条纹分析来研究蛋白质底物使用游离海马神经元的吸引力或令人反感的活动

Neuroscience

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Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

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Abstract

Introduction

轴突导向是由新形成的神经元的神经系统1,2开发过程中发出轴突到其目标的过程。显影轴突在其前端称为生长锥携带一个高度能动结构。生长锥检测外线索导航轴突的路径。导向分子,如狭缝,脑信号蛋白,肝配蛋白和,可以吸引或取决于它们与轴突1,3,4合适受体和共同受体相互作用击退轴突。该激活受体信号传送到影响其轴突和生长锥的运动细胞骨架组织生长锥。

各种方法已被开发来评估诱和驱避剂分子的作用。化疗诱和驱虫剂可施用与梯度浓度的生长/培养基( 例如 ,唐恩的腔室或μ幻灯片)由微-对5,6,在一个高度集中点ipette( 例如 ,车削试验)7,或通过浴应用程序( 例如 ,生长锥塌陷测定法)8,9均匀浓度。

其它方法包括条纹测定或微接触印刷(μCP),其中一个化学引诱或斥涂覆的板的表面上作为底物10-12。 Thestripe法最初是由朋霍费尔和他的同事开发了在1987年以分析小鸡眼膜-顶盖系统13地形测绘。原始方法需要真空系统的外壳蛋白上使用的条纹和啮合矩阵聚碳酸酯核孔膜。在以后的版本中,重组蛋白用窄缝硅矩阵14,15直接印刷的培养板的表面上在一个条纹图案。近日,各研究小组已成功地应用这个条纹检测到轴突导向分子的活动16-21分析。

21的重组胞外结构域的条纹进行培养。培养24小时后,无论是轴突和神经元的细胞体强烈从FLRT2条纹排斥。用抗TAU1抗体染色揭示〜神经元的90%被分布在与Fc包被的区域,相比于上FLRT2-Fc的〜10%,这表明FLRT2具有很强的推斥力功能海马神经元21。

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Protocol

涉及动物主题程序已在滨松医科大学获批准的机构动物护理和使用委员会。

1.矩阵的制备

  1. 煮沸4-8硅氧烷基质在微波或热板上5分钟,使它们能够完全干燥下层流(条纹面朝上)1小时。
    注意:下面的程序应在层流下进行。
  2. 吹压缩空气或用透明胶带从矩阵的条纹侧上的灰尘。保持条纹侧干净,因此可以牢固地附着在板面。
  3. 小心用手指(;条纹面朝下每皿矩阵)按压放置矩阵到6厘米的塑料盘中。避免让基质与盘之间的空气气泡。标记上的培养皿的底侧的条纹的位置。
  4. 如果矩阵未能附加,从步骤1.2重复。

2.条纹的产生和层粘连蛋白涂层的神经文化

  1. 制备荧光标记的重组蛋白质(25微升每注射[步骤2.2]或每对的放置方法[步骤2.2.1] 100微升)通过混合与Fc标签的蛋白(10-50微克/毫升)和荧光染料 - 缀合的抗人Fc抗体(1至3的比例:30-150微克/毫升)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)。然后,孵育该混合物在RT下30分钟。
  2. 使用22-G的注射器,通过对基体的侧面的小孔注入25μl的在上一步(2.1)中制备的重组蛋白(箭头图1A,1C和1E)。
    1. 可替代地,将100微升的重组蛋白的插入矩阵的顶部狭缝和抽吸大约一半从小孔的溶液(在图1A,1C和1E的箭头),因此,重组蛋白质保留在条纹区域。
  3. 孵育30英里的菜在细胞培养培养箱Ñ在37℃。
  4. 放置300微升的PBS顶入狭缝( 图1B)和抽吸从位于矩阵侧的小孔( 图1A,C和E的箭头),以除去未连接的重组蛋白。不要完全吸出PBS,因为蛋白质会干。重复此步骤两次。 (3次总)
  5. 小心地取出矩阵,立即将约100微升控制蛋白质(10-50微克/毫升; Fc)的覆盖整个区域的条纹,创建备用涂层。然后,孵育盘30分钟在37℃下在细胞培养孵化器。
  6. 用PBS三次,大衣呢〜洗餐具表面用100μl20μg/ ml的层粘连蛋白在PBS中后。
    注:应层粘连蛋白在冰上解冻,以防止凝固。
  7. 在细胞培养培养箱孵育1小时培养皿在37℃。
  8. 用PBS洗涤餐具表面三次加文化中介嗯。放置在37℃,直到用在5%CO 2培养箱培养介质涂覆的培养皿中。

3.培养海马神经元从E15.5小鼠胚胎

  1. 通过颈椎脱位安乐死的母亲和隔离3 E15.5胚胎。
  2. 切开皮肤及颅骨矢状在头用剪刀中线,并用小汤匙取出大脑。小心转移大脑装有3毫升Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中的60毫米培养皿中。
  3. 使用手术刀,切出的半球包括皮质,海马和纹状体( 图2A)。然后,通过仔细地除去脑膜解剖出来的海马区,并解剖海马组织转移到含有2毫升的HBSS溶液15毫升离心管中,在冰上( 图2B-C)。从3个胚胎中的管,其足以在8道菜中培养的神经元收集6海马。
  4. 替换轰BSS溶液用胰蛋白酶/ EDTA溶液(2毫升)中,并在37℃反应管在水浴中15分钟。
    注:吸HBSS不离心,不通过倾斜管倒出HBSS解决方案。
  5. 通过加入500微升的胎牛血清(FBS)的中和胰蛋白酶活性。
  6. 离心在100 xg离心混合物5分钟。除去上清液并用2ml培养基洗涤沉淀。重复此步骤一次。
  7. 吸管使用1000微升尖端具有大孔的海马上下10次培养基(切尖)以解离的组织。
  8. 更改为普通(未切割)1000微升尖端和吸管游离组织上下获得单细胞悬液。
  9. 通过将其通过80-100微米网状细胞过滤分离出单个细胞。
  10. 离心在150 xg离心过滤的单细胞悬浮液5分钟。
  11. 通过抽吸去除上清,并悬浮佩尔等(神经元)在2ml培养基中。
  12. 算使用血球台盼蓝染色来确定密度和生存力的细胞。然后,板在150微升培养基10000神经元为每一组stripes.The悬浮液应小心放置,以覆盖整个条纹区域。

4.可视化使用抗TAU1抗体细胞体和免疫荧光染色轴突

  1. 培养24小时后,吸出介质,而不会干扰贴壁细胞,并用温热的预4%低聚甲醛(PFA)/ 4%蔗糖/ PBS中在RT下15分钟固定的神经元。
  2. 用PBS洗涤该板表面的3倍。如果需要,可以使用防水用笔画出周围的条纹区域了一圈,以减少所需的抗体量。
  3. 透用0.3%的Triton X-100 / PBS中的神经元5分钟。
  4. 孵育用含3%驴血清和0.1%的Triton X-100用于阻断溶液中的神经元30分钟,随后温育与抗TAU1抗体(1:200),在1%的驴血清/ 0.1%的Triton X-100 / PBS中O / N在4℃。
  5. 用PBS洗涤该板表面的3倍。孵化用荧光团缀合的抗小鼠IgG抗体的神经细胞在1%牛血清白蛋白(BSA)/0.1%的Triton X-100 / PBS中进行30分钟。
  6. 用PBS洗涤该板表面的3倍。使用50微升抗褪色溶液中18毫米×18毫米遮玻璃盖的条纹区域。避免气泡,这与成像造成干扰。
  7. 获得使用合适的系统的荧光显微镜, 例如 ,×10的物镜,过滤套的GFP和RFP,和1000毫秒的曝光时间( 图3)的荧光图像。

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Representative Results

从E15.5小鼠分离的海马神经元接种并培养24 h上的条纹的荧光标记控制的Fc( 图3A-C)或FLRT2-Fc的( 图3D-F),与非标记的对照Fc的交替。在这两种情况下,神经元聚集和扩展它们的轴突束为。在控制的Fc / Fc的条纹,神经元均匀地分布在荧光标记和非标记的条纹,它们扩展它们的轴突在随机的方向( 图3A-C)。与此相反,在FLRT-2FC / Fc的条纹培养时,轴突避免对FLRT2-Fc区生长。因此,延伸的轴突主要位于控制的Fc( 图3D-F)。值得注意的是,无论是细胞体和轴突从FLRT2-Fc的排斥。因此,轴突平行于条纹的方向上延伸。图3D'。' - F''表示轴突沿增长控制Fc和FLRT2-Fc的,但之间的边界没有延伸到FLRT2领土。

图1
图1.硅矩阵用于创建条纹蛋白质印记。硅基质(A,B)顶视图。矩阵的大小为30毫米×25毫米×5mm处。所述的白色箭头表示的小孔,其中所述重组蛋白被注入(步骤2.2)。箭头在B指示其中交替地施加所述重组蛋白的狭缝(步骤2.2.1)。(C,D)的硅基质的底视图。条纹区域的尺寸为7mm×9毫米。各条的宽度为90微米。箭头表示小管,通过该重组蛋白质被注入(E)在示出的小孔,条纹,和狭缝之间的连接基质的中线矢状视图的示意图。箭头表示第i njection洞。比例尺是500微米的AC和200微米D. 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.解剖小鼠海马的。 (A)中示出在分离半球包括海马,皮层和纹状体切割位置(虚线)的小鼠胚胎的大脑的顶视图(B,C)的分离的海马除去脑膜后收集在HBSS( D)神经元是在一个6厘米的培养皿中培养的条纹。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3.条纹检测与控制Fc和FLRT2-Fc和海马神经元的解离的文化。从E15.5小鼠游离海马神经元中培养上控制的Fc(AC)或FLRT2-Fc的(DF)的条24小时。( A'-C',D'-F',D'' - F'')从 (AC,DF和D'-F盒装的区域放大的影像“,分别为)(A,A'产生条纹使用荧光标记的Fc(灰色)和Fc(黑色),为对照实验。(D,D',D'')荧光标记的FLRT2-Fc的条纹(灰色)与Fc的(黑色)。(B,B',E交替,E',E'')的胞体和海马神经元的轴突抗TAU1抗体染色。(C,C',F,F',F'')条纹的图像和反TAU1染色合并。该neur插件“(,F''胞体和轴突的强烈从FLRT2-Fc的F,F)击退”。需要注意的是轴突沿边界转身不进入FLRT2-Fc的地区(F'箭头').Scale酒吧100微米的C,C',F,F'和25微米F''。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这个协议描述了使用重组蛋白质和分离的神经元从E15.5小鼠海马的条纹检测。该测定允许神经元的排斥力,吸引力,或中性反应于感兴趣的重组蛋白放置在条纹图案的有效观察。该协议的主要优点是用于产生条纹,其中蛋白质被直接印刷到塑料盘的表面上的简单的方法,相对于传统的方法,该方法需要特殊的基质,真空系统,和一个核孔膜20 21。为了使蛋白条带,标记的重组蛋白可通过一个小孔或更大的样品(〜100微升)可以被放置在基体的顶部狭缝被注入,随后过量的缓冲液和未结合的蛋白质的小心吸通过该孔。

这种方法的另一个优点是,大量的神经元可根据被可视化的英格尔实验,许多生长锥可以同时21进行分析。与此相反,在常规的车削试验中,只有一个单一的神经元和单生长锥被可视化。排斥分子FLRT2由神经元,它从FLRT2-Fc的条纹21迁移距离感测。如绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)的报告分子可在神经元中表达的可视化它们对地毯的颜色,并允许实时观察,而不需要免疫染色。像FLAG其他标记,Myc和他可以用来代替Fc标记,并确定与适当的荧光标记的抗标签抗体(步骤2.1)。一些高疏水性蛋白质不能使,因为自聚集适当的条纹。另外,吸引和两种不同的靶蛋白之间斥力的相对动作可以通过对控制的Fc条纹20代以第二目标蛋白质进行比较。

至提高神经元的生存力,可能需要在酶促消化时间和胰蛋白酶抑制调整。如果神经元的存活比率低,稀释胰蛋白酶的浓度或缩短酶消化时间。培养箱的湿度水平应保持,以避免在整个培养周期中的整个系统的蒸发引起的渗透压。

基质的培养皿的粘附是制备好的条纹的一个重要因素。不当坚持在一个混乱的条纹图案的餐具表面的结果。然而,细胞和底物浓度的密度也是成功实验的关键。条带中较高的蛋白浓度推荐用于分析一个分子,其排斥或吸引人的活动是未知的。虽然我们已经证明了使用解离原代神经元这个协议中,它也可以适用于器官外植体培养15。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

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References

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