Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

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Neuroscience

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Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).

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Abstract

arteríolas parênquima intracerebrais (PAs), que incluem arteríolas parênquima, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares, são os vasos sanguíneos de alta resistência que ramificam para fora das artérias e arteríolas pial e mergulhar no parênquima cerebral. PA indivíduo perfundir um território cilíndrica discreta do parênquima e os neurônios contidos. Essas arteríolas é um jogador central na regulação do fluxo sanguíneo cerebral, tanto globalmente (autorregulação vascular cerebral) e localmente (hiperemia funcional). PAs são parte da unidade neurovascular, uma estrutura que corresponde ao fluxo sanguíneo regional de actividade metabólica no interior do cérebro e também inclui neurónios, astrócitos e interneurónios,. Perfusão através PAs está diretamente ligado à atividade de neurônios em que determinado território e aumentos de chumbo metabolismo neuronal a um aumento na perfusão local causado pela dilatação do feed PA. Regulamento das AP é diferente do melhor caracterizadaartérias pial. vasoconstrição induzida pela pressão é maior nos PAs e mecanismos vasodilatadores variar. Além disso, PAs não recebem a inervação extrínseca dos nervos perivasculares - inervação é intrínseca e indireta na natureza através do contato com endfeet astrocitário. Assim, os dados relativos a regulação contrátil acumuladas pelos estudos utilizando artérias pial não se traduz diretamente para a compreensão da função PA. Além disso, permanece indeterminada como os estados patológicos, tais como hipertensão e diabetes, afetar a estrutura PA e reactividade. Essa lacuna de conhecimento é, em parte, uma consequência das dificuldades técnicas relativas ao isolamento PA e canulação. Neste artigo apresentamos um protocolo para o isolamento e canulação de PAs de roedores. Além disso, mostramos exemplos de experiências que podem ser realizadas com estas arteríolas, incluindo constrição induzida por agonista e reactividade miogénica. Embora o foco deste artigo é sobre PA canulação e Miografia pressão, isolado PAs também pode ser utilizado para estudos bioquímicos, biofísicos, moleculares, e de imagem.

Introduction

A circulação cerebral é organizado exclusivamente para suportar as demandas metabólicas dos neurônios centrais, células que têm limitado as reservas de energia e, consequentemente, eram altamente sensíveis a mudanças na pressão de oxigênio e fornecimento de nutrientes necessários. Como particulares subpopulações neuronais torna ativo quando tarefas específicas são realizadas, a vasculatura promove um aumento altamente localizada na perfusão para evitar hipóxia local e esgotamento de nutrientes 1. Esta é uma forma de hiperemia funcional conhecida como acoplamento neurovascular, e depende do funcionamento adequado da unidade neurovascular, composto de neurónios, astrócitos, activas e artérias cerebrais 2. Arteríolas parênquima intracerebrais, um grupo de vasos sanguíneos que abrangem parênquima, penetrantes e arteríolas pré-capilares, são centralmente importante para esta resposta e é então crítica para estudá-los individualmente a fim de investigar o acoplamento neurovascular 3.

<p class = "jove_content"> arteríolas parenquimatosas são pequenas (20-70 mm de diâmetro interno) vasos sanguíneos de alta resistência que perfundem populações neuronais distintas dentro do cérebro. Ramificação para fora a partir de artérias piais na superfície, arteríolas parenquimatosas penetrar no parênquima cerebral em um ângulo de cerca de 90 para alimentar a microcirculação subsuperfície (Figura 1). Estes arteríolas desempenhar um papel crítico na manutenção da pressão de perfusão adequada, tal como eles são os vasos contendo musculares lisas mais distais que protegem os capilares. Em contraste com a circulação pial superfície, arteríolas parenquimatosas falta ramos colaterais e anastomose, e, consequentemente, são "estrangulamento" da circulação cerebral 4. Como resultado, a disfunção das arteríolas parenquimatosas contribui para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares, tais como comprometimento cognitivo vascular e pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos (também conhecido como acidentes vasculares cerebrais silenciosas ou lacunares). estudos indicade que a disfunção do parênquima arteríolas pode ser induzida por hipertensão essencial 5, stress crónico 6, e é um evento precoce em doença dos pequenos vasos modelo de ratinho genética 7. Oclusão Além disso, induzida experimentalmente das arteríolas penetrantes única em ratos é suficiente para causar pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos, que são de forma cilíndrica, semelhante aos observados em humanos mais velhos 8.

Além dessas distinções anatômicas, mecanismos que regulam a função contrátil diferem entre artérias e arteríolas pial do parênquima. Vasoconstrição Miogênica é maior nas arteríolas parenquimatosas 9, possivelmente devido à falta de inervação extrínseca 10, modos distintos de mecanotransdução 11, e diferenças no Ca2 + intracelular de sinalização 12,13 nas células musculares lisas vasculares. A evidência sugere que os mecanismos vasodilatadores dependentes do endotélio também diferem entre estes vascusegmentos Lar, com artérias do parênquima que exibem uma maior confiança nos mecanismos que envolvem Ca 2+ -activated canais de K + e comunicação eletrotônicos dentro da parede vascular em comparação com fatores difus�eis tais como óxido nítrico e prostaciclinas 14. Portanto, os dados reunidos em experimentos usando artérias pial pode não se aplicam necessariamente a do parênquima arteríolas, deixando uma lacuna no nosso conhecimento sobre o controle local da perfusão cerebral.

Apesar da sua importância, arteríolas do parênquima são vastamente sub-estudado, principalmente devido aos desafios técnicos com isolamento e de montagem para o estudo ex vivo. Neste artigo é descrita uma metodologia para isolar e canular arteríolas do parênquima cerebral, o que pode ser utilizado para Miografia pressão, ou para isolar o tecido por imunomarcação, electrofisiologia, biologia molecular, bioquímica e análise.

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Protocol

1. cânula e Preparação Câmara

  1. Inserir capilares de vidro de borosilicato limpo (diâmetro externo: 1,2 milímetros; diâmetro interno: 0,69 mm, 10 mm de comprimento) nas ranhuras de um puxador de pipeta com um filamento de platina (diâmetro: 100 mm).
  2. Usando as configurações apropriadas, puxar o tubo capilar para gerar uma cânula com uma longa e fina ponta (Figura 2), utilizando um puxador de micropipeta. As definições utilizadas são: Heat - 700, Pull - 100, velocidade - 50, Time - 10.
  3. Inserir uma cânula para o titular da câmara de myograph pressão. Alinhe as cânulas de forma adequada.
  4. Cuidadosamente quebrar as pontas das cânulas, utilizando um fórceps sob o microscópio de dissecação para o diâmetro desejado. Aqui demonstramos uma cânula com uma ponta de 10 uM (Figura 2).
  5. Encha ambas as cânulas com fluido cerebrospinal artificial (aCSF) contendo Ca 2+ 1,8 mM; encher a câmara com Ca 2 + livre aCSF suplementado com soro de bovino a 1%albumina (BSA) + Diltiazem 10 uM (todas as soluções devem ser preparadas antes do início da experiência). Dependendo do tamanho da câmara, variar o volume de aCSF entre 5 a 20 ml. Armazenar a câmara a 4 C até que esteja pronto para começar a canulação.
    NOTA: O diltiazem é um fechado inibidor reversível de cálcio tipo-L de tensão que irá causar a dilatação de arteríolas, que facilita a canulação

2. Isolamento de parenquimatosa Arteríolas

  1. Eutanásia do animal imediatamente antes da dissecção utilizando protocolos padrão no laboratório que são aprovados pelo comitê de cuidados com os animais da instituição. A utilização de barbitúricos ou o dióxido de carbono é preferido, como outros anestésicos comumente utilizados podem ter efeitos vasodilatadores na circulação cerebral 15. Todos os procedimentos com animais mostrados aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade de Nevada School of Medicine, e estão em agreement com os Institutos Nacionais de Saúde "Princípios Orientadores do Cuidado e Uso de Animais".
  2. Eutanásia do animal utilizando dióxido de carbono. Antes de decapitação, garantir que o animal parou de respirar e não responde quando beliscar suas patas.
  3. Decapitar o animal usando uma tesoura afiada (mouse) ou guilhotina (rato). Retire a pele da cabeça do animal e corte ao longo da linha média suturas cranianas usando uma tesoura de ponta fina. Usando uma pinça sem corte (ratinho) ou um alicate óssea remova cuidadosamente os ossos cranianos e expor o cérebro. Remover o cérebro devagar e com cuidado para não danificar artérias pial superfície. Coloque o cérebro em um recipiente cheio com 20 ml de Ca 2 + livre aCSF suplementado com BSA a 1% em gelo.
  4. Encher um prato de dissecação contendo um bloco com gelada isenta de Ca2 + aCSF suplementado com 1% de BSA e transferir o cérebro, com a superfície ventral para cima para este prato (Figura 2A). Coloque o prato sob a dissecçãoTing microscópio (Figura 3A). Pin o cérebro para a almofada com agulhas de calibre 27. Tenha cuidado para evitar a colocação de pinos perto da artéria cerebral média (MCA).
  5. Localizar o Círculo de Willis eo MCA ramificação dela. Usando Vannas mola tesoura afiada e alinhada, cortar um pequeno retângulo ao redor do MCA. Certifique-se de que rectângulo é cerca de 5 mm de espessura ao longo de todo o comprimento da MCA. A parte superior do retângulo deve ser passado o ponto de ramificação do Círculo de Willis (proximal ao Círculo de Willis, Figura 2B, seta).
  6. Usando as tesouras mola Vannas, executar um corte inferior para a profundidade do tecido durante aproximadamente 2-3 mm.
    NOTA: Esta parte é fundamental para um bom isolamento das arteríolas do parênquima, e isso pode levar algumas tentativas para obtê-lo direito. Se o corte é a nota feita a uma profundidade suficiente, as arteríolas parênquima isoladas será curta; se o corte é muito profundo, as arteríolas vai quebrar em seu ponto de ramificação quando a dissecadostecido é removido.
  7. Fixar para baixo o final mais distal da fatia do cérebro para o prato de dissecação com o MCA virada para cima (distal do Círculo de Willis), utilizando os pinos de insetos. Faça uma incisão pouco profunda para cortar a pia perto do pino, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente no córtex cerebral subjacente (caso contrário, os pinos não vai segurar).
  8. Cuidadosamente pegar cada lado da pia com pequenas pinças e começar a descascar a pia do córtex. Se necessário, segurar o MCA, garantindo que a membrana pial circundante não está danificado.
  9. Manter a casca até Pia contendo a MCA é livre a partir do córtex. Note-se que a resistência contra descamação vai aumentar perto do Círculo da Willis. Tenha cuidado extra neste ponto, porque as arteríolas parênquima mais longos será nesta região.
  10. Uma vez que a pia é livre, coloque-o cuidadosamente em cima da almofada no prato de dissecação com a superfície oposta à do parênquima arteríolas virados para baixo (Figura 2B).
  11. <li> Usando Vannas mola tesoura, cortar as arteríolas dissecados livres do MCA, certificando-se as extremidades do navio são cortadas sem rodeios.
  12. arteríolas recolhidos podem ser utilizados para Miografia pressão, a análise molecular, ou o isolamento de músculo liso nativa ou células endoteliais.

Miografia 3. Pressão

  1. Prepare a sutura antes do tempo. Cortar o fio de nylon verde escuro em pedaços de 5 mm e coloque no lado pegajoso de uma fita dupla face em uma placa de Petri. Sob o microscópio de dissecação, separar cada parte nos seus filamentos utilizando uma pinça fina e frouxamente preparar um nó meia-engate simples fazendo passar uma extremidade do filamento para o outro.
  2. Utilizando uma pinça, pegar um nó fora da fita dupla face, tomando cuidado para não agarrá-lo com muita pressão. Puxar o fio de sutura na solução do banho, nó deslizante na cânula e apertá-lo a uma distância a partir da ponta da cânula. Repita esse processo para ter 2 suturas em cada cânula.
  3. Brasão um copomicropipeta com uma solução de BSA a 10% e em seguida enxaguar o excesso de Ca2 + aCSF -livre suplementado com 1% de BSA.
  4. Retire 50 ml de solução para a micropipeta de vidro, puxe uma arteríola do parênquima e transferir para a câmara Miografia pressão. Empurrar o êmbolo com um movimento de fluido para dispensar a arteríola do parênquima para dentro da câmara para evitar que se colem à câmara interna da micropipeta de vidro.
  5. Utilizando duas pinças super fino, abra o lúmen do PA, sendo o cuidado de só tocar o final do navio.
  6. Usando as pinças para prender os bordos da arteríola parenquimatosa, puxar cuidadosamente o navio para a cânula. Puxar o suficiente sobre a cânula de modo a que o recipiente não é no final muito afunilada da cânula (Figura 3A).
  7. Soltar os 2 suturas na cânula e apertá-los a bordo do navio (Figura 3B). Espaço das suturas de distância um pouco sobre o vaso, e puxe para o operador enquanto tighdez lo. Certifique-se de que quaisquer ramos são amarrado antes de fechar a extremidade oposta da arteríola do parênquima.
  8. Ligue câmara em torno e fechar a extremidade oposta da arteríola parenquimatosa como um saco-cego. Para conseguir isso, abra os laços sobre a cânula oposto e passá-lo para o arteriole. Lentamente fechar o nó de tal maneira que a arteríola parenquimatosa vai ser ligada ao lado da cânula. Evite estiramento longitudinal da arteríola. (Figura 3C).
    NOTA: Se o objectivo do estudo é para perfundir as drogas através do lúmen, canular a extremidade oposta, em vez de amarrar da arteríola do parênquima para o lado da cânula. Certifique-se as cânulas não tem nenhum cristais de sal ou acúmulos de internos que bloqueiam o fluxo intraluminal. Regular a taxa de fluxo de forma adequada, a fim de manter a tensão de corte dentro dos níveis fisiológicos. Um estudo realizado por Shih et al. Mostra as taxas de fluxo dentro penetrando arteríolas em ratos 8, e pode servir como um guia inicial para piestudos muito.
  9. Transferir cuidadosamente a câmara para a fase do microscópio para ser utilizado para gravar o diâmetro dos vasos. Fixe a câmara para o palco microscópio, ligando sonda de temperatura e entrada e saídas para perfusão aos tubos corretos. Pressurizar a arteríola para 40 mmHg de pressão intraluminal para arteríolas parenquimatosas do rato ou 50 mmHg para arteríolas de rato, usando um sistema de pressão disponíveis no laboratório (coluna de água, a bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão, etc.). A Figura 4D mostra um exemplo de um bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão para pressurizar o arteríola canulada.
  10. Ligue o sistema usado para detectar alterações no diâmetro (Figura 3E). Ajustar as definições sobre o microscópio, tais como iluminação e contraste, a fim de obter a melhor detecção possível. Idealmente as paredes da arteríola deve ser escuro e translúcido lúmen. Uma vez que a detecção é apropriado, iniciar a gravação de tele experimentar.
  11. Inicie o sistema de superfusão. Lava-se a cânula, pressurizado arteríola parenquimatosa com aCSF quente (37 C) contendo Ca 2+ 1,8 mM durante 15 a 20 min a uma taxa de fluxo entre 3-5 ml / min. Este aCSF não deve conter Diltiazem ou BSA.
  12. Substitua o aCSF regular com 60 mM KCl aCSF para avaliar a viabilidade da preparação. Neste ponto deve PAs exibem 10-20% constrição ao KCl 60 mM. Se o arteriole não contraem nessa medida, remover e canular outra arteriole.
  13. Lavar a KCl 60 mM com aCSF regular. Espere até que geração de tom miogênica espontânea, o que poderia levar até uma hora. Se arteriole não tem tom miogênica até então, substituí-la por outra arteriole.
    NOTA: Miogênica tom é observada como um processo gradual, e por vezes mais lentas, a redução do diâmetro do lúmen do vaso, sem estimulação por agonistas contrácteis ou solução de alta KCl. tom miogênica é calculada pela seguinte formula: (1 - (diâmetro do lúmen ativo / diâmetro luminal passiva)) x 100 5 Uma quantidade apropriada de tom miogênica pode variar de acordo com os tratamentos, distensões, espécie, transgênicos, etc.. Em geral, o tom miogénica fisiológica varia de 15 - 30% 5.

4. Exemplo Experimentos Miografia Pressão: induzida por agonista constrição e Miogênica reatividade

  1. Prepara-se uma série de diluições de um agonista de escolha em aCSF usando concentrações apropriadas. Para o exemplo de corrente foi utilizado o tromboxano A2 agonista do receptor de U46619. Uma solução de estoque de 1 ml de U46619 a uma concentração de 1 mM foi preparada. Transferir 100 ul da solução de 1 mM para um novo tubo contendo 900 jil de aCSF para obter uma diluição de 10 vezes do fármaco, resultando em uma solução contendo 100 uM U46619. Repetir este processo por 6 diluições, que varia de 1 mM a 100 nM para preparar uma curva de concentração-resposta do constrictor.
  2. Adicione otodo o volume da solução que contém o agonista (1 ml para a primeira dose, seguida por 900 ul de todas as doses subsequentes) para 100 ml de superfusing aCSF. Isto irá levar a uma diluição extra de 100 vezes o número de agonista. Assim, as concentrações finais do agonista na gama de banho de 10 pM a 10 uM. Permitir que as arteríolas se a incubar durante ~ 10 minutos em cada concentração, até que atinge um diâmetro luminal de estado estacionário.
  3. Lavar o agonista por superfusing PAs com aCSF sem drogas até que o diâmetro PA está de volta ao valor original. Incubar a arteríola do parênquima em Ca 2 + livre aCSF (sem BSA) suplementado com 10 mM Diltiazem + 2 EGTA mM para induzir a dilatação máxima e gravar diâmetro passiva da arteríola.
  4. Remova o arteriole parênquima da cânula, puxando-o com cuidado para fora, mantendo na extremidade dos laços. Lava-se a câmara de recipiente com água desionizada duas vezes para remover os detritos e excesso de agonista. Encha a câmara com Ca2+ aCSF -livre + BSA e canular outra arteriole. Não é recomendado para executar mais de uma experiência por arteríolas.
  5. Para realizar uma experiência reactividade miogénico, permitir a arteríola parenquimatosa a equilibrar a 40 mmHg de pressão intraluminal até miogénica tom espontâneo é gerado (descrito acima). Reduzir a pressão intraluminal de 5 mmHg e PA permitir a equilibrar durante ~ 5 - 10 min, até diâmetro luminal atinge o estado estacionário. Aumentar a pressão intraluminal por passos usando o intervalo de escolha (por exemplo, de 5 a 140 mmHg, em incrementos de 20 mmHg).
  6. Não exponha o arteriole à pressão intraluminal inferior a 5 mmHg, como que poderia causar o colapso e danificar o endotélio, alterando assim os resultados do experimento.
  7. No final da curva de pressão, superfuse arteríola parenquimatosa com Ca 2 + livre aCSF (sem BSA), suplementado com 10 uM de diltiazem + EGTA 2 mM e repetir as etapas de pressão, a partir da Lowesa pressão t.
    NOTA: Isto vai dar os diâmetros passivos do PA, que são necessários para calcular% tom miogênica, definidos pela fórmula:% de tom = (1 - (diâmetro ativa diâmetro / passivo)) x 100.

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Representative Results

A Figura 5A mostra uma constrição representante das AP de ratinho a 60 mM de KCl aCSF para avaliar a integridade da preparação. AP deve constrição entre 15 - 30% na presença de KCI 60 mM. Se a constrição é inferior a 15%, o PA e descartar canular uma outra, uma vez que sugere que a arteríola foi danificado durante o processo de isolamento e a canulação.

A Figura 5B ilustra PA constrição para concentrações crescentes do tromboxano A 2 U-46619 análogo (10 pM a 1 uM) para o banho de superfusing. A constrição foi observada como uma redução no diâmetro do lúmen após incubação com cada concentração. A PA foi deixada equilibrar a concentração de cada um durante 10 minutos. Estes dados podem ser analisados ​​e apresentados como uma alteração no diâmetro (ΔDiameter) ou como uma vasoconstrição% ao KCl, o que normaliza a Change em diâmetro pela constrição máxima ao KCl 60 mM.

A Figura 6 mostra um traçado representativo do diâmetro do lúmen de um PA num experimento reactividade miogénica. Stepwise aumento da pressão intraluminal, provoca uma constrição gradual do AP na presença de 1,8 mM de Ca2 + extracelular (Figura 6, inferior rastreio). A incubação da mesma PA com aCSF sem Ca 2+ e suplementado com 10? M + Diltiazem EGTA 2 mM abole a geração de tom miogénico, e o diâmetro do lúmen dos PA aumenta de acordo com a pressão intraluminal (Figura 5, o traçado superior), que é o passivo do diâmetro do lúmen da arteríola.

figura 1
Figura 1: Esquema de parênquima Arteríolas. ramo PAs fora do pi superfícieal artérias e mergulhar no parênquima cerebral subjacente. Cada PA perfunde uma pequena população neuronal no seu território colunar (regiões realçado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Isolamento do mouse Cerebral PAs A) Imagem do cérebro com a superfície ventral para cima mostrando o Círculo de Willis (seta 1) e do MCA ramificando-se a partir dele (seta 2). B) Imagem do MCA com o tecido cerebral subjacente. A seta aponta para a região mais proximal do MCA do Círculo de Willis. C) PAs que ramificam para fora da MCA (setas). Bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3
Figura 3: A canulação do mouse PAs A) imagem isolada de um PA canulada, mas ainda não amarrado com as suturas.. Esta imagem ilustra o comprimento do PA para ser inserido na cânula antes de o fechar com as suturas. B) O PA está encerrada na cânula com 2 suturas para garantir que ele não vai deslizar para fora da cânula após a pressurização. C) Imagem de uma cânula, rato pressurizado PA em uma configuração experimental cego saída. Bar = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Equipamento utilizado em nosso laboratório de experiências PA A) microscópio de dissecação com.fonte de luz. B) controlador de temperatura. C) A bomba peristáltica para superfusão banho de aCSF. Controle Servo D) Pressão, Sistemas de estar Instrumentação. E) Vídeo Dimensão Analyzer (canto inferior direito), monitor (superior direito) e Vídeo Detecção de Bordas sistema carregado em um laptop (à esquerda). F) câmara de pequenos vasos (câmara de alinhamento linear). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: A constrição de PAS induzida por despolarização de KCl e o tromboxano A2 analógico U46619 A) constrição representativas das AP de ratinho a 60 mM de KCl aCSF para avaliar a integridade da preparação.. AP deve constrição entre 15 - 30% na presença de KCI 60 mM. B) U46619 induzida constrição dos PAs; como observado no traçado, U46619 provoca umadependente da concentração constrição dos PAs, observado como uma redução do diâmetro luminal após incubação com cada concentração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:. Reactividade Miogênica de PAs aumento gradual da pressão intraluminal provoca uma constrição gradual do AP na presença de 1,8 mM de Ca2 + extracelular (traçado inferior). Esta constrição induzida por pressão é uma característica de resistência das arteríolas. A incubação da mesma PA com aCSF sem Ca 2+ 1,8 mM e suplementado com 10? M + Diltiazem EGTA 2 mM abole a geração de tom miogénico, e o diâmetro do lúmen dos PA aumenta de acordo com a pressão intraluminal (traçado superior), que é o lúmen passivas diâmetro de the arteríolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

arteríolas parênquima cerebral são arteríolas de alta resistência com poucas anastomoses e ramos que perfundem populações neuronais distintas. Estes vasos sanguíneos especializados são jogadores centrais na auto-regulação cerebrovascular e acoplamento neurovascular através de vasodilatação mediada por astrócitos 1. A importância destes vasos sanguíneos especializados na doença vascular cerebral é conhecida há aproximadamente 50 anos, quando o trabalho pioneiro do Dr. Miller Fisher descreveram as alterações estruturais nas arteríolas do parênquima no território dos infartos lacunares nos cérebros de pacientes hipertensos post-mortem 16 . Estas alterações, aliadas ao comprometimento funcional, podem causar hipoperfusão da matéria branca profunda, um importante fator de risco para desenvolvimento de demências relacionadas-vascular 17. arteríolas do parênquima são funcionalmente distinto de grandes artérias intracranianas e pial assim como arteríolas superfície, d assim acumuladosATA usando estes membros da árvore vascular cerebral não podem ser facilmente extrapolados para a microcirculação do parênquima. Apesar de sua clara importância na manutenção da homeostase cerebral adequada, estudos sobre a fisiologia e respostas funcionais dessas arteríolas têm sido escassos até os últimos anos, principalmente devido a dificuldades técnicas relacionadas com o isolamento e manipulação.

No presente manuscrito descrevemos uma técnica simples e reprodutível para o isolamento e a canulação de arteríolas parenquimatosas para estudos Miografia pressão, a análise molecular, ou para a preparação de músculo liso nativa ou células endoteliais. Além disso, apresentamos dados sobre a utilização desta técnica para investigar regulação miogênica, constrictor, e mecanismos dilatórias nas arteríolas do parênquima. Observamos que estes navios são myogenically ativa, gerando tom miogênica espontânea quando a pressão intraluminal é mantida a um nível constante, bem como alterar a suaestatuto miogênica enfrentando mudanças na pressão intraluminal, um fenômeno bem descrito para artérias de resistência chamados reactividade miogênica 18. Reactividade Miogênica é um factor-chave na regulação da pressão de perfusão no interior do cérebro, mantendo-o constante no flutuações de revestimento pressão arterial sistémica, impedindo assim a perda de perfusão a baixas pressões, ou edema vasogénico a pressões mais elevadas 18. Além disso, mostra-se que estes arteríolas responder às substâncias vasoactivas, como endotelina-1, um importante vasoconstritor endógeno produzido por células endoteliais. Uma das principais limitações da preparação descrita aqui é que, isolando as arteríolas parenquimatosas componentes vitais da unidade neurovascular são perdidos e hiperemia respostas funcionais não pode ser estudado. Outras preparações, tais como fatia cerebral, manter a estrutura da unidade neurovascular intacta e são mais adequados para o estudo de controlo astrocítica de diâmetro arteriolar encefálica 19. HoWever, na preparação fatia cerebral, arteríolas parenquimatosas são não pressurizado e administração exógena de agentes vasoconstritores dependente do receptor é necessário para imitar tónus basal, a fim de estudar as respostas vasodilatadoras. Miografia pressão e a preparação fatia cerebral devem ser considerar complementar para o estudo da microcirculação cerebral.

O protocolo descrito aqui foi adaptada de uma preparação primeiramente descrita por Dacey e Duling em 1982 20, e alterada por Coyne et al. 21. A principal diferença está na técnica de punção utilizado:., Enquanto Dacey e Duling e Coyne et al utilizados dois conjuntos diferentes de pipetas, uma pipeta externa segurando e uma pipeta de canulação intraluminal, nós usamos somente a pipeta intraluminal e deslize manualmente a PA para a pipeta . Esta técnica tem sido utilizada recentemente para realizar estudos em Pas de ratos após isquemia cerebral - reperfusão 22, PAs de Chronratos hipertensos camente 5, entre outros. Em ratos, que utilizaram esta técnica para avaliar sinais de Ca2 + em células do músculo liso PA pressurizadas em condições fisiológicas e acidose por acoplamento PA canulação de microscopia confocal de varrimento de laser para avaliar Ca 2+ ondas e faíscas nas células musculares lisas 13. Nós também testamos vários agentes de acoplamento neurovascular 3 e demonstrou, usando ferramentas farmacológicas em conjunto com potencial de membrana gravações, que cerebrospecific-regulação de canais de potássio dependentes de voltagem K V 1 faz com que um defeito canalopatia-como na doença de pequenos vasos modelo genético 7. Estes exemplos ilustram a viabilidade desta preparação para responder a diferentes questões de investigação.

É importante salientar que o isolamento de PAs cerebrais a partir do tecido cerebral é a etapa mais crítica, como a facilidade de canulação dependerá do número e comprimento de Isola PAsted. Pode demorar algumas tentativas para otimizar o isolamento. Além disso, a curva de aprendizado para canulação pode ser longo e frustrante, e as taxas de sucesso iniciais podem ser tão baixa quanto 50%. No entanto, uma vez que domina, a reprodutibilidade e rendimento desta técnica é alta, e muitas experiências podem ser realizadas em um dia.

Em resumo, o presente manuscrito descreve uma técnica para o isolamento e a canulação de arteríolas do parênquima cerebral. Tal preparação isolado o componente vascular da unidade neurovascular, a manutenção de respostas intactas de arteríolas pressurizados. Estudos utilizando PAs isoladas irá fornecer informações valiosas sobre a circulação do parênquima cerebral, em ambas as condições fisiológicas e patológicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl Fisher Scientific S-640
KCl Fisher Scientific P217
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M-8266
NaHCO3 Fisher Scientific S233
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G2870
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope Olympus SZX7
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Wiretrol 50 μl VWR Scientific 5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter VWR Scientific 28145-477
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Dark Green Nylon Thread Living Systems Instrumentation THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Video Dimension Analyzer Living Systems Instrumentation VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software Living Systems Instrumentation DAQ-IWORX-404
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References

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