数流式细胞仪分析使得难以检测生物复制之间的差异。然而,根据所选择的下游应用,该协议可以很容易地修饰以产生和使用的样品从单个受试者。最后,该协议在这里为年轻呈现,ND4雌性小鼠可能需要进行修改,针对不同年龄,性别或菌株根据研究人员的需要的小鼠。

综上所述,温和的酶的这样的组合消化和不连续梯度分离提供从炎性皮损小鼠纯化的免疫细胞的一个简单,有效和经济的方法。它可直接或穿过皮肤病症的啮齿动物模型的一个不同的范围宽泛地适于作为一种方便的工具,以评估免疫浸润并分离白细胞的纯的,可行的人口为下游应用。

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Disclosures

作者有没有财务或其他利益的披露。

Acknowledgements

美国国立卫生研究院(NIH R15 NS067536-01A1直流),国家慢性阴部疼痛协会(奖DC),以及麦卡莱斯特学院支持这项工作。 CB获得了奖学金从麦卡利斯特大学贝克曼学者计划,由阿诺德和梅布尔贝克曼基金会资助。 BTF和TM是由JDRF 2-2011-662支持。我们感谢贾森申克尔博士和朱丽安娜·刘易斯博士的技术咨询,以及Chatterjea实验室的所有现任和前任成员的帮助和支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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