ونموذج الفأر مثلي من الثدي العفوي السرطان ورم خبيث

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ومثلي سرطان الثدي نموذج الورم الرئيسي والاستئصال الجراحي للورم الأساسي لإطالة عمر الفأر لتوليد الانبثاث عفوية موصوفة. وتتم مراقبة نمو الورم والتقدم وكميا بواسطة التصوير مضان وسيفيراز.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (114), e54040, doi:10.3791/54040 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفيات من مرضى سرطان الثدي. الآلية الكامنة وراء ورم خبيث الخلايا السرطانية، بما في ذلك الانبثاث سرطان الثدي، غير معروفة إلى حد كبير وهو التركيز في أبحاث السرطان. وقد وضعت مختلف سرطان الثدي عفوية نماذج ورم خبيث الماوس. هنا، ونحن التقرير إجراءات مبسطة لإنشاء مثلي زرع الورم الرئيسي سرطان الثدي والناتجة عن ورم خبيث عفوية التي تحاكي الإنسان الانبثاث سرطان الثدي. جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي التصوير الورم مباشرة، وهذا نموذج الفأر يسمح ليتم رصد نمو الورم وحركية التقدم وكميا. في هذا النموذج، تم حقن جرعة منخفضة (1 × 10 4 خلايا) من خلايا سرطان الثدي 4T1 لوك ​​في BALB / ج الماوس الثدي منصة الدهون باستخدام حقنة السلين. تم حقن الفئران مع وسيفيرين وتصوير في نقاط زمنية مختلفة باستخدام نظام التصوير إضاءة الحيوية. عندما نمت الأورام الأولية إلى الحد الأقصى لحجم كما في بروتوكول افق IACUC (approximately 30 يوما)، وتخدير الفئران تحت تدفق مستمر من 2٪ الأيزوفلورين والأكسجين. تم تعقيم منطقة الورم مع 70٪ من الإيثانول. ويستأصل الجلد الماوس حول الورم لفضح الورم الذي أزيل مع زوج من مقص العقيمة. إزالة الورم الرئيسي تمتد بقاء 4T-1 الفئران الورم الحاملة لمدة شهر واحد. ثم تم تصويرها الفئران مرارا وتكرارا عن الورم النقيلي الانتشار إلى أعضاء بعيدة. يمكن أن تدار العوامل العلاجية لقمع ورم خبيث في هذه المرحلة. هذا نموذج بسيط وبعد حساسة في قياس نمو خلايا سرطان الثدي في الموقع الأساسي وحركية التقدم إلى أعضاء بعيدة، وبالتالي هو نموذج ممتاز لدراسة نمو سرطان الثدي والتقدم، ولاختبار وكلاء المضادة للورم خبيث العلاجي وimmunotherapeutic في الجسم الحي .

Introduction

وفقا لجمعية السرطان الأمريكية، وسرطان الثدي هو الشكل الأكثر تشخيص كثيرا من السرطان بين النساء في الولايات المتحدة. الكشف المبكر في تركيبة مع العلاجات المستهدفة التي تم تطويرها مؤخرا أدى إلى انخفاض كبير في وفيات سرطان الثدي في العقدين الماضيين. ومع ذلك، وسرطان الثدي لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفاة المتصلة بالسرطان عند النساء في الولايات المتحدة 1. ومن المقرر أن ورم خبيث الخلايا السرطانية غالبية الوفيات من مرضى سرطان الثدي. لسوء الحظ، فإن معظم سرطان الثدي الغازية، وكثيرا ما مستطير إلى العقدة الليمفاوية، وبعد ذلك إلى أعضاء بعيدة، بما في ذلك العظام والرئة والكبد والدماغ. 1،2 يوجد حاليا أي علاج فعال لسرطان الثدي النقيلي. لذلك، وتطوير العلاج الكيميائي وimmunotherapeutic وكلاء لقمع سرطان الثدي النقيلي له أهمية كبيرة.

وب مختلف سرطان الثدي نماذج ورم خبيث عفوية الماوسوضعت التابعين لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء ورم الثدي تطور الخلايا والانبثاث ولاستخدامها كنماذج لتطوير العوامل العلاجية. 1،3-5 ومع ذلك، فإن معظم هذه النماذج الماوس هي نماذج ورم الوراثية التي، في حين أن النماذج ممتازة لميكانيكي الدراسات، ليست مناسبة لاختبار العوامل العلاجية منذ ورم خبيث يأخذ أشهر لوضع في هذه النماذج الوراثية، وبالتالي تتطلب إدارة مكلفة على المدى الطويل من وكلاء المضادة للسرطان. 6،7 رصد تطور الورم في الفئران الحية هو أيضا تحديا تقنيا. في المقابل، الثدي نموذج سرطان خبيث زرع يحتوي على مزايا قصيرة المدى تطور الورم وتتبع السهل تطور الورم في الفئران الحية. و4T1 مثلي سرطان الثدي النقيلي عفوية نموذج الفأر هو هذا النموذج السرطانية المزروعة. 8 في هذا النموذج، يتم زرع الخلايا السرطانية الثدي في لوحة الدهون الثديية لإنشاء العقيدات الورم الرئيسي. الورم الرئيسيومن ثم يمكن ازالتها جراحيا كما هو الحال في مرضى سرطان الثدي البشري. الخلايا السرطانية 4T1 هي الغازية للغاية. 8،9، 3،10 تقريبا جميع الفئران تطوير ورم خبيث في غضون 30 يوما بعد زرع ورم في لوحة الدهون الثديية الحاملة للورم. ومع ذلك، وأورام 4T1 تنمو بقوة في المواقع الأساسية وغالبا ما تتجاوز أحجام الورم الحدود التي يسمح في معظم البروتوكولات الحيوانية. في هذه المرحلة، والانبثاث هي في كثير من الأحيان micrometastases. وبالتالي، فمن الضروري إزالة الأورام الأولية للسماح التقدم ورم خبيث لاختبار العوامل العلاجية. هنا، نحن تقرير وضع إجراء بسيط وبعد حساسة من زرع الورم الرئيسي، الاستئصال الجراحي للورم الابتدائي وتلألؤ بيولوجي الكمي القائم على التصوير من نمو الورم 4T1 والتقدم في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع إجراءات تتبع مبادئ توجيهية وبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة جورجيا الحكام استخدام الحيوان ولجنة الرعاية.

1. إنشاء مثلي ورم سرطان الثدي

  1. قبل يوم واحد من التجربة والثقافة ما يقرب من 2 × 10 6 خلايا الورم 4T1 لوك ​​في طبق ثقافة 10 سم في 10 مل RPMI المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS. احتضان الطبق الثقافة في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. في يوم من حقن الخلايا السرطانية، وإزالة مستنبت من صحن ثقافة مع فراغ، إضافة 5 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4 إلى الطبق الثقافة، ويهز بلطف الطبق لغسل سطح الثقافة، وإزالة برنامج تلفزيوني من فراغ.
  3. إضافة 2 مل التربسين-EDTA (0.05٪ التربسين و 0.53 ملي EDTA) إلى الطبق الثقافة واحتضان في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحقق الخلايا على مجهر مقلوب للتأكد من أن كل الخلايا فصل من الجزء السفلي من صحن الثقافة. </ لى>
  4. إخماد التربسين بإضافة 8 مل المتوسطة المحتوية على مصل، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في حوالي 450 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
  5. إزالة طاف بواسطة خلايا الفراغ وresuspend في 10 مل برنامج تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في حوالي 450 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف بواسطة فراغ، و resuspend الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على عدادة الكريات تحت غطاء زجاجي. عد الخلايا لتحديد تركيز الخلية. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلية / مل HBSS. نقل الخلايا إلى 1.5 مل microfuge أنبوب معقم والحفاظ على الخلايا على الجليد حتى الاستخدام.
  7. استخدام النساء BALB / ج الفئران من 6-8 أسبوع لحقن الخلايا السرطانية.
    1. حلاقة الشعر بالقرب المحيطة الحلمة # 3 باستخدام الانتهازي الشعر الإلكترونية. حقن 4T1 الخلايا في الغدة الثديية 3 سادة من الدهون يولد بتكاثر ورم خبيث في الرئة. تنظيف منطقة حلق باستخدام قطعة من القطن مغموسة في ethano 70٪ل. و resuspend الخلايا للقلب أنبوب microcentrifuge 2-3 مرات. بلطف نضح 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى CC ½ 27 G 1/2 حقنة السلين.
    2. حقن الخلايا السرطانية في لوحة الدهون الثديية تحت رقم 3 الغدة الثديية من BALB / ج الماوس. ضع الماوس في قفص نظيفة والعودة إلى القفص لمنشأة سكنية الحيوان. انتظر حوالي 21-30 يوما لنمو الورم. يجب مراقبة نمو الورم على أساس منتظم وفقا لسياسات المؤسسة للدراسات السرطانية.

2. لايف ماوس ضوء بارد التصوير من نمو الأورام

  1. الفئران الصورة بعد كل 3 أيام الفئران نقل حقن الورم إلى مرفق التصوير. ضخ 100 وسيفيرين ميكرولتر (30 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) داخل الصفاق (IP) للفئران قبل التصوير. بعد ما يقرب من 10 دقيقة، تخدير الفئران في غرفة الاستقراء مع 2٪ الأيزوفلورين O 2 تدفق /. استخدام ملقط للمس الساق من الفأرة. لا استجابة لمسة تؤكد ثار الماوس هو فاقد الوعي تماما.
    1. وضع الفئران في غرفة التصوير مع المستمر 2٪ الأيزوفلورين وO 2 بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة. ضع الماوس مثل أن المنطقة ذات الاهتمام (أي لوحة الثديية من حقن الورم الأولي) تواجه الكاميرا من نظام التصوير. ضمان الأنف والفم من الفأرة ترد بقوة داخل أنابيب مخدر. يجب أن يكون تخدير الحيوانات في المعايير البيطرية في المؤسسة.
  2. الحصول التصوير تلألؤ بيولوجي مع مجموعة من مختلف التعرض الوقت. على سبيل المثال، تعيين التعرض ل30، مجال الرؤية (فوف) إلى 25، ارتفاع الكائن إلى 1.5 سم، والحصول على صور فوتوغرافية الانارة مع انخفاض القوة الأشعة السينية. تعيين وحدات القياس إلى "الإشراق".
    1. استخدام مجموعة التلقائي لون خطي مع كحد أقصى حوالي حدات 2.4 × 10 7 إشعاع. بعد الحصول على الصور الأولية، وضبط الإعدادات والحصول على أمثل صورة (الشكلالصورة 3 و 4).
  3. عودة الفئران لتنظيف الأقفاص وضمان الفئران على استعادة وعيه مع التمشي قبل أن تعود الحيوانات إلى منشأة سكنية.
  4. تحليل البيانات مع برنامج التصوير المعيشة المرتبطة أداة التصوير. باستخدام برنامج التصوير، ورسم خط المغلقة في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام (ROI). استخدام برامج التصوير لتحديد شدة الاشعاع من العائد على الاستثمار. تسجيل شدة النسبية لكل العائد على الاستثمار لكل الماوس.
    ملاحظة: ارتفاع شدة الاشعاع وتشير مستويات أعلى من الخلايا الانارة، وبالتالي مزيد من نمو الورم.
  5. فحص البصر الماوس كل 3 أيام عن الآثار السلبية.
    توزن الفئران مرة واحدة في الأسبوع: ملاحظة. سيتم النظر في فقدان الوزن من 15٪ من وزن الجسم تأثير سلبي، وسوف يتم التخلص من الفئران الحاملة للورم كما هو موضح في الخطوة سوف يتم التخلص أيضا 5. الفئران بأورام متقرحة.

3. الاستئصال الجراحي للأورام الابتدائية

لاالشركة المصرية للاتصالات: مقص الأوتوكلاف، ملقط ومقاطع الجرح والجرح مطبق كليب (الشكل 1).

  1. إجراء عملية جراحية في غطاء العقيمة للحفاظ على حالة معقمة للحد من خطر العدوى. يوم واحد قبل الجراحة، حلق المنطقة المحيطة أورام الفئران الحاملة للورم مع الانتهازي الشعر الكهربائية.
  2. ما يقرب من 2-4 ساعة قبل الجراحة، وإطعام الفئران أقراص للمضغ كاربروفين المعدة لالفئران بجرعة 5 ملغ / كغ من وزن الجسم.
  3. وضع الفئران في غرفة تحتوي على 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين لمدة 30 ثانية. باستمرار تخدير الماوس باستخدام جهاز التخدير خلال الفترة الجراحية بأكملها.
  4. استخدام عصا القطن المعقم لتطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم للعيون من الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير. استخدام ملقط للمس الساق من الفأرة. لا استجابة لمسة تؤكد أن الفأر هو فاقد الوعي تماما.
  5. تطهير منطقة الجلد حول موقع الورم مع ثلاثة بالتناوبتمسح من فرك الصابون المطهر. مسح منطقة العمليات الجراحية بنسبة 70٪ كحول مسح.
  6. استخدام مشرط معقم (الشكل 1) لقطع شق صغير بالقرب من الورم.
  7. إدراج غيض من زوج من مقص معقم إلى شق إلى قطع الجلد حول الورم لفضح عقيدة ورم (الشكل 2A). عقد الورم مع ملقط معقم واستخدام المقص لفصل الورم من الجلد (الشكل 2B). حفظ عينة الورم عن طريق تجميد في الثلاجة -80 درجة مئوية أو عن طريق تحديد في 10٪ من محلول الفورمالين لاستخدامها في المستقبل.
  8. إغلاق موقع الجراحية مع مقاطع الجرح 9 ملم باستخدام مطبق السيارات كليب (الشكل 1). عودة الماوس إلى قفص نظيفة مع الفراش تعقيمها. يجب مراقبة الحيوانات في المبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: الماوس عادة يستعيد وعيه كافية ويبدأ في التحرك في القفص حوالي 10-30 دقيقة بعد الجراحة.
  9. إدارة كاربروفين لالفئران مرة أخرى 24 ساعة بعد الجراحة. كاربروفين هو لتسكين الألم بعد الجراحة ووصف لتسكين الألم بعد الجراحة ينبغي التحقق منها من خلال التشاور المباشر مع الموظفين البيطريين المؤسسة. إزالة مقاطع الجرح بعد يشفى الجرح (عادة في غضون 5 - 7 أيام بعد الجراحة). إزالة مقاطع الجرح باستخدام مزيل السيارات كليب.

4. لايف ماوس ضوء بارد التصوير من ورم خبيث ورم

  1. الفئران صورة كل 3 أيام بعد الجراحة كما هو موضح في الخطوة 2.

5. التحقق من صحة الرئة الانبثاث عن طريق التضخم الحبر الهند من الرئتين الحاملة للورم

ملاحظة: للتحقق من صحة وسيفيراز الحية النتائج ورم التصوير، وأداء التضخم الحبر الهند من الرئتين الورم الحاملة الماوس لتحديد العقيدات الورم. metastasize الخلايا 4T1 أيضا إلى الأعضاء والأنسجة (الشكل 5)، وبالتالي، ينبغي إجراء الفحص النسيجي لهذه الأجهزة للتحقق من ورم خبيث إذا لزم الأمر أخرى. هذا الاستخدام بروتوكول منطقيةز ورم خبيث كمثال.

  1. حافظ على الفئران في القائمة بينهما قفص المنزل للقتل الرحيم. عندما يضم مع الحيوانات الأخرى، انتقال تلك الفئران لا يجري الموت الرحيم إلى قفص مختلف.
  2. إزالة عامل التصفية قفص أعلى واستبدال فلتر أعلى CO 2. تشغيل مضغوط CO 2 اسطوانة الغاز (100٪) التي يتصل بها مرشح أعلى CO 2. تعيين معدل التدفق في 2 لتر / دقيقة والحفاظ CO 2 لمدة 10 دقيقة على الأقل. إذا كانت الفئران لا تزال تتنفس في نهاية مدة 10 دقيقة، وترك CO 2 على حتى 1 دقيقة على الأقل بعد التوقف عن الفئران التنفس. إيقاف CO 2 السيطرة اسطوانة وتدفق متر. الانتظار لمدة 3 دقائق أخرى وإزالة عامل التصفية أعلى.
  3. ضع الماوس ضحى على ظهرها على لوحة البوليسترين. دبوس الساقين لضمان الوصول دون عائق الى القصبة الهوائية. رش الفئران مع 70٪ من الإيثانول.
  4. باستخدام زوج من مقص، وقطع على طول خط الوسط من منتصف البطن من الفأرة من خلال القفص الصدري وتصل نحو ساليتختلف الغدد. مراقبة القصبة الهوائية. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة المحيطة القصبة الهوائية لفضح القصبة الهوائية.
  5. كاتب الموضوع طرف ماصة تحت القصبة الهوائية. عقد قمة مع يد واحدة، ورفع بلطف القصبة الهوائية وحتى بعيدا عن الجسم.
  6. وتناوب على منصة عقد الماوس 180 درجة. استخدام CC ½ 27 G 1/2 حقنة السلين لحقن الحبر الهند (10٪ الحبر الهند و 0.1٪ الأمونيوم هيدروكسيد) إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية. تماما تضخيم الرئتين مع الحبر حتى يشعر مقاومة قوية.
  7. استخدام زوج من مقص لقطع القصبة الهوائية. استخدام ملقط لعقد الماوس وإدراج مجموعة أخرى من ملقط تحت الرئتين وسحب فصوص الرئة من الماوس. شطف لفترة وجيزة الرئتين في المياه دورق يحتوي على.
  8. في غطاء الدخان الكيميائية، ونقل الرئتين إلى قارورة زجاجية التلألؤ تحتوي على 3 مل من محلول فيكيت من (50٪ إيثانول، 6٪ الفورمالديهايد، و 3٪ حامض الخليك الجليدي). تتويج القارورة لمنع الحل من التبخر.
    ملاحظة: الأنسجة يمكن تخزينها في حل فيكيت الى أجل غير مسمى.
  9. بعد بضع دقائق، ومراقبة العقيدات الورم كما بقع بيضاء على الرئتين سوداء (الشكل 5). الورم العقيدات الأبيض مرئيا بالعين. نقل الرئتين إلى طبق في غطاء الدخان والاعتماد على عدد من بقع بيضاء. وتمثل كل بقعة بيضاء واحدة العقيدات الورم النقيلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء الثدي مثلي سرطان الفأر نموذج
4T1 هو الثديية خط خلية سرطان عدوانية. حقن اقل من 1 × 10 4 خلايا في لوحة الدهون الثديية يمكن أن يؤدي إلى إنشاء العقيدات الورم واحدة في موقع الحقن (الشكل 2A). ولذلك، فإن الورم يقلد سرطان الثدي الأولي البشري. ما يقرب من 100٪ الفئران تطوير الورم مثلي. يمكن قياس حجم الورم باستخدام الفرجار الرقمية أو عن طريق التصوير الورم الحية (الشكل 3). الأورام هي كشف ما يقرب من 3 أيام بعد الحقن الورم باستخدام نظام التصوير تلألؤ بيولوجي، ويزيد من التألق شدة مع زيادة حجم الورم (الشكل 3). لذلك، هذا النموذج هو مثلي نموذجا مثاليا سرطان الثدي لاختبار فعالية من العلاج الكيميائي وكلاء immunotherapeutic ضد كل مراحل سرطان الثدي.

ther.within الصفحات = "1"> الانبثاث عفوية
في مرضى سرطان الثدي البشري، تتم إزالة الأورام الأولية جراحيا بعد التشخيص. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من المرضى الذين لديهم بالفعل LN أو ورم خبيث بعيد في وقت التشخيص. في هذا الإجراء، وضعت أكثر من الفئران LN والانبثاث بعيدة بعد 30 يوما من زرع الورم. عملية جراحية وصفها يزيل تماما الورم الرئيسي (الشكل 2B). لم يتم اكتشاف الأورام الأولية المتبقية في مواقع الأورام الأولية 10 - بعد 30 أيام من الجراحة (الشكل 2B). الاستئصال الجراحي للورم الابتدائي تمتد فترة حياة الفئران الحاملة للورم ولكن لا يمنع الورم ورم خبيث في أجزاء مختلفة من الفئران. ويمكن الكشف عن هذه الانبثاث من طريقة التصوير الحي (الشكل 4). وبالتالي هذا النموذج هو نموذج سرطان خبيث الثدي العفوي الذي يحاكي مرضى سرطان الثدي البشري. هذا النموذج هو مفيد ل: 1) دراسة الف العفويالانبثاث سرطان است (على سبيل المثال، خلايا 4T1 يمكن transfected مع الجينات في المصالح لاختبار وظائف هذه الجينات في سرطان الثدي النقيلي عفوية)؛ و2) اختبار فعالية من العلاج الكيميائي وكلاء وimmunotherapeutic ضد ورم خبيث الثدي عفوية في مضيف المناعي المختصة. مواقع ودرجات ورم خبيث يمكن الكشف عن التصوير الحي (الشكل 4) والتحقق من صحة مع النهج الثاني (الشكل 5). التصوير التلألؤ يمكن كميا عبء الورم في الرئة بأكملها. التضخم الحبر من الرئتين الحاملة للورم يسمح الفرز الدقيق للعقيدات الورم الفعلية لكل الرئة (الشكل 5)، وبالتالي، يمثل طريقة تقدير مجانية من ورم خبيث ورم.

شكل 1
الشكل 1. أدوات جراحة. 1.Stainless مشرط، 2. الملقط. 3. مقص الفولاذ المقاوم لل. 4. Autocشفة الجرح كليب مطبق. 5. Autoclip كليب جرح مزيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مثلي 4T1 ورم النموذجي. تم حقن A. 4T1 الخلايا السرطانية (1 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر PBS) الخلايا في لوحة الدهون الثديية. بعد ثلاثين يوما حقن الورم، والتضحية الماوس وفحص لنمو الورم. أظهرت هو الفئران الحاملة للورم مع العقيدات الورم واحدة في موقع الحقن (السهم الأصفر). ب. تمت إزالة الورم كما هو موضح في وجراحيا. أظهرت هو 4T1 الفئران الحاملة للورم بعد 10 يوما الاستئصال الجراحي للورم الابتدائي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. لايف التصوير الورم عن طريق التصوير ورم لايف استنادا luciferase المراسل. 4T1 الخلايا السرطانية (1 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر PBS) الخلايا تم حقنها في منصة الدهون الثديية. تم تصوير الماوس في أيام 7 و 14 و 28. أظهرت هو شدة استضاءة من الورم الرئيسي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. التصور من التقدم الورم عن طريق التصوير ورم لايف استنادا luciferase المراسل. 4T1 الخلايا السرطانية (1 × 10 4 خلايا في 100 ميكرولتر PBS) الخلايا تم حقنها في منصة الدهون الثديية. تم إزالة الورم الرئيسي جراحيا كما شالخاصة في الشكل (3). ثم تم تصوير الماوس 17 يوما بعد الاستئصال الجراحي للورم الابتدائي. أظهرت هو صورة من ورم خبيث. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. التصور العقيدات ورم الرئة عن طريق التضخم الحبر الهند. وقد تضخم الرئة من الفأرة الورم الحاملة مع الهند الحبر وثابتة في حل فيكيت ل. النقاط البيضاء هي الانبثاث الرئة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وضعت العديد من أنواع نماذج الماوس المعدلة وراثيا من ورم خبيث من سرطان الثدي. 1 هذه الفئران المعدلة وراثيا لدى حدوث الأورام عالية تتراوح 60-100٪. ومع ذلك، فإن حدوث ورم خبيث من هذه الفئران المعدلة وراثيا هو أقل بكثير من حدوث الأورام (14 - 100٪). الخلايا السرطانية metastasize إلى LN والرئتين في معظم هذه النماذج الماوس المعدلة وراثيا من ورم خبيث من سرطان الثدي. الكمون ورم خبيث يختلف من نموذج إلى نموذج وتتراوح 2-8 أشهر. 6،11-16 هذه نماذج الماوس المعدلة وراثيا من ورم خبيث سرطان الثدي هي أنظمة ممتازة لدراسة الآليات الوراثية والجزيئية الكامنة وراء سرطان الثدي النقيلي. ومع ذلك، فإن حدوث ورم خبيث منخفضة وطويلة الكمون ورم خبيث تحد من جدوى هذه النماذج في اختبار وكلاء المضادة للسرطان.

زرع مثلي من 4T1 الخلايا في لوحة الدهون الثديية، مع تشكيل الأورام الابتدائية والنمو المتنقل لاحق، resemblوفاق مراحل متعددة من سرطان الثدي الخبيث، بما في ذلك تشكيل الورم الرئيسي، الانبثاث العقدة الليمفاوية والبعيد الانبثاث الجهاز. وعلاوة على ذلك، زرع syngenic يتجنب المناعية رد فعل المضيف مقابل الكسب غير المشروع يسمح لدراسة مساهمة المكروية ورم، بما في ذلك نظام المناعة، إلى تطور الورم الخبيث. هذا النموذج هو أيضا مفيد لدراسة المضيف المضادة للورم الاستجابة المناعية. لذلك، حقن 4T1 الخلايا في لوحة الدهون الثديية يمثل طريقة سريعة والكمي لدراسة سرطان الثدي النقيلي.

ومثلي 4T1 نموذج زرع الورم لديه حدوث الأورام بنسبة 100٪ في أقل من 30 يوما و 100 حالات٪ ورم خبيث في أقل من 60 يوما (الشكل 2-4). وعلاوة على ذلك، خلافا لمعظم نماذج الماوس المعدلة وراثيا من ورم خبيث من سرطان الثدي، الخلايا السرطانية 4T1 metastasize أيضا حتى العظم (الشكل 4)، وبالتالي، تشبه الإنسان الانبثاث سرطان الثدي.

expressi مستقرعلى من وسيفيراز الترميز كدنا] في 4T1 الخلايا السرطانية يسمح رصد نمو الورم والتقدم في الفئران الحية على مر الزمن (الشكل 3). يمكن قياسها كميا عبء الورم وحركية ورم خبيث على أساس كثافة التلألؤ. وعلاوة على ذلك، والمواقع ورم خبيث يمكن أيضا التي حددها التصوير وسيفيراز (الشكل 4) والتحقق من صحتها مع اتباع نهج متكامل (الشكل 5). لذلك، هذا سرطان الثدي نموذج الانبثاث عفوية هو نموذج ممتاز لتحديد مدى فعالية وكلاء المضادة للورم خبيث في الجسم الحي.

أكثر من عملية جراحية تنطوي على إغلاق تخفيضات مع الغرز. هنا، لاحظنا أن مقاطع الجرح غير القابل للصدأ تعمل بشكل جيد (الشكل 1). مقطع الجرح يمكن تعقيمها بسهولة وتطبيقها بسهولة مع مطبق autoclip (الشكل 1). لقطات الجرح يمكن إزالتها بسهولة مع مزيل كليب (الشكل 1) بعد أن تم شفاء الجرح. لقد أوبلا تخدم أي التهابات مع هذه التقنية الجراحية في أكثر من 20 عملية جراحية.

واحد الحد من هذا النموذج هو معدل نمو الورم سريع. الغالبية العظمى من الفئران الانبثاث الحاملة تموت في 1-2 أشهر بعد خضوعه لجراحة بسبب عبء ورم خبيث واسعة النطاق. الحد الآخر هو أن 4T1 هو خط خلية الماوس واستجابته للعقاقير تجريبية يمكن أن تختلف إلى استجابة من الخلايا البشرية. وينبغي اعتبار هذا في تصميم الدراسة التجريبية لاختبار المخدرات.

باختصار، لقد الأمثل إجراء بسيط وبعد حساسة من مثلي سرطان الثدي نموذج الانبثاث عفوية. هذا نموذج يحاكي الإنسان الانبثاث سرطان الثدي. يمكن رصد حركية تطور الورم وكميا مع مرور الوقت. هذا النموذج هو واحد المثالي ليس فقط لدراسة نمو سرطان الثدي وورم خبيث، ولكن أيضا لاختبار فعالية من العلاج الكيميائي وimmunotherapeutic وكلاء 17 في قمع عفوية الانبثاث سرطان الثدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ami-X Imaging System  Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427638
9 mm AutoClip Applier  Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427630
9 mm AutoClip Remover Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427637
9 mm AutoClip Wound Clip Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher 8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher 8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe Becton Dickinson and Co. NJ  305620
RPMI 1640 medium Mediatech Inc 10-040-CV
PBS Mediatech Inc 21-040-CV
70% Ethanol Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA Mediatech Inc 25-040-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  2. Weigelt, B., Peterse, J. L., van 't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat Rev Cancer. 5, 591-602 (2005).
  3. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. J Vis Exp. (2015).
  4. Stewart, T. J., Abrams, S. I. How tumours escape mass destruction. Oncogene. 27, 5894-5903 (2008).
  5. Lopez, J. I., et al. CD44 attenuates metastatic invasion during breast cancer progression. Cancer Res. 65, 6755-6763 (2005).
  6. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26, 513-523 (2005).
  7. Cuevas, B. D., Winter-Vann, A. M., Johnson, N. L., Johnson, G. L. MEKK1 controls matrix degradation and tumor cell dissemination during metastasis of polyoma middle-T driven mammary cancer. Oncogene. 25, 4998-5010 (2006).
  8. Danna, E. A., et al. Surgical removal of primary tumor reverses tumor-induced immunosuppression despite the presence of metastatic disease. Cancer Res. 64, 2205-2211 (2004).
  9. Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC Cancer. 8, 228 (2008).
  10. Hu, X., et al. Deregulation of apoptotic factors Bcl-xL and Bax confers apoptotic resistance to myeloid-derived suppressor cells and contributes to their persistence in cancer. J Biol Chem. 288, 19103-19115 (2013).
  11. Kwan, H., et al. Transgenes expressing the Wnt-1 and int-2 proto-oncogenes cooperate during mammary carcinogenesis in doubly transgenic mice. Mol Cell Biol. 12, 147-154 (1992).
  12. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
  13. Almholt, K., et al. Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice. Int J Cancer. 113, 525-532 (2005).
  14. Gallego, M. I., Bierie, B., Hennighausen, L. Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways. Oncogene. 22, 8498-8508 (2003).
  15. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  16. Ridgeway, A. G., McMenamin, J., Leder, P. P53 levels determine outcome during beta-catenin tumor initiation and metastasis in the mammary gland and male germ cells. Oncogene. 25, 3518-3527 (2006).
  17. Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. J Vis Exp. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics