Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die voor de karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans. De-gesteven tarwe endosperm celwanden werden geïsoleerd als alcohol-onoplosbare residu (AIR) 1 en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1 M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven door Ratnayake et al. (2014) 2. Twee verschillende benaderingen (zie overzicht in figuur 1) worden aangenomen. In de eerste, intact W-sol AXs behandeld met 2AB de oorspronkelijke RE hoofdketen suikerrest label en vervolgens behandeld met een endoxylanase aan een mengsel van gelabelde 2AB RE en intern gebied reducerende oligosacchariden, respectievelijk genereren. In een tweede benadering wordt de KOH-sol Fr gehydrolyseerd met endoxylanase eerst genereren van een mengsel van oligosacchariden die vervolgens gelabeld met 2AB. De enzymatisch vrijgegeven ((on) met het label) oligosacchariden uit beideW- en KOH-sol FR's vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-MS-QTOF en ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs worden ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR), die ook informatie over de anomere configuratie. Deze technieken kunnen worden toegepast op andere soorten polysacchariden met de juiste endo-hydrolasen.

Introduction

Heteroxylans zijn een familie van polysachariden die de overheersende cellulosevrije polysacchariden van de eerste wanden van grassen en de secundaire wanden van angiospermen 3-6 zijn. Xylaan ruggengraat verschillen in hun soorten en substitutiepatronen met glycosyl (glucuronzuur (GlcA), arabinose (Araf)) en niet-glycosyl (O-acetyl, ferulinezuur) residuen afhankelijk weefseltype, ontwikkelingsstadium en soorten 7.

Wanden van tarwe (Triticum aestivum L.) endosperm bestaan ​​voornamelijk uit arabinoxylaan (AXs) (70%) en (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanen (20%) met kleine hoeveelheden cellulose en heteromannans (2% elk) 8. Xylaan backbone kan op verschillende niet-gesubstitueerde en overwegend mono-gesubstitueerde (voornamelijk O-2 positie en in mindere mate O-3) en met de digesubstitueerde (O-2 en O-3 posities) met α-L-Ara zijn f resten 9. Het reducerende einde (RE) van heteroxylanen van tweezaadlobbigen (bijvoorbeeld Arabidopsis thaliana) en 10 naaktzadigen (bijvoorbeeld spar (Picea abies)) 11 bevat een karakteristieke tetrasaccharide glycosyl sequentie; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal A- p (1 → 4) -D-Xyl p. Om heteroxylan biosynthese en functie (biologische industrie) te begrijpen, is het belangrijk om volledige sequentie xylaan backbone op de soort en de patronen van substituties alsook de sequentie van het reducerende einde (RE) begrijpen.

Specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans worden beschreven in dit manuscript. De betekenis berust op fluorofoor tagging (met 2 aminobenzamide (2AB)) het reducerende einde (RE) van de heteroxylan keten vóór enzymatische (endoxylanase) hydrolyse. Deze benadering, met name voor de RE sequencing waseerst gemeld door het laboratorium York 10,12-13 maar is nu uitgebreid met de interne regio sequentie omvatten en is een combinatie van bekende technieken die even aanpasbaar aan alle heteroxylans onafhankelijk van de bron van isolatie. Deze benadering kan ook worden toegepast op andere soorten polysacchariden gebruikt (indien beschikbaar) passende endo-hydrolasen.

In de onderhavige studie werden de gesteven tarwe endosperm celwanden geïsoleerd als een alcohol-onoplosbare residu (AIR) en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven in Ratnayake et al. (2014) 2. De vrijgemaakte oligosacchariden zowel W- en KOH-sol FR's vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-HPLC gekoppeld aan de online chromatografische scheiding onder toepassing van een RP C-18 kolomen ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bij de etikettering van het reducerende einde (RE) Sugar Residu van W-sol AXs met 2-aminobenzamide (2AB)

  1. Incubeer W-sol AXs met 2AB (0,2 M) in aanwezigheid van 1 M NaBH3CN (natriumcyaanboorhydride) (pH 5,5) gedurende 2 uur bij 65 ° C aan de reducerende uiteinden van de polysaccharide backbone ketens zetten hun fluorescerende derivaten.
    VOORZICHTIG: De volgende stap moet worden uitgevoerd in de zuurkast zoals NaBH3CN releases giftige cyanide gas wanneer het in contact met water.
    1. Weeg NaBH3CN (62,8 mg) en los op in water (1 ml) in een microcentrifugebuis (1,5 ml) aan een 1 M NaBH3CN te bereiden. Ontbinden 2AB reagens (27,2 mg) in 1 M NaBH3CN oplossing (1 ml) door verwarming bij 65   ° C en de pH van het reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) tot pH 5,5 met 10% azijnzuur.
    2. Voeg 200 pl reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) W-sol AXs (1 mg) in een glazen buis met een pet en meng met behulp van een vortex mixer. Incubeer gedurende 2 uur bij 65   ° C in een zuurkast. Koel de suspensie tot kamertemperatuur en voeg 4 vols. absolute ethanol.
    3. Plaats de suspensie in een koelcel (4 ° C) O / N polysacchariden precipiteren.
    4. Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) naar supernatant te verwijderen. Was de pellet uitgebreid met absolute ethanol (4x), aceton (1x) en methanol (1x), gecentrifugeerd tussen elke wassing. Vacuüm droog bij 40 ° CO / N.
      Opmerking: Uitgebreide wassen verwijdert ook de resterende 2AB.

2. Genereren van Xylo-oligosacchariden van 2 AB gelabelde W-sol AXs

  1. Ontbinden 2AB gemerkte W-sol AXs (1 mg) in 500 pl natriumacetaat buffer (100 mM, pH 5) in een microcentrifugebuis (1,5 ml). Voeg 4 eenheden van endoxylanase (GH 11, [M1]) en incubeer bij 37   ° C gedurende 16 uur.
  2. Vernietigen enzymactiviteit door verhitting van het reactiemengsel mixture gedurende 10 min in een bad met kokend water. Koel de suspensie tot kamertemperatuur en overbrengen naar glazen buis met een kap. Voeg 4 vols. absolute ethanol en zet de suspensie in een koelcel (4 ° C) O / N één onverteerd polysachariden precipiteren.
  3. Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) onverteerd polysachariden (pellet) scheiden en endoxylanase gegenereerd xylo-oligosachariden (supernatant). Giet supernatant in een schone glazen buis en plaats deze in een warm water bad (40 ° C).
  4. Damp het ethanol onder een stroom stikstofgas om een ​​eindpunt volume (~ 500 pi). Bevries de supernatans bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren supernatant in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen.

3. Productie van Xylo-oligosacchariden van KOH-sol AXs en 2AB Labelling

  1. Behandel KOH-sol AXs met endoxylanase (GH 11, [M1]) om xylo-oligosacchariden te genereren, zoals hierboven (paragrafen 2.1-2.4) beschreven.
  2. Behandel endoxylanase gegenereerd xylo-oligosachariden van KOH-sol AXs met 2AB reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) zoals hierboven (paragrafen 1.1.1-1.1.2) beschreven.
  3. Giet supernatant in een schone glazen buis en plaats deze in een warm water bad (40 ° C). Damp het ethanol onder een stroom stikstofgas om een ​​eindpunt volume (~ 500 pi). Bevries de supernatans bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren supernatant in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Bereiding van MALDI-matrix oplossing
    1. Voeg een klein bolletje 2, 5-dihydroxbenzoic acid (DHB) tot 50% acetonitril (500 ml) dat 0,1% mierenzuur in een buis (MALDI-matrix oplossing). Meng met behulp van een vortex, als het snel oplost, voeg een ander klein bolletje DHB. Noot: Ideale concentratie van MALDI-matrix oplossing 10 ug / ul -1.
  2. Bereiding van MALDI-target Plate
    1. Stort de aqueoons oligosaccharide (native) monsters (5-10 ug) (W-sol en / of KOH-sol) op een MALDI-target plaat. Voeg 0,3 gl MALDI-matrix oplossing wordt met een apart puntje en meng door en neer te pipetteren. Laat het mengsel bij kamertemperatuur drogen.
      Opmerking: Goed gedroogde monsters moeten bestaan ​​uit lange naaldvormige kristallen wijst naar het midden van de vlek. Als de aanbetaling is kleverig en / of morsig het monster kan ofwel te worden geconcentreerd of bestaan ​​uit zouten, zoals deposito's zijn waarschijnlijk niet goed spectra te produceren en het monster moet verder worden gezuiverd.
    2. Introduceer het doel plaat in de MS bron en werken in positieve (+ ive) ion-modus. Gas terugnemen spanning tot 19,0 kV bij ionenbron 1 en 16,3 kV bij ionenbron 2. Stel het laservermogen tot meer dan 70%. Selecteer het monster plek op de MALDI-target bord en klik op Start om laserpulsen te beginnen.
      Let op: Alle ruimtes van het doel zal geen signalen opleveren. Een bepaalde plaats slechts een signaal voor een paar laserpulsen gevolg van hetzijuitputting van het monster / matrix mengsel of kenmerken van het kristal.
      1. Verplaats de laser naar verschillende gebieden van het doel tijdens acquisitie en gemiddeld ongeveer 200 willekeurig spectra voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen.

5. ESI-MS-QTOF

  1. Analyseer-endoxylanase gegenereerde oligosachariden (native) met behulp van nano-HPLC in combinatie met een elektrospray ionisatie (ESI) quadrupool time of flight (QTOF) MS instrument met online chromatografische scheiding met behulp van een RP C-18-kolom (75 urn x 150 mm; 3,5 urn kraal grootte).
    1. Breng de endoxylanase-gegenereerde waterige oligosacchariden mengsel in een flesje en plaats in de HPLC autosampler. Programmeer de elutiegradiënt van 5-80% met de mobiele fase 0,1% (v / v) mierenzuur in water en 0,1% (v / v) mierenzuur in acetonitril, respectievelijk, over 60 min.
    2. Stel het debiet tot 0,2 pl / min. Pas de positieve-ion modus in de scan rangevan 300-1,600 m / z en een scan-snelheid van 0,5 scans / seconde met behulp van de ESI bron voorwaarden als volgt: gordijn gas 10, GS1 4, bron temperatuur van 100 ° C, ion spuiten spanning 2300 V, en de-clustering potentieel 50 V. Run de LC chromatografische programma en elueer oligosacchariden. De resulterende totale ion chromatogram (TIC) wordt automatisch opgeslagen door de software.
    3. Open de opgeslagen TIC en kies extract chromatogram. Typ de verwachte massa's (bijvoorbeeld 271, 403, 535, 667, 799 en 931 m / z) op de opdrachtregel. Scan chromatogram door te klikken op Enter. Verwerk de geselecteerde ionen scans van de ESI-QTOF MS chromatogram gegevens met software volgens de instructies van de fabrikant 14.

6. ESI-MS n

  1. Plaats 1-2 pl per-O-gemethyleerde oligosaccharide (gemethyleerd zoals beschreven door Pettolino et al. 1) monster in 50% acetonitril in een nanospray spuitkop en een spuit. trimmennano-spuittip met een glazen mes te passen in de discrete nano-nevel houder naar het MS.
  2. Stel de massa volgens de verwachte massabereik (200-1,500 m / z) en gordijn gas 10, Ionenspray spanning van 1900 V en polariteit positief.
  3. Druk op de knop verwerven om relevante venster te openen, voert u de gegevens bestandsnaam tot een totaal ion scan (ESI-MS 1) te verkrijgen. Druk vervolgens op de STOP-knop.
  4. Wijzig scan soort van product ion tot een piek van belang fragmenteren. Voer de massa van belang (bijvoorbeeld, 885 m / z) te fragmenteren en aanpassen van de massa-range (200-900 m / z). Druk op de knop verwerven en pas de botsingsenergie (boven en / of naar beneden op het tabblad verbinding) om hele versnippering van de ouder-ion (885 m / z) te bereiken en het verwerven van een fragment ion scan (ESI-MS 2).
  5. Voer de massa van fragment ion van belang (bijvoorbeeld, 711 m / z) en stel de massa-range (200-720 m / z). Druk op de knop Acquire eend de botsingsenergie aanpassen om volledige fragmentatie van precursorion (711 m / z) bereiken en het verwerven van een fragment ion scan (ESI-MS 3).

7. 1 H NMR spectroscopie

  1. Ontbinden endoxylanase gegenereerde mengsel van oligosachariden (KOH-sol, natuurlijke vorm) (~ 500 ug) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in een plastic reageerbuis (15 ml). Bevries de suspensie bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren suspensie in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen.
  2. Herhaal 7,1 maal om de H 2 O volledig uitwisselen D 2 O.
  3. Oplossen gedroogd oligosacchariden in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) en voeg 0,5 pl aceton (5% in D 2 O) als interne standaard. Breng de gedeutereerde oligosacchariden in de NMR-monsterbuis.
  4. Houd de NMR-buis met monster door de top en steek de monsterbuis in een plastic spinner. Plaats de spinner in de steekproef dieptemeter. Push of trek de monsterbuis om de diepte van het monster aan te passen zodat de hartlijn van het monster bovenste en onderste dieptemeter gelijk.
  5. Verwijder de dieptemeter en plaats het monster in de autosampler aangesloten op een 600 MHz NMR-spectrometer uitgerust met een cryo-sonde.
  6. Inloggen open spectrometer besturingssoftware. Voer de naam voorbeeld bestand. Open een bestaande dataset en vervolgens de opdracht "edc" om het op te slaan onder een nieuwe naam. Typ het positienummer van het monster in de auto-sampler en druk op "ENTER".
    Opmerking: Door op de knop "ENTER" zal voorzichtig de monsterbus dalen tot de magneet boring waar het op de top van de sonde zal worden gepositioneerd.
  7. Stel de gewenste temperatuur van het monster door het intikken van "edte" op de opdrachtregel. Wacht tot de temperatuur van het monster op de gewenste waarde te bereiken voordat u verder gaat met de volgende stap. Voer "lock" op de opdrachtregel en kies geschikt oplosmiddel (D 2 O). Wacht op de " lock afgewerkte "boodschap verschijnt aan de onderkant van het venster.
  8. Typ "atmm" op de opdrachtregel en klik op "optimaliseren" aan de bovenkant van de atmm menubalk. Kies start voor het afstemmen en de matching van de sonde voor het geselecteerde kanaal (1 H in dit geval).
  9. Typ "topshim" op de opdrachtregel voor de shimming proces waarbij kleine aanpassingen zijn gemaakt om het magnetisch veld tot uniform magnetisch veld het signaal wordt bereikt rond de sample.Acquire door het intikken van "zg" op de opdrachtregel en voer.
  10. Analyseren spectra gebruik van software 15 volgens de instructies van de fabrikant met 1H chemische verschuivingen gerefereerd als interne standaard aceton bij 2,225 ppm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Endoxylanase digestie van 2AB gelabelde W-sol AXs genereert een mengsel van 2AB gemerkte RE oligosacchariden en een serie-un gemerkte (zonder 2AB label) Oligosacchariden afgeleid van de inwendige gebieden van het xylaan keten (figuur 1, van Ratnayake et al. 2). Een reeks chromatografische methoden wordt vervolgens gebruikt voor het complexe mengsel van isomeren fractioneren. Tenslotte worden MS-technieken gebruikt om de isomere structuren die vervolgens gesequenced door MSn technieken te identificeren. Hier presenteren we een vertegenwoordiger, in plaats van uitgebreide, voorbeeld van de aanpak.

De signalen in de MALDI-TOF-MS spectrum van Oligosacchariden afgeleid van 2AB gemerkte natieve W-sol AXs (Figuur 2A) een veel voorkomt pseudo-molecuulion serie bij m / z 701, 833 en 965 die een reeks ongelabelde neutrale interneregio oligosacchariden met 5-7 pentosyl resten (P 5-7), respectievelijk. Een reeks signalen bij m / z 745, 877, en 1009, duiden dat een ongemerkt zure oligosaccharide serie met 4-6 P + 1 hexa (hexuronzuur), is ook aanwezig in deze fractie (Figuur 2A). Pseudo-moleculaire ionen bij m / z 821 en 953 de aanwezigheid van de gemerkte 2AB originele RE oligosacchariden P 5-6 + 2AB, respectievelijk.

ESI-QTOF-MS analyse van de natieve oligosacchariden met een on-line chromatografische fractionering van oligosacchariden door RP C-18 HPLC wordt vervolgens uitgevoerd. Figuur 2B en 2C, toont het geselecteerde ion scans, opgehaald van de ionen ESI-QTOF-MS chromatogram (TIC), van oligosachariden vrijgegeven door endoxylanase van w-sol Fr AXs. De signalen omvatten een pseudo-molecuulion series toegewezen als [M + NH4] + bij m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224 en 1356 wat neerkomt op een reeks interne regio neutrale oligosachariden met 5-10 pentosyl resten (P 5-10), respectievelijk (Figuur 2B). Verschillende isomere structuren mogelijk dat een oligosaccharide met een gedefinieerde massa (zie hieronder ESI-MS n analyse). Vandaar de meervoudige pieken voor elk van de moleculaire ion scans mogelijk zoals waargenomen in Figuur 2B. Pseudo-moleculaire ionen toegewezen als [M + H] + bij m / z 271, 403, 535, 667, 799 en 931 de aanwezigheid van een 2AB RE gelabeld oligosaccharide serie P 1-6 + 2AB, respectievelijk (figuur 2C) . De signalen gedetecteerd als [M + H] + ionen bij m / z 613, 745, 877, 1009, 1141 en 1273 wijzen op de aanwezigheid van een zure Oligosacchariden met 3-8 P + HEXA 1, respectievelijk (figuur 2C). In de commelenid eenzaadlobbigen kan het xylaan backbone ook gesubstitueerd met fenol- zuren,voornamelijk ferulinezuur (en ook p -coumaric zuur), die dezelfde moleculaire massa zoals glucuronzuur heeft en in W-sol AXs tarwe endosperm celwanden worden gedetecteerd. Echter, een nadere analyse van W- en KOH-sol AXs met behulp van ESI-MS n (en compositorische analyse door GC-MS van TMS-derivaten volgende methanolyse, hier niet weergegeven) bevestigen de zure oligosacchariden met P 3-8 + hexa 1 in tarwe endosperm AXs.

De signalen toegewezen als [M + H] + ionen van ESI-Q-TOF volledige scan spectrum van het gebied tussen 3,10-3,48 min (figuur 2D) omvat de reeks 2AB gelabelde oligosacchariden RE: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 en 1195 (P 1-8 + 2AB, respectievelijk). Een reeks pseudo-moleculaire ionen in de ESI-Q-TOF volledige scan spectrum van het gebied tussen 3,59-4,05 min (figuur 2E) vertegenwoordigt de intern gebied zure oligosacchariden observerend zowel [M + Na] + -ionen: m / z 613, 745, 877, 1009 en 1141 (P 3-7 + HEXA 1 respectievelijk) en [M + NH4] + -ionen: m / z 740, 872, 1004, 1136 en 1268 (P 4-8 + hEXA 1 respectievelijk).

Om de individuele oligosacchariden sequentie, voerden wij ESI-MS n op de per-O-gemethyleerde oligosachariden plaats op natieve oligosacchariden verkregen W-sol en KOH-sol AXs omdat het een uitdaging ondubbelzinnig structuren instellen door sequencing natieve oligosacchariden . Daarnaast vereist ook grotere hoeveelheden materiaal. Methylering van de oligosacchariden werd uitgevoerd zoals beschreven door Pettolino et al. 1. De ESI-MS n onderzoeken uitgevoerd op de RE neutrale oligosaccharide alditolen afgeleid van KOH-sol AXs en 2AB gelabeld neutrale RE oligosaccharide afgeleid van W-sol AXs beschreven Below als voorbeeld om te helpen bij de interpretatie van de spectra en structuren afgeleid. Dezelfde benadering kan worden toegepast op alle oligosacchariden gegenereerd door enzymatische hydrolyse. De fragment-ionen in de ESI-MS n spectra werden geïdentificeerd als Y en B ionen volgens Domon & Costello. 16 Un-gemethyleerd hydroxylgroep (en) die tijdens gasfase fragmentatie van per-O-gemethyleerd oligosachariden in MS n heeft een 14Da massaverschil "litteken" die kunnen worden gebruikt om de vertakking en de glycosyl sequenties. 12-13 elk litteken gegenereerd door fragmentatie gebeurtenis te identificeren wordt gemarkeerd als een ononderbroken lijn (figuren 3 en 4). Aangezien verscheidene isomere structuren mogelijk zijn voor een bepaalde massa, daarna in deze isomere structuren, Y en B ionen worden gelabeld in rood en zwart, respectievelijk.

De ESI-MS 2, ESI-MS 3 en ESI-MS 4 SPECTra van per-O-gemethyleerde RE neutrale oligo-glycosyl alditol gegenereerd uit de fragmentatie van de pseudo-molecuulion m / z 885 (P4 + Xyl ol) is weergegeven in figuur 3. ESI-MS 2-spectrum omvat de overvloedige Y ionen bij m / z 711, 551 en 391 gegenereerd door het verlies van één, twee en drie pentosyl residuen respectievelijk het moederion. De overvloedige m / z 711 ion kan worden gegenereerd door ofwel het verlies van een niet-reducerende uiteinde Xyl rest of door het verlies van een terminale zijketen Ara residu. De diagnostische Y m / z 391 ion in het resulterende spectrum kan worden gegenereerd uit het verlies van drie niet-reducerende uiteinde Xyl residuen van de RE oligosaccharide met een zijketen Ara residu op de RE Xyl ol residu of RE oligosaccharide met een heeft, heeft zijketen Ara residu op de 2e Xyl residu van de RE Xyl ol residu. Hoewel er een formele mogelijkheid dat andere structuren, zoalsXyl 4 -Xyl ol, en (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol zou aanleiding geven tot deze geven fragmention deze structuren worden buiten beschouwing gelaten als de specificiteit van het endo-xylanase gebruikt voor de polysaccharide ofwel zou degraderen of niet hechten aan de glycosidische binding naast een vertakkingspunt respectievelijk splitsen. Dienovereenkomstig kan de diagnostische Y m / z 551 ion gegenereerd uit het verlies van twee niet-reducerende uiteinde Xyl residuen van de RE oligosaccharide waarvan de zijketen Ara residu heeft op ofwel de RE Xyl ol residu of RE oligosaccharide die zijde keten Ara residu op de voorlaatste Xyl residu. Aldus zijn vier mogelijke isomere structuren voorgesteld (Figuur 3: I, II, III en IV). De overvloedige Y ionen m / z 377 (zie Figuur 3: Ia en IIa) en B ionen m / z 503 (zie Figuur 3: Ia, Ib, IVa en IVb) afkomstig van verdere fragmentatie isomere precursor m/ z 711 ion worden ook waargenomen in het spectrum. ESI-MS 3 spectrum (figuur 3) geregistreerd door de fragmentatie van isomere precursor m / z 711 ionen bevatte een grote piek bij m / z 537 (Y ionen van P 2 + Xyl ol met twee littekens, gegenereerd uit de precursorion Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa en IVb) en m / z 391 (Y ion van P 1 + Xyl ol met een litteken, gegenereerd op basis van de voorloper ion IIb, IIIa, IIIb, IVa en IVb). Deze twee hoofdpieken (m / z 537 en m / z 391) kan worden gegenereerd door het verlies van één en twee niet-reducerende terminale Xyl residuen respectievelijk het isomere precursor m / z 711 ion gegenereerd uit de fragmentatie van de pseudo -Molecular moederion m / z 885 (P + 4 Xyl ol) tijdens ESI-MS 2. Relatief lagere overvloed pieken bij m / z 377 (Y ionen van P 1 + Xyl ol met twee littekens, gegenereerd uit de precursor ion Ia en IIa) en 551 (Y ionen van P + 2 Xyl ol met een litteken, gegenereerd uit de precursorion Ib en IIb) werden ook waargenomen in dit spectrum.

De ESI-MS 4 van de versnippering van de isomere precursor m / z 551 ionen bevatte een grote piek bij m / z 377 (Y ion van P 1 + Xyl ol met twee littekens) en m / z 391 (Y ion van P 1 + Xyl ol met een litteken) afkomstig van het precursorion van structuur I en II. Daarom is de collectieve bewijs suggereerde dat de RE glycosyl reeks bestaat uit de Ara zijketen gehecht aan de RE Xyl ol residu (diagnostische fragmentatie pad m / z 885 → 711 → 551 → 391 Figuur 3II), Ara zijketens bevestigd aan beide RE Xyl ol en de voorlaatste (1 st Xyl residu van RE Xyl ol) Xyl residu (diagnostische fragmentatie pad m / z 885 → 711 → 537 → 391 Figuur 3III), Ara zijketen bevestigd aan de voorlaatste (1 st Xyl van RE Xyl ol) Xyl residu (diagnostische fragmentatie pad m / z 885 → 711 → 537 → 377 Figuur 3I) en de Ara zijketen bevestigd aan de 2 e Xyl residu van de RE Xyl ol (figuur 3iV).

De aanwezigheid van deze ionen bevestigt de voorgestelde isomere structuren I, II, III en IV en de neutrale RE oligosaccharide structuur: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.

ESI-MS spectrum van 2 per-O-gemethyleerd 2AB gelabeld oligosaccharide RE gegenereerd uit de Fragmentatie van de quasi-moleculaire [M + Na] + ion bij m / z 871 (P + 4 2AB) wordt getoond in Figuur 4. Dit spectrum bevat de meest voorkomende Y ion bij m / z 697 (P + 3 2AB met één litteken), m / z 537 (P2 + 2AB met één litteken) en m / z 377 (P 1 + 2AB één litteken), gegenereerd door het verlies van één, twee of drie niet-reducerende pentosyl resten hebben. De m / z 697 ion kan worden gegenereerd door ofwel het verlies van een niet-reducerende uiteinde Xyl rest of door het verlies van een terminal Ara residu dat het m / z 537 ion echter alleen mogelijk door het verlies van twee eindstandige Xyl residuen . De diagnostische fragmentatie pad (m / z 871 → 697 → 537 → 377) suggereerde dat de aanwezigheid van lineaire niet-vertakte xylaan backbone oligosaccharide (s) en RE overeenkomt met het quasi-molecuulion m / z 871 (P4 + 2AB ). Echter, de lineaire niet-vertakte xylosyl backbone (P 4 + 2AB) is susceptible naar site specifieke endoxylanase voor verdere spijsvertering. Daarom kunnen twee isomere m / z 697 ionen bestaan. Dienovereenkomstig twee mogelijke isomere structuren voorgesteld (Figuur 4: I en II). In deze isomere structuren Y en B ionen worden gelabeld in rood en zwart, respectievelijk. De ESI-MS 3 spectrum opgenomen van de versnippering van isomere precursor m / z 697 ion genereert m / z 523 ion (Y ion van P 2 + 2AB met twee littekens; Figuur 4, structuren Ia, Ib, IIa en IIb), m / z 363 ion (Y ionen van P 1 + 2AB twee littekens Figuur 4, structuur IIa) en Y ion bij m / z 377 (P + 1 2AB met een litteken Figuur 4, structuren Ia en Ib). Het fragment ion bij m / z 377 kan alleen ontstaan ​​uit de voorgestelde structuur I en het fragment ion bij m / z 363 kan alleen ontstaan ​​uit de voorgestelde structuur II. De gelijktijdige aanwezigheid van deze twee ionen bevestigt de voorgestelde structuren I en II. Dus de RE glycosyl sequentie van het xylaan keten van tarwe endosperm AXs bestaan ​​uit een Ara tak aan de RE Xyl residu (fragmentatie traject m / z 871 → 697 → 523 → 363) en / of voorlaatste Xyl residu (fragmentatie traject m / z 871 → 697 → 523 → 377).

NMR-analyse van de AXs

MS-gebaseerde analyses geven geen informatie over zowel de anomere configuratie (α / β) of D / L-configuratie van de suikers die wordt verkregen door andere benaderingen, zoals enzymatische en fysische (bijvoorbeeld NMR). Voor heteroxylans met de karakteristieke RE verlaagde tetrasaccharide (Xyl-Rha-GALA-Xyl ol), het NMR-spectrum bevat anomere signalen die tot de identificatie en sequentiebepaling van het RE oligosaccharide. We beschrijven het gebruik van 600 MHz 1D 1 H-NMR-spectroscopie als een enkele stap methode detHermelijn totale glycosyl sequentie van tarwe endosperm AX RE oligosaccharide op KOH-sol Fr, waaronder de anomere configuratie (α / β) en de D / L-configuratie van de suikers. Resonanties werden toegekend op basis van gepubliceerde opdrachten tarwe AX oligosacchariden 17-18 (figuur 5, tabel 1). Het 1H-NMR spectrum van de AX uit tarwe endosperm wordt gedomineerd door de anomere chemische verschuivingen bij 5,39, 5,27 en 5,22 ppm dat voor het proton van een terminale α-L-Ara f residu wordt toegekend, bevestigd aan o-3 positie (T-α-L-ara f → 3 S) van de enkelvoudig vertakte (1,4) -β-Xyl p backbone residuen en zowel O-3 en O-2 posities (T-α-L-ara f → 3 D en T-α-L-Ara f → 2 D) dubbel vertakt (1,4) -β-Xyl p backbone residuen respectievelijk (Figuur 5 en Tabel 1).

f → 3 S + D) H1 signaal α-L-Ara f zijketen aan de O-3 positie van de enkelvoudig vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D-Xyl p. Het signaal aan 5,29 is toegewezen aan de (T-α-L-ara f → 3 D + D) H1 signaal α-L-ara f zijketen gehecht aan de O-3 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D-Xyl p. het signaal aan 5,24 is toegewezen aan de (T-α-L-Ara f → 2 D + D) H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-2 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D-Xyl p.

Figuur 1

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figuur 1. Samenvatting van Experimentele Aanpak Een samenvatting van de strategie die werkzaam zijn in het genereren, het zuiveren en het sequencen van het reducerende einde (RE) en intern gebied oligosacchariden. tarwe endosperm arabinoxylanen (AXs) wordt getoond. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van Ratnayake et al. (2014) 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. MALDI-TOF MS (A) en ESI-QTOF MS (B - E) analyse van natief oligosachariden vrijgemaakt door endoxylanase van 2AB gemerkte W-sol AXs zoals geschetst in figuur 1. MALDI-TOF MS spectrum: (A) ( de signalen a opnieuw geïdentificeerd als [M + Na] + adduct ionen); Geselecteerde ion scans van de ESI-MS chromatogrammen QTOF: B = P 5-10 verkregen uit intern gebied oligosachariden (De signalen worden geïdentificeerd als [M + NH4] + adduct ionen); C = P + 1-6 2AB afgeleid van RE oligosachariden (De signalen worden geïdentificeerd als [M + H] + adduct ionen) P & G 3-8 afgeleid van zure oligosacchariden (De signalen worden geïdentificeerd als [M + Na] + adduct ionen); D = ESI-Q-TOF full scan spectrum: gebied tussen 3,10-3,48 min, E = ESI-Q-TOF volledige scan spectrum: gebied tussen 3,59-4,05 min (De signalen worden geïdentificeerd als zowel [M + Na] + en [M + NH4] + -ionen adduct ); P = pentosyl eenheid (ofwel Ara of Xyl); G = uronosyl residu (GlcA); RE = reducerende einde oligosachariden; 2AB = 2 aminobenzamide; EIC: gewonnen ion chromatogram. ad / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. De ESI-MS 2, ESI-MS 3 en 4 ESI-MS spectra van per-O-gemethyleerde RE neutrale glycosyl alditol (P + 4 Xyl ol) - m / z 885. De signalen worden als [M toegewezen + Na] + pseudo-molecuulion adducten. Aangezien verscheidene isomere structuren voor een bepaalde massa mogelijk zijn dan in isomere structuren Y en B ionen worden gelabeld in rood en zwart, respectievelijk. Elke "scar" gegenereerd door de versnippering evenement wordt gemarkeerd als een ononderbroken lijn. X = xylosyl residu; A = arabinosyl residu. De ESI-MS 3 spectra werden opgenomen met toestemming van Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. De ESI-MS 2 en ESI-MS spectra 3 van per-O-gemethyleerd 2AB gemerkte RE neutraal oligosacharide (P + 4 2AB) - m / z 871. De signalen worden als [M + Na] + toegewezen pseudo -Molecular ion adducten. Aangezien verscheidene isomere structuren voor een bepaalde massa in isomere structuren zijn mogelijk, worden Y en B ionen geëtiketteerd in rood en zwart respectievelijk. Elke "scar" gegenereerd door de versnippering evenement wordt gemarkeerd als een ononderbroken lijn. X = xylosyl residu; A = arabinosyl residu. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van Ratnayake et al. (2014) 2. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.

figuur 5
Figuur 5. Anomere gebied van 600 MHz 1D 1 H-NMR-spectrum van de AX oligosacchariden die door endoxylanase behandeling van de KOH- Sol Fr. 1 H chemische verschuivingen gerefereerd als interne standaard aceton bij 2,225 ppm. T-α-L-ara f → 3 S: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-3 positie van de enkelvoudig vertakte β-D-Xyl p residu; T-α-L-Ara f → 2 D: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-2 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu; T-α-L-ara f → 3 D: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-3 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu; T-α-L-ara f → 3 S + D: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-3 positie van de enkelvoudig vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-2 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D -Xyl p; T-α-L-ara f → 3 D + D: H1 signaal α-L-ara f zijketen aan de O-3 positie van de dubbel vertakte β-D-Xyl p residu met aangrenzende dubbel vertakte β-D -Xyl p; 2-α-L-Ara f → 3 S: H1 signaal van 2-α-L-Ara f zijketen residu aan de O-3 positie van de enkelvoudig vertakte β-D-Xyl p residu; Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.

suikerresiduen H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 eq / C-5 H-5 ax / C-5
T-α-L-Araf → 3 S 5,396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-Araf 5,415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-Araf → 2 D 5,223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-Araf → 2 D + D 5,243 / 4.16 3.98
T-α-L-Araf → 3 D 5,272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-Araf → 3 D + D 5,298 / 4.18 3.96
2-α-L-Araf → 3 S 5,548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
a-Xylp (Vermindering) 5,185 / 91.9 3.55 3.72
ß-Xylp (Vermindering) 4.580 / 96,6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
P -4-Xylp + S 4,461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4,448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
P-3,4-Xylp 4,518 / 3.44 3.85
S + β-3,4-Xylp 4,514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4,505
P-3,4-Xylp + S 4,492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4,482 3.45 3.74
P-2,3,4-Xylp 4,638
S + β-2,3,4-Xylp 4,627 3.59 3.87 3.88
D + β-2,3,4-Xylp 4,616
P-2,3,4-Xylp + S 4,593
β-2,3,4-Xylp + D 4,593
Chemische verschuivingen zijn ten opzichte van intern aceton gemeld, ó 2,225.
S = Afzonderlijk vertakt β-Xylp
S + D = Singly vertakt β-Xylp + Dubbel vertakt β-Xylp
D = Dubbel vertakte β-Xylp
D + D = Dubbel vertakt β-Xylp + Dubbel vertakt β-Xylp

Tabel 1. 1 H-NMR-signalen van de xylo-oligosacchariden die door endoxylanase behandeling van tarwe endosperm KOH-sol Fr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meeste matrix fase celwandpolysacchariden hebben schijnbaar willekeurig vervangen backbones (met zowel glycosyl en non-glycosyl residuen) die zeer variabel zijn, afhankelijk van de plantensoort, ontwikkelingsstadium en weefseltype 3. Omdat polysachariden secundaire genproducten de sequentie niet template afgeleid en er dus geen enkele analytische benadering, zoals bekend van nucleïnezuren en eiwitten voor hun sequencing. De beschikbaarheid van gezuiverde linkage-specifieke hydrolytische enzymen verschaft een krachtig hulpmiddel om polysacchariden oligosacchariden die vervolgens chromatografisch gefractioneerd kan worden afgebroken, en bij gebruik in combinatie met chemische en fysische technieken volledige sequentie. De uitdaging is om dan weer in elkaar deze complexe mengsels in de oorspronkelijke polysaccharide sequentie- die nog succesvol worden aangepakt.

Hier beschrijven we een aanpak (waarvan de volgorde van toepassing can zijn gevarieerd), die is gebaseerd op de integratie van de gevestigde enzymatische, chemische en fysische technieken voor de structurele karakterisering van zowel het reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans. Een extra aanvullende techniek die hier niet beschreven dat erg nuttig is gebleken voor het karakteriseren van oligosachariden is PACE (polysaccharide analyse door koolhydraten gelelektroforese) ontwikkeld door de Dupree 19-groep en het kan gemakkelijk worden geïntegreerd in dit protocol als de apparatuur beschikbaar is. Bovendien variaties op de LC chromatografie kan ook nuttig zijn, zoals tandem inline hilic (HILIC) gevolgd door RP chromatografie de mogelijkheid te bieden na zowel ongecodeerde / hebben oligosacchariden in één stap. De technieken afhankelijk tagging (met 2 aminobenzamide (2AB)) het reducerende einde (RE) van de heteroxylan keten vóór enzymatische (endoxylanase) hydrolyse. Twee verschillende benaderingen (zie samenvatting inFiguur 1) worden aangenomen. In de eerste, intact W-sol AXs behandeld met 2AB de oorspronkelijke RE hoofdketen suikerrest label en vervolgens behandeld met een endoxylanase aan een mengsel van gelabelde 2AB RE en intern gebied reducerende oligosacchariden, respectievelijk genereren. In een tweede benadering de KOH-sol Fr wordt gehydrolyseerd met endoxylanase eerst genereren van een mengsel van oligosacchariden die vervolgens gelabeld met 2AB. In dit laatste scenario de oorspronkelijke RE van de KOH-sol AX niet wordt gemerkt met 2AB aangezien de glycosyl-alditol tijdens de alkalische extractie het reductiemiddel natriumboorhydride (NaBH4) bevatte was verminderd. Daarom is de 2AB gelabelde oligosacchariden gegenereerd na digestie xylanase zullen afkomstig zijn van "interne" oligosachariden en de originele RE oligosaccharide een RE alditol zonder 2AB tag bevatten (zie figuur 1). Deze benadering kan ook worden toegepast op andere soorten polysachariden uzingen (indien beschikbaar) de juiste endo-hydrolasen.

De MS-gebaseerde benadering wordt aanzienlijk verbeterd door methylering van de oligosacchariden gegenereerd nadat endoxylanase behandeling omdat de niet-gemethyleerd hydroxylgroep (en) die tijdens gasfase fragmentatie van per-O-gemethyleerde oligosachariden in MSn biedt 14Da massaverschil "litteken "die kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij de identificatie van de vertakking en de glycosyl sequentie. 5-6 de identiteit van de resten pentosyl (en eventuele suikerrest) niet uit de MS-gegevens alleen maar wel uit een kennis van de samenstelling van het molecuul; indien dit niet beschikbaar is, dan moet de betreffende monosaccharide en linkage analyses worden uitgevoerd voorafgaand aan het maken van deze opdrachten in MS n. Voorts de signalen die overeenkomen met de RE zure oligosaccharide alditol, gegenereerd uit KOH-sol Fr (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) en de characteristic dicot xylaan RE glycosyl reeks (Xyl 2 -Rha-Gala-Xylitol: m / z 761), indien aanwezig, niet in staat zijn te onderscheiden aangezien beide hebben dezelfde moleculaire massa in natieve vorm, maar kan worden onderscheiden van hun MS fragmentatie ( MS n) spectra die het best uitgevoerd op de gemethyleerde oligosacchariden. Tenslotte MS-gebaseerde technieken kunnen geen informatie verstrekken over zowel de anomere configuratie (α / β) van de glycosidische binding of D / L-configuratie van de sugars- deze worden bepaald door alternatieve werkwijzen, zoals enzymatische en fysische (bijvoorbeeld NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
  2. Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
  3. Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
  5. Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
  6. Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
  7. Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
  8. Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82, (13), 372-377 (1980).
  9. Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
  10. Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
  11. Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
  12. Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
  13. Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22, (2012), 439-451 (2012).
  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
  16. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
  17. Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics