Förutsägelse och validering av Gene reglerande element aktiveras under retinsyra Induced embryonala stamceller Differentiering

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Embryonal utveckling är en flerstegsprocess som involverar aktivering och undertryckande av många gener. Förstärkarelement i genomet är kända för att bidra till vävnad och celltyp specifik reglering av genuttryck under den cellulära differentieringen. Således, är viktigt för att förstå hur cellöde bestäms deras identifiering och ytterligare utredning. Integration av genuttryck data (t.ex. microarray eller RNA-seq) och resultat av kromatin immunoprecipitation (chip) baserad genomvida studier (Chip-punkter) kan storskalig identifiering av dessa regulatoriska regioner. Emellertid funktionell validering av celltypsspecifik förstärkare kräver ytterligare in vitro- och in vivo-experimentella procedurer. Här beskriver vi hur aktiva medel kan identifieras och valideras experimentellt. Detta protokoll ger en steg-för-steg arbetsflöde som innehåller: 1) identifiering av regulatoriska regioner av Chip-punkter dataanalys, 2) kloning och expertisimental validering av förmodade reglerande potentialen av de identifierade genomiska sekvenser i en reporteranalys, och 3) bestämning av förstärkaraktivitet in vivo genom att mäta enhancer RNA-transkript nivå. Den presenterade protokollet tillräckligt detaljerade för att hjälpa någon att ställa upp detta arbetsflöde i labbet. Viktigare, kan protokollet enkelt anpassas till och användas i varje cellulärt modellsystem.

Protocol

1. Enhancer urval baserat på Chip-punkter analys

  1. Ladda ner RXR Chip-punkter rådata fastq fil (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) från http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Ladda ner och extrahera krävs BWA indexfilen för inriktningen (i vårt fall: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    OBS: Besök https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts för mer information om stegen bioinformatik analys och ladda ner skript som används nedan.
  3. Rikta exemplet fastq filen till MM10 genomet (använda skriptet: perform_alignment.sh). Detta kommer att skapa en mapp med en .bam fil och statistik inriktningen. Inriktade RXR Chip-punkter data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), och motsvarande index fil (.bai) finns här:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    OBS: BWA är ett programpaket som anpassar relativt korta sekvenser (t.ex. ChIP-seq räknat) till en sekvensdatabas, såsom referens musgenomet (t.ex., MM10) 13.
  4. Kör skriptet (callpeaks.sh) för toppsamtal och de novo motiv analys. Använd .bam fil som ingång. Manuset är baserat på Homer findPeaks 14.
    OBS: Utdatafilerna ge oss information om det totala antalet toppar, anrikning av motiven, andelen bakgrunden, och målsekvenserna med motiv, osv. (Figur 1). Typiskt flera motiv listas i ordning efter deras betydelse.
  5. Mappa # 1 rankade motiv (NR halv `AGGTCA`) (använd skriptet: remap_motif.sh)
    OBS: Som resultat genererar skriptet en .bed fil som kommer att visa vilka Chip-toppar som omfattar genomiska regioner som innehåller den kanoniska bindningsstället av transkriptionsfaktorn av intresse.
  6. Ladda ner och visualisera resultaten av linje RXR Chip-punkter läser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (även hämta .bai)) och AGGTCA motiv händelser (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) av integrativ Genomics Viewer (IGV) 15 för att identifiera förmodade RAR / RXR bindningsställen (Figur 2 och Figur 3).
    OBS: Integrering av olika Chip-punkter uppgifter kommer att bidra till mer exakt förutsäga bra kandidat förstärkare 16,17. Nyligen genomförda studier visar att aktiva medel är typiskt anrikade för P300 och korrelerar med H3K4me1 och H3K27ac, och ligger i öppna kromatin regioner, och därigenom visa DNas-I överkänslighet rekommenderas också 18-21.
  7. Använd "Definiera ett område av intresse" i IGV 15 för att erhålla 200-400 bp sekvens av den valda genomregion och använda dessa sekvenser för efterföljande primer design.

2. Reporter Assay

OBS: luciferin / luciferas-systemet användssom en mycket känslig reporteranalys för transkriptionell reglering. Beroende på förstärkaraktivitet luciferas-enzymet är producerat som kommer att katalysera oxidationen av luciferin till oxyluciferin vilket resulterar i bioluminescense, som kan detekteras. Som ett första steg bör identifierade förmodade förstärkningssekvenser subklonas in i en reportervektor (t.ex. TK-luciferas 22 pGL3 eller NanoLuc).

  1. primer Design
    1. Design PCR primers för förstärkning av 200-400 bp av förmodade enhancer regioner enligt Primer3 (finns här: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Kopiera och klistra in genomsekvensen från IGV som innehåller den förmodade bindningsställe i Primer3 (se steg 1,7). Set produktstorlek till 250-300 bp Primer3.
    3. Validera de PCR-primers med hjälp av UCSC Genome Browser är In silico PCR verktyg (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      OBS: Detta protokoll i ett senare steg använder HindllI och BamHI-restriktionsenzymer för kloning. Kontrollera om PCR-amplifierade sekvensen som förutsägs av UCSC in silico PCR verktyg kommer att innehålla AAGCTT eller GGATCC restriktionsställen (t.ex. http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Erhålla erforderliga primers från en kommersiell leverantör.
  2. PCR-amplifiering av enhancer-sekvens från genomiskt DNA
    1. Rena mall genomisk DNA från primära celler (t.ex. primära embryonala fibroblaster). Använd kommersiella kit för gDNA isolering och följa tillverkarens instruktioner.
      OBS: Hög kvalitet på gDNA är väsentlig för framgångsrik PCR-amplifiering. Lämpliga BAC-kloner kan användas om PCR är inte lätt från gDNA.
    2. Förbered 50 pl PCR-reaktion innehållande 100 ng gDNA, 5 pl 10x buffert, 3 l MgSO 4 (25 mM), 5 pl dNTP (2 mM vardera), 1,5 pl Fwd primer (10 ^ M), 1,5 pl Rev primer (10 | iM) , 1 | il DNA-polymeras
    3. Ställa in PCR-cykel (2 min 95 ° C, (20 sek 95 ° C, 10 sek 58-65 ° C, 18 sek 70 ° C) x25 repeat, 2 min 70 ° C, för evigt 4 ° C). Ställ glödgningstemperatur med behandlingen av primer den uppskattade Tm-värden.
    4. Rena PCR-produkten med ett kommersiellt PCR-reningskit och följ tillverkarens instruktioner.
    5. Införa restriktionsställen för kloning genom att upprepa PCR med primers som användes ovan, men att lägga till överhäng på sina 5'-ändar (t ex, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 '(Hindlll), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
    6. Köra 5 | il av PCR-produkten på agarosgel för att kontrollera om det ospecifika PCR-produkter.
      OBS: Om fler band detekteras, kör hela PCR-produkten och rena det lämpliga bandet från en kommersiell gelextraktionskit.
    7. Begränsning
      NOTERA: För att klona insatsen uppströms om TK-promotorn 22 den renade PCR-produkten och vektorn (t.ex., TK-Luc) bör digereras med Hindlll och BamHI.
      1. Förbered en 50 pl reaktionsblandning innehållande 1 mikrogram renat PCR-produkt, 1 pl Hindlll (20 U / l), 1 pl BamHI (20 U / ul) och 5 pl 10x buffert.
      2. Förbered en 250 pl reaktionsblandning innehållande 5 pg vektor (TK Luc, eller alternativa reportervektor), 5 pl Hindlll (20 U / ul), 5 pl BamHI (20 U / ul), 5 pl värmekänsligt alkaliskt fosfatas (1 U / l) och 25 | j, l 10 x buffert.
        OBS: AP behandling av vektorn minskar kraftigt självligering av single-digererade vektorn och således bakgrunden.
      3. Inkubera reaktionsblandningarna under 4 h vid 37 ° C, sedan rena de spjälkade PCR-produkter och vektorn med en kommersiell PCR-reningskit.
    8. Ligation
      1. Ställ upp reaktionen för ligering på i PCR-rör inkluderande två pl 10x T4 DNA-ligasbuffert, 10 ng TK-Luc vektor, 50 ng insert (digererad PCR-produkt), 1 pl T4 DNA-ligas (400 U / | il) och nukleasfritt vatten upp till 20 | j, l.
        OBS: Förbered en negativ kontroll där reaktionen inte innehåller insatsen.
      2. Blanda försiktigt reaktionen genom att pipettera upp och ned, spinn ner kortfattat PCR-rören med hjälp av mini-centrifug och sedan inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
      3. Värme inaktivera vid 65 ° C under 10 min sedan kyla på is och använd 5 pl av produkten för omvandling till 50 | il kompetenta celler (t.ex., DH5a).
      4. Använd standard värmechock förfarande för att transformera bakterier, plocka upp kolonier och isolera plasmid-DNA med ett kommersiellt kit. Validera alla konstruktioner genom sekvensering före nästa steg.
    9. Transfektion av ES-celler
      1. Använd 48-hålsplattor. Tillsätt 200 | il 0,1% gelatin lösnjon / brunn 30 min före cell plätering.
      2. Plattembryostam (ES) -celler per dag före transfektion. Använda feeder-fria ES-celler och platta vid en densitet av 3 x 10 4 celler per brunn i 250 | il ES media / brunn.
      3. Förbereda plasmiden mixar (varje blandning beräknas för 8 brunnar, 4 obehandlade och 4 retinsyra-behandlade) Blanda 1:. 1250 ng TK-Luc Empty (negativ kontroll), 950 ng β-galaktosidas-kodande vektor (PGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 förstärkare (positiv kontroll), 950 ng Gal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 förstärkare (regionen av intresse), 950 ng Gal.
        OBS: ES-celler uttrycker de önskade transkriptionsfaktorer (RAR / RXR). Lämna brunnar otransfekterade att bestämma basvärden senare under luciferas och β-galaktosidas mätningar.
      4. Lägg transfektion kvalitet minskade serum media till varje plasmid blanda upp till 106 l total volym (tillräckligt för 8 brunnar).
      5. Lägga 4,5 pl ES kvalitet transfekteraion reagens sedan blanda försiktigt genom att pipettera 15 gånger upp och ner. Inkubera transfektion mix för 10 min vid RT.
      6. Lägg 13 pl av transfektion blandningen till celler per brunn, blanda väl genom pipettering. Placera cellerna tillbaka i inkubatorn (37 ° C) O / N innan ligand behandling.
      7. Avlägsna media noggrant genom aspiration från celler och tillsätt 250 | il färskt medium / brunn innehållande 0,01 - 1 ^ M all-trans-retinsyra (RA) som slutlig koncentration eller DMSO som vehikel. Inkubera cellerna för 24 - 48 timmar.
        OBS: Retinsyra är ljuskänslig.
    10. Framställning av cellysat
      1. Späd 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris, pH = 7,8, 1 ml 1 M ditiotreitol (DTT) (i H2O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml glycerol, 5 ml Triton X-100, sterilt vatten upp till 100 ml) till 1x med hjälp av sterilt vatten, tillsätt 20 pl 1 M DTT / 10 ml och jämvikt till RT före användning. Förbered 10 ml för en 48-brunnar på dagen för analysen. Ta media försiktigt genom aspiration från celler. Skölj cellerna en gång med 1x PBS. Tillsätt 200 ^ il 1 x lyseringsbuffert / brunn direkt till cellerna.
      2. Skaka i 2 h vid RT (kemisk lys). Frysa cellysaten på plattan vid -80 ° C (mekanisk lys). Lysat kan lagras vid -80 ° C under flera dagar.
      3. Tina lysaten. Efter fullständig upptining, överföra cellysat till en 96-brunnsplatta med användning av en elektronisk flerkanalspipett. Överföring 80 ul av cellysatet till 96-brunnars klar platta för β-galaktosidas-analysen och 40 ul av cellysatet till en vit platta för luciferas mätning. Undvik att bilda några bubblor.
    11. β-galaktosidas-analys
      OBS: Beta galaktosidas eller alternativa andra reportrar bör användas som en intern kontroll för att ta hänsyn för icke-specifika experimentella variationer.
      1. Förbereda β-galaktosidas-substrat-buffert: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7 H2O,3,8 g NaH 2 PO 4H2O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7 H2O, späd till 1000 ml med sterilt vatten. Justera pH till 7,4. Filtersterilisera (0,2 mikron) och förvara vid 4 ° C
      2. Blanda 1 ml β-galaktosidas-substrat-buffert med 4 mg ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktosidas). Tillsätt 3,5 pl av 2-merkaptoetanol (PME) per 1 ml buffert omedelbart före användning. Tillsätt 100 | il β-galaktosidas substratbuffert till 80 | il cellysat.
      3. Inkubera reaktioner vid 37 ° C tills en svag gul färg har utvecklats. Läs absorbans vid OD 420 nm på en plattläsare och exportera data.
        OBS: Tiden varierar beroende på transfektionseffektivitet, vanligen inte längre än 30 min.
    12. Luciferase Assay
      1. Förbered 50 ml luciferin substratreagens: 15,1 mg D-luciferin salt, 82,7 mg ATP salt, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, lägg till 50 ml polypropenrör,tillsätt sedan 1,5 ml 1 M HEPES-buffert, 48,5 ml ATP fritt vatten, virvel, se till att alla föreningar upplösas helt. Hålla 5 - 10 ml alikvoter vid -80 ° C.
      2. Varm 5 ml luciferin substratreagenset till RT före start. Pipettera 100 | il substratreagens till varje brunn i den vita plattan innehållande de 40 ul av cellysatet och mäta signalen omedelbart med ett luminiscent räknare maskin.
      3. Skaffa aktiviteter från åtminstone tre oberoende experiment i trippel transfektioner.
      4. Beräkna första basen normaliserade luciferasaktivitet och bass normaliserade β-galaktosidas-värden för varje brunn genom att subtrahera de genomsnittliga värden som uppmätts för icke-transfekterade celler från varje värde som mäts. Sedan beräkna förhållandet mellan luciferas / β-galaktosidasaktivitet.

    3. Karakterisering av Enhancer-RNA

    OBS: En mer direkt indikator på förstärkare aktivitet har framkommit nyligen genom-wide studier som identifierade många korta icke-kodande RNA, varierar i storlek från 50 till 2000 nt, som transkriberas från förstärkare, och benämns förstärkare RNA (Ernas) 16,25,26 (Figur 4). Erna induktion korrelerar starkt med induktion av intilliggande exon-kodande gener. Således kan signalberoende förstärkare aktivitet kvantifieras in vivo genom att jämföra Erna produktion mellan olika förhållanden av RT-qPCR.

    1. Riktlinjer för Primer Design för Erna detektion av RT-qPCR
      1. Välja genomiska regioner för ERNA mätningar som är minst 1,5 till 2 kb ifrån annoterade transkriptionsstartställen.
        OBS: Det är viktigt att höga nivåer av mRNA-transkription tvärs intragenic enhancers förhindrar noggrann kvantifiering av ERNA i sensorienteringen, antisens Ernas vid intragenic förstärkare är detekterbar och är liknande i nivå till Ernas vid extragenisk förstärkare.
      2. Som regel använder regioner 200 - 1000 bp tillbakam mitten av transkriptionsfaktorbindningsstället av intresse för primer design antingen på sens- eller antisenssträngen (figur 4 och figur 6).
        OBS: Om GRO-punkter, DNas-punkter, H3K4me1, H3K4me3 eller H3K27ac Chip-seq data finns tillgängliga från de önskade celltyper och villkor som kan användas för noggrannare primer design. Ernas transkriberas från förmodade enhancer regioner som kännetecknas av höga nivåer av H3K4me1 och ME3. Expression av Ernas korrelerar positivt med anrikningen av aktiverad förstärkare histon märke H3K27ac.
      3. Design PCR-primrar för fluorescerande färgämne baserad RT-qPCR mätning av Ernas by Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generera antisenssekvens (omvänt komplement av senssträngen) för primer design enligt: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Infoga 200-300 bp av sens- eller antisenssekvens för primer design.
    2. Mätning av ERNA Transkription
    3. Isolera totalt RNA från behandlade celler med kommersiell sur fenol / kloroform-baserade extraktion reagens enligt tillverkarens rekommendationer.
    4. Använd DNasI att behandla isolerade RNA innan du använder dem i omvänd transkriptionsreaktion. Inaktivera DNas enligt tillverkarens rekommendation före omvänd transkription.
    5. Mät RNA-koncentration efter DNas I-behandling och använda 1000 ng per RT reaktion. Använd hög kvalitet omvänt transkriptas.
      OBS: Som stort antal Ernas inte kan polyadenylerad kräver omvänd transkription användning av slumpmässiga primers.
    6. Detektera omvänt transkriberat ERNA med RT-qPCR med användning av standardförfarande. Mät en icke-behandlings beroende mRNA för normalisering (t.ex. 36B4, PPIA, GAPDH, Actb).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använde en pan-specifik RXR antikropp för att identifiera genomomfattande som RA reglerade gener har receptor anrikning i deras närhet. Bioinformatik analys av RXR Chip-punkter data som erhållits från ES-celler som behandlats med retinsyra avslöjade anrikning av den nukleära receptorn halv sida (AGGTCA) under RXR ockuperade platser (Figur 1). Med hjälp av en bioinformatik algoritm vi kartlagt tillbaka motivet sökresultat för halv sida till RXR Chip-seq data (Figur 2). Denna analys hjälpte oss att exakt identifiera de CHIP toppar som överlappar med kanoniska nukleär receptor bindningsställen. Visualisering av dessa platser i IGV indikerade anrikning av dessa transkriptionsfaktorer i närheten av Hoxa1, en ​​tidigare kännetecknas RAR / RXR mål (figur 2 och 3). Vi identifierade också en målgen roman RA, nämligen PRMT8 27. detta latter regionen innehåller en direkt upprepning utan distans nukleotider mellan de två halvställen (AGGTCAAGGTCA) (Figur 3). Funktionellt validera att element som identifieras för Hoxa1 kan verkligen binda RAR / RXR och regleras av RA vi konstruerat TK-luciferas reporter vektorer som innehöll ~ 300 bp genomregion, inklusive de identifierade elementen. Vi konstruerade också vektorer utan svarselementet (Figur 5). ES-celler transfekterades och luciferasaktivitet mättes i frånvaro och närvaro av retinsyra (Figur 5). Konstruktioner som innehåller retinoinsyra svarselementet (RARE) visade ökad luciferas signalintensitet på RA behandling, medan konstruktionen utan SÄLLSYNT var inte inducerbar.

Vi studerade också den retinsyra-beroende aktiviteten hos Hoxa1 enhancer. För att fastställa om den meningen och antisense ERNA expression av Hoxa1 RAR / RXR-bunden enhancer correlate med mRNA-uttryck av genen, mätte vi också nivån på Hoxa1 mRNA (Figur 6). Dessa resultat bekräftar att förstärkaren aktivitet induceras av korttids RA behandling (3 h), vilket bekräftar att förstärkaren är sannolikt inblandade i RA-beroende förstärkare reglering.

Figur 1
Figur 1. Homer D e Novo Motif Resultat. En utgång HTML (homerResults.html) som genereras av Homer för exemplet RXR Chip-punkter visas. Sekvens logotyper motsvarande toppen berikade transkriptionsfaktor motiv identifierats av de novo motiv upptäckt vid RXR-bundna loci. 7463 RXR ockuperade genomregioner användes för motivet sökning. 77,66% av dessa regioner innehåller AGGTCA liknande motiv (rankad som # 1). För detaljerad beskrivning besök: (http://homer.salk.edu/ho mer / motiv /) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Söka Genomic regioner som innehåller motiv av intresse. Visualisering av inriktade RXR Chip-punkter läser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam och AGGTCA motiv händelser (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) av integrativ Genomics Viewer (IGV). Poly färgas av läsning strängen (läser på + strand: röd, - sträng. blå) Genome används vid uppriktning: MM10. klicka här för att se en större version av denna siffra.

jpg "/>
Figur 3. Genomisk Loci av Hoxa1 och PRMT8 förstärkare. IGV ögonblicksbild av RXR Chip-Seq signaler som erhålls från obehandlade och RA-behandlade (24 tim, 1 iM) embryonala stamceller 27 visas. Identifierade bindande sekvenser rödfärgat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
. Figur 4. Experimentell design för att testa Erna kodande sekvenser Enhancers valts för förstärkare RNA (Erna) mätning bör placeras minst 1,5-2 kb bort i förhållande till transkriptionsstartstället (TSS) i närmast genen. ChIP-seq data av den transkriptionsfaktor (TF) av intresse och motivet analys kan användas för att identifiera direkta bindningsställen genomet hela. Som bindning av transcripnella samaktivator (t.ex. P300) markerar ofta distala förstärkare, regioner berikande för både TF och P300 är bra förstärkare kandidater. Expression av Ernas är positivt korrelerar med anrikningen av aktiverad förstärkare histon märke H3K27ac. Regioner 200 -. 1000 bp bort i mening eller antisens riktning från centrum av transkriptionsfaktorn bindning av rekommenderas för Erna primer design Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. luciferasaktiviteten av de angivna reporterkonstruktioner i ES-celler. Angivna genomiska regioner av Hoxa1 förstärkare klenades in i TK-Luc-vektor och transfekterades in i embryonala stamceller. Konstruera en och två innehöll retinsyra responselement (sällsynt, underlined sekvens). Celler behandlades med RA (24 tim, 1 M). pGal användes som en intern kontroll för normalisering. Staplar representerar genomsnittliga normaliserade värden från fyra biologiska replikat. ± sd *** P <0,005 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. retinsyra Induced Enhancer RNA Transkription. Hoxa1 mRNA och ERNA nivåer mätt med RT-qPCR. Totalt RNA isolerades från ES-celler som behandlats under 3 timmar med retinoinsyra (RA) eller DMSO som vehikel (veh). Forward primrar för sens- och antisens-ERNA detektering och PCR-amplikoner är visade. Avstånd av regioner som detekteras av ERNA RT-qPCR från centrum av den RXR-bindningsstället indikeras. Värden normaliserades till medelvärdet av 36B4 mRNA. Data representerar medelvärde ± sem *** P <0,005 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics