Forudsigelse og Validering af Gene Regulatory Elements Aktiveret Under retinoidsyre induceret embryonale stamceller Differentiering

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fosterudviklingen er en flertrinsproces, der involverer aktivering og repression af mange gener. Enhancerelementer i genomet er kendt for at bidrage til vævs- og celletypespecifik regulering af genekspression under cellulær differentiering. Således deres identifikation og yderligere undersøgelser er vigtigt for at forstå, hvordan celleskæbne bestemmes. Integration af genekspression data (f.eks microarray eller RNA-seq) og resultater af kromatin immunoprecipitation (chip) -baseret genom-dækkende undersøgelser (chip-seq) giver mulighed for storstilet identifikation af disse regulatoriske regioner. Funktionel validering af celletype-specifikke enhancere kræver yderligere in vitro og in vivo eksperimentelle procedurer. Her beskriver vi, hvordan aktive forstærkere kan identificeres og valideres eksperimentelt. Denne protokol giver en trin-for-trin workflow, der omfatter: 1) identifikation af regulatoriske områder af Chip-seq dataanalyse, 2) kloning og experimental validering af formodet regulatorisk potentiale af de identificerede genomiske sekvenser i en reporter assay, og 3) bestemmelse af enhancer-aktivitet in vivo ved at måle enhancer RNA transcript niveau. Den præsenterede protokol er detaljeret nok til at hjælpe nogen til at oprette denne arbejdsgang i laboratoriet. Vigtigt er det, kan protokollen let tilpasses til og anvendes i ethvert cellulært modelsystem.

Protocol

1. Enhancer Udvælgelse Baseret på Chip-seq analyse

  1. Download RXR chip-seq rådata fastq fil (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) fra http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Hent og udtrække den ønskede BWA indeksfilen for tilpasning (i vores tilfælde: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    BEMÆRK: Besøg på https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts for mere information om de trin bioinformatik analyse og til at downloade scripts anvendes nedenfor.
  3. Juster eksempel fastq fil til MM10 genom (bruge scriptet: perform_alignment.sh). Dette vil oprette en mappe med en .bam fil og statistikkerne for tilpasning. Alliancefri RXR Chip-seq data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), og det tilsvarende indeks fil (.bai) er tilgængelige her:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    BEMÆRK: BWA er en softwarepakke, der bringer relativt korte sekvenser (f.eks chip-seq resultater) til en sekvens database, såsom muse henvisning genom (f.eks MM10) 13.
  4. Kør script (callpeaks.sh) for peak kald og de ​​novo motiv analyse. Brug .bam fil som input. Scriptet er baseret på Homer findPeaks 14.
    BEMÆRK: De output filer give os oplysninger om det samlede antal af toppe, berigelse af motiverne, den procentdel af baggrunden, og målet sekvenser med motiver osv. (Figur 1). Typisk flere motiver er listet i rækkefølge efter deres betydning.
  5. Restere den # 1 rangeret motiv (NR halv `AGGTCA`) (bruge scriptet: remap_motif.sh)
    BEMÆRK: Som resultat scriptet genererer en .bed fil, der vil vise, hvilken chip-toppe dækker genomiske regioner, der indeholder det kanoniske bindingssted af transkriptionsfaktoren af ​​interesse.
  6. Hent og visualisere resultaterne af den linje RXR chip-seq læser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (også downloade .bai)) og AGGTCA motiv begivenheder (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) ved Integrative Genomics Viewer (IGV) 15 for at identificere formodede RAR / RXR bindingssteder (figur 2 og figur 3).
    BEMÆRK: Integration af forskellige chip-seq data vil bidrage til mere præcist at forudsige god kandidat forstærkere 16,17. Nylige undersøgelser viste, at aktive forstærkere typisk er beriget til P300 og korrelerer med H3K4me1 og H3K27ac, og er placeret i åbne kromatin regioner og dermed vise DNase-I overfølsomhed anbefales også 18-21.
  7. Brug "Definer et område af interesse" i IGV 15 for at opnå 200-400 bp sekvens af genomisk region og bruge disse sekvenser for efterfølgende primer design.

2. Reporter Assay

BEMÆRK: Der benyttes luciferin / luciferase-systemsom en meget følsom reporter assay for transkriptionel regulering. Afhængigt af enhanceraktivitet luciferaseenzymet er produceret som vil katalysere oxidationen af ​​luciferin til oxyluciferin resulterer i bioluminescense, som kan påvises. Som et første skridt bør identificerede formodede enhancersekvenser subklones i en reporter vektor (f.eks TK-Luciferase 22, pGL3 eller NanoLuc).

  1. primer design
    1. Design PCR primere til opformering af 200-400 bp af formodede enhancerregionerne af Primer3 (til rådighed her: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Copy-paste den genomiske sekvens fra IGV der omfatter formodede bindingssted i Primer3 (se trin 1.7). Set produkt størrelsesorden 250 - 300 bp i Primer3.
    3. Godkend PCR primere ved hjælp af UCSC Genome Browser er I silico PCR værktøj (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      BEMÆRK: Denne protokol i et senere trin bruger HindllI og BamHI restriktionsenzymer til kloning. Kontroller, om PCR-amplificeret sekvens som forudsagt af UCSC In-silico PCR værktøj vil indeholde AAGCTT eller GGATCC restriktionssteder (f.eks http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Opnå de nødvendige primere fra en kommerciel leverandør.
  2. PCR-amplifikation af enhancersekvens fra genomisk DNA
    1. Rens skabelon genomisk DNA fra primære celler (f.eks primære embryonale fibroblaster). Brug kommercielle kit til gDNA isolation og følg producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Høj kvalitet af gDNA er væsentlig for en vellykket PCR-amplifikation. Passende BAC-kloner kan anvendes, hvis PCR er ikke let fra gDNA.
    2. Forbered 50 pi PCR-reaktion indeholdende 100 ng gDNA, 5 pi 10 x buffer, 3 pi MgSO4 (25 mM), 5 pi dNTP (2 mM hver), 1,5 pi Fwd primer (10 uM), 1,5 pi Rev primer (10 uM) , 1 pi DNA-polymerase
    3. Indstil PCR-cyklus (2 min 95 ° C, (20 sek 95 ° C, 10 sek 58 - 65 ° C, 18 sek 70 ° C) x25 repeat, 2 min 70 ° C, for evigt 4 ° C). Sæt annealingstemperatur med behandlingen af ​​primeren har forudsagt Tm værdier.
    4. Oprense PCR-produktet med en kommerciel PCR oprensningskit og følge producentens instruktioner.
    5. Introducere restriktionssteder til kloning ved at gentage PCR med primere, som anvendt ovenfor, men tilføjer udhæng på deres 5 'ender (f.eks Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (Hindlll), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
    6. Køre 5 pi af PCR-produktet på agarosegel for at kontrollere for uspecifikke PCR-produkter.
      BEMÆRK: Hvis der registreres flere bands, køre hele PCR-produkt og rense den passende bånd af en kommerciel gelekstraktionskit.
    7. Begrænsning
      BEMÆRK: For at klone insertet opstrøms for TK-promotoren 22 det oprensede PCR-produkt og vektoren (f.eks TK-Luc) bør fordøjet med HindIII og BamHI.
      1. Forbered en reaktionsblanding 50 pi indeholdende 1 ug oprenset PCR-produkt, 1 pi Hindlll (20 U / ul), 1 pi BamHI (20 U / pl) og 5 pi 10 x buffer.
      2. Forbered en 250 pi reaktionsblanding indeholdende 5 ug vektor (TK Luc, eller alternativt reporter vektor), 5 pi HindIII (20 U / ul), 5 pi BamHI (20 U / ul), 5 pi varmefølsomme alkalisk phosphatase (1 U / ul) og 25 pi 10x buffer.
        BEMÆRK: AP behandling af vektoren reducerer i høj grad selv-ligering af enkeltstrenget fordøjet vektor og dermed baggrunden.
      3. Inkubér reaktionsblandingerne i 4 timer ved 37 ° C, derefter oprense de fordøjede PCR-produkter og vektoren med et kommercielt PCR oprensning kittet.
    8. Ligation
      1. Opsætning af reaktionen til ligering i PCR-rør, herunder 2 pi 10x T4 DNA ligasepuffer, 10 ng TK-Luc vektor, 50 ng insert (spaltet PCR produkt), 1 pi T4 DNA-ligase (400 U / pl) og nuklease-frit vand op til 20 pi.
        BEMÆRK: Forbered en negativ kontrol, hvor reaktionen ikke indeholder indsatsen.
      2. Bland forsigtigt reaktionen ved pipettering op og ned, centrifuger kortvarigt PCR-rørene ved hjælp mini-centrifuge og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
      3. Varmeinaktiveres ved 65 ° C i 10 minutter og derefter chill på is, og 5 pi af produktet til transformation i 50 pi kompetente celler (f.eks DH5a).
      4. Brug standard varme chok procedure at omdanne bakterier, afhente kolonier og isolere plasmid-DNA med et kommercielt kit. Godkend alle konstruktioner ved sekventering forud for de næste skridt.
    9. Transfektion af ES-celler
      1. Brug plader med 48 brønde. Tilføj 200 pi 0,1% gelatine solution / brønd 30 min før celleudpladning.
      2. Plate embryonale stamceller (ES-celler) en dag før transfektion. Brug fødefri ES-celler og plade med en tæthed på 3 x 10 4 celler per brønd i 250 pi ES medier / brønd.
      3. Forbered plasmidet blandinger (hver blanding beregnes til 8 brønde, 4 ubehandlede og 4 retinoinsyre-behandlede) Bland 1:. 1.250 ng TK-Luc Empty (negativ kontrol), 950 ng β-galactosidase-kodende vektor (pGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 forstærker (positiv kontrol), 950 ng pGal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (region af interesse), 950 ng pGal.
        BEMÆRK: ES-celler udtrykke det ønskede transkriptionsfaktorer (RAR / RXR). Efterlad brønde utransficerede at bestemme basisværdierne senere under luciferase og β-galactosidase målinger.
      4. Tilføj transfektion kvalitet nedsatte serum medier til hvert plasmid blandes op til 106 pi totalvolumen (nok til 8 brønde).
      5. Tilføj 4,5 pi ES kvalitet transficereion reagens og bland forsigtigt ved pipettering 15 gange op og ned. Inkubér transfektion mix for 10 minutter ved stuetemperatur.
      6. Tilføj 13 ul af transfektion mix til cellerne per brønd, bland grundigt ved pipettering. Placer cellerne tilbage i inkubatoren (37 ° C) O / N før ligand behandling.
      7. Fjern mediet forsigtigt ved aspiration fra cellerne og tilføje 250 pi frisk medium / brønd indeholdende 0,01 - 1 pM all-trans retinoid syre (RA) som endelig koncentration eller DMSO som køretøj. Cellerne inkuberes i 24 - 48 timer.
        BEMÆRK: Retinsyre er lysfølsomt.
    10. Fremstilling af cellelysater
      1. Fortynd 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M dithiothreitol (DTT) (i H2O), 10 ml 0,1 M EDTA, pH = 8,0, 50 ml glycerol, 5 ml Triton X-100, steril vand op til 100 ml) til 1x anvendelse af sterilt vand, tilsættes 20 pi 1 M DTT / 10 ml og tempereres til stuetemperatur inden brug. Forbered 10 ml for en 48-brønds plade på dagen for assayet. Fjern mediet forsigtigt ved aspiration af celler. Skyl celler en gang med 1x PBS. Tilsæt 200 pi 1x Lysis Buffer / brønd direkte til cellerne.
      2. Omrystes i 2 timer ved stuetemperatur (kemisk lysis). Frys cellelysaterne på pladen ved -80 ° C (mekanisk lysis). Lysater kan opbevares ved -80 ° C i flere dage.
      3. Optø lysaterne. Efter fuldstændig optøning, overføre cellelysater til en 96-brønds plade under anvendelse af en elektronisk multikanalpipette. Transfer 80 pi af cellelysatet til 96-brønds klar plade for β-galactosidase assay og 40 pi af cellelysatet til en hvid plade for luciferaseaktivitet måling. Undgå at danne eventuelle bobler.
    11. β-galactosidase assay
      BEMÆRK: Beta galactosidase eller alternative anden reportere bør anvendes som en intern kontrol til grund for ikke-specifikke eksperimentelle variationer.
      1. Forbered β-galactosidase-substrat-buffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4H2O, 30,0 g KCI, 1,0 g MgSO4 • 7H 2 O, der fyldes op til 1000 ml med sterilt vand. Indstil pH til 7,4. Filtersteriliser (0,2 micron) og opbevares ved 4 ° C
      2. Bland 1 ml β-galactosidase-substrat buffer med 4 mg ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase). Tilføj til 3,5 pi 2-mercaptoethanol (βME) per 1 ml buffer umiddelbart før brug. Tilsæt 100 pi β-galactosidase-substrat-buffer til 80 pi cellelysat.
      3. Inkuber reaktionerne ved 37 ° C, indtil en svag gul farve er udviklet. Læs absorbans ved OD 420 nm på en pladelæser og eksportere data.
        BEMÆRK: Tiden varierer afhængig af transfektionseffektiviteten, normalt ikke længere end 30 min.
    12. luciferase Assay
      1. Forbered 50 ml luciferin substrat reagens: 15,1 mg D-luciferin salt, 82,7 mg ATP salt, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, tilsættes til 50 ml polypropylen rør,tilsæt derefter 1,5 ml 1 M HEPES buffer, 48,5 ml ATP frit vand, vortex, sørge for alle forbindelser opløses fuldstændigt. Hold 5 - 10 ml portioner ved -80 ° C.
      2. Varm 5 ml luciferin substrat reagens til RT før start. Tilsæt 100 pi substrat-reagens til hver brønd i den hvide plade indeholdende 40 pi cellelysatet og måle signalet straks med en luminescerende counter maskine.
      3. Opnå aktiviteter fra mindst tre uafhængige forsøg i tredobbelte transfektioner.
      4. Beregn først basen normaliserede luciferaseaktivitet og base normaliserede β-galactosidase-værdier for hver brønd ved at fratrække de middelværdier for ikke-transficerede celler fra hver værdi målt. Derefter beregne forholdet mellem luciferase / β-galactosidaseaktivitet.

    3. Karakterisering af Enhancer RNA

    BEMÆRK: En mere direkte indikator for forstærker aktivitet er opstået fra de seneste genom-wide undersøgelser, der identificerede mange korte ikke-kodende RNA, der spænder i størrelse fra 50 til 2.000 nt, der er transkriberet fra enhancere, og kaldes enhancer RNA'er (Ernas) 16,25,26 (figur 4). ERNA induktion stærkt korrelerer med induktion af tilstødende exon-kodende gener. Således kan signal-afhængig enhancer aktivitet kvantificeres in vivo ved at sammenligne Erna produktionen mellem forskellige betingelser ved RT-qPCR.

    1. Retningslinjer for Primer Design for ERNA detektion af RT-qPCR
      1. Vælg genomiske regioner for ERNA målinger, der er mindst 1,5 til 2 kb væk fra annoterede transcription start sites.
        BEMÆRK: Det er vigtigt, høje niveauer af mRNA-transkription tværs intrageniske enhancere forhindrer nøjagtig kvantificering af Erna i sense-orienteringen, antisense Ernas på intrageniske enhancere er påviselige og er af samme niveau til Ernas på extragenic enhancere.
      2. Som en generel regel, bruge regioner 200 - 1000 bp from centrum af transkriptionsfaktoren bindingsstedet af interesse for primer design enten på sense eller anti-sense-strengen (figur 4 og figur 6).
        BEMÆRK: Hvis GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 eller H3K27ac chip-seq data er tilgængelige fra de ønskede celletyper og betingelser, det kan bruges til mere nøjagtig primer design. Ernas er transskriberet fra formodede enhancerregioner karakteriseret ved høje niveauer af H3K4me1 og ME3. Ekspression af Ernas positivt korrelerer med berigelse af aktiverede forstærker histon-mærket H3K27ac.
      3. Design PCR primere til fluorescerende farvestof-baserede RT-qPCR måling af Ernas efter Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 generere anti-sense sekvens (revers komplement af sense-strengen) til primer design som pr: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Indsatsen 200 - 300 bp af sense eller anti-sense sekvens for primer design.
    2. Måling af ERNA Transskription
    3. Isoler totalt RNA fra behandlede celler med kommercielle sure phenol / chloroform-baseret ekstraktion reagens ifølge producentens anbefalinger.
    4. Brug DNaseI til behandling isoleret RNA forud for at bruge dem i revers transkriptionsreaktion. Inaktivere DNase ifølge fabrikantens anbefaling forud for revers transkription.
    5. Mål-RNA-koncentrationen efter DNase I-behandling og bruge 1.000 ng pr RT-reaktionen. Brug af høj kvalitet revers transkriptase.
      BEMÆRK: Som mange Ernas ikke kan polyadenyleret, revers transkription kræver anvendelse af vilkårlige primere.
    6. Detect revers transkriberet Erna ved RT-qPCR anvendelse af standard procedure. Mål en ikke-behandling-afhængige mRNA for normalisering (f.eks 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte en pan-specifikt RXR antistof for at identificere genom-dækkende som RA-regulerede gener har receptor berigelse i deres nærhed. Bioinformatik analyse af RXR chip-seq data fra ES-celler behandlet med retinsyre afslørede berigelse af den nukleare receptor halv websted (AGGTCA) under RXR besatte sites (figur 1). Ved hjælp af en bioinformatik algoritme vi kortlagt tilbage motivet søgeresultaterne til halvdelen websted til de RXR chip-seq data (figur 2). Denne analyse hjulpet os med at præcist at identificere de chip toppe, som var overlappende med kanoniske nukleare receptor bindingssteder. Visualisering af disse steder i IGV indikeret berigelse af disse transkriptionsfaktorer i den tætte nærhed af Hoxa1, en ​​tidligere karakteriserede RAR / RXR mål (figur 2 og figur 3). Vi identificerede også et nyt RA target gen, nemlig PRMT8 27. Dette latter region indeholder en direkte gentagelse uden spacer nukleotider mellem de to halve sites (AGGTCAAGGTCA) (figur 3). At funktionelt validere, at elementet identificeret for Hoxa1 kan faktisk binde RAR / RXR og reguleret af RA vi konstrueret TK-luciferase reporter vektorer, der indeholdt ~ 300bp genomisk region, herunder de identificerede elementer. Vi konstruerede også vektorer uden responselementet (figur 5). ES-celler blev transficeret og luciferaseaktiviteten blev målt i fravær og nærvær af retinsyre (figur 5). Konstruktioner indeholdende den retinsyre responselementet (RARE) viste, øget luciferase signalintensitet på RA behandling, mens konstruktionen uden RARE var ikke inducerbar.

Vi undersøgte også den retinsyre-afhængige aktivitet af Hoxa1 enhancer. For at konstatere, om den forstand og anti-sense ERNA udtryk for Hoxa1 RAR / RXR-bundet forstærker correlate med mRNA-ekspression af genet, vi også målt niveauet af Hoxa1 mRNA (figur 6). Disse resultater bekræftede, at enhanceraktivitet induceres ved kortvarig RA behandling (3 h), hvilket således bekræfter, at enhanceren sandsynligvis er involveret i RA-afhængig enhancer regulering.

figur 1
Figur 1. Homer D e Novo Motif Resultater. En udgang HTML (homerResults.html) genereret af Homer for eksempel RXR chip-seq vises. Sekvensdata logoer svarende til top beriget transskriptionsfaktor motiver identificeret ved de novo motiv opdagelse på RXR-bundne loci. 7463 RXR besatte genomiske regioner blev anvendt til motivet søgning. 77,66% af disse regioner indeholder AGGTCA-lignende motiv (rangeret som # 1). For detaljeret beskrivelse besøg: (http://homer.salk.edu/ho mer / motiv /) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Finde genomiske regioner indeholdende Motiv of Interest. Visualisering af justeret RXR chip-seq læser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam og AGGTCA motiv begivenheder (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) ved Integrativ Genomics Viewer (IGV). Alignments er farvet af read streng (læser på + streng: rød, - streng:. blå) genom anvendes til justering: MM10. klik her for at se en større version af dette tal.

jpg "/>
Figur 3. Genomisk Loci af Hoxa1 og PRMT8 Enhancers. IGV øjebliksbillede af RXR chip-Seq signaler opnået fra ubehandlede og RA-behandlede (24 timer, 1 uM) embryonale stamceller 27 vises. Identificerede bindende sekvenser er farvet rød. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
. Figur 4. Eksperimentel udformning for prøvetagning ERNA kodningssekvenser Enhancers valgt til enhancer RNA (Erna) måling skal placeres mindst 1,5 - 2kb væk i forhold til transkriptionsstartsitet (TSS) i den nærmeste genet. Chip-seq data af transkriptionsfaktoren (TF) af interesse og sekvenstemaet analyse kan anvendes til at identificere direkte bindingssteder hele genomet. Som binding af transcriptionale coaktivator (fx P300) ofte markerer distale forstærkere, regioner beriget for både TF og P300 er gode forstærker kandidater. Ekspression af Ernas er positivt korrelere med berigelsen af ​​aktiveret forstærker histon-mærket H3K27ac. Regioner 200 -. Anbefales 1000 bp væk i sense eller anti-sense retning fra centrum af transskription faktor binding af for ERNA primer design Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. luciferaseaktivitet af de angivne reporterkonstruktioner i ES-celler. Angivet genomiske regioner af Hoxa1 enhancer blev klonet ind TK-Luc-vektor og transficeret i embryonale stamceller. Construct 1 og 2 indeholdt den retinsyre respons element (RARE, underlined sekvens). Celler blev behandlet med RA (24 hr, 1 uM). pGal blev anvendt som en intern kontrol for normalisering. Søjler repræsenterer middelværdier normaliserede værdier fra fire biologiske replikater. ± sd *** P <0,005 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. retinoidsyre induceret Enhancer RNA-transkription. Hoxa1 mRNA og Erna niveauer, som målt ved RT-qPCR. Totalt RNA blev isoleret fra ES-celler behandlet i 3 timer med retinsyre (RA) eller DMSO som bærer (VEH). Forward primere for sense og anti-sense Erna detektion og PCR amplikoner vist. Afstand af regioner detekteret af Erna RT-qPCR fra centrum af RXR-bindingsstedet er indikeret. Værdier blev normaliseret til gennemsnittet af 36B4 mRNA. Data repræsenterer gennemsnit ± sem *** P <0,005 Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics