פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מכיוון תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) יש פוטנציאל לגשר על פערים רבים בטיפוח התא בסביבות 2-D (למשל., צלוחיות או מנות). למעשה, זה זוכה להכרה רחבה כי תאים שגודלו צלוחיות או מאכלים נוטים דה להבדיל ולאבד תכונות מיוחדות של הרקמות שמהם הופקו. נכון לעכשיו, יש בעיקר שני סוגים של מערכות תרבות 3-D שבו התאים הם זורעים לתוך פיגומים מחקו את תאי מטריקס הילידים (ECM): (א) מודלים סטטיים (ב) מודלים באמצעות מתקני גידול. פריצת הדרך הראשונה הייתה 3-D מודלים סטטיים. מודלי 3-D באמצעות מתקני גידול כגון קיר-סיר המסתובב (RWV) bioreactors הם התפתחות מאוחרת יותר. הרעיון המקורי של bioreactors RWV פותחה במרכז החלל ג'ונסון של נאס"א בתחילת 1990 והוא האמין להתגבר על המגבלות של מודלים סטטיים כגון פיתוח של חוסר חמצן, ליבות נמקי. Bioreactors RWV עלול לעקוף הבעיה על ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרות דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן היעיל. הגידול האלה מורכב בסיס מסובב המשמש לתמיכה ולסובב בשני פורמטים שונים של כלי תרבות שונות לפי סוג מקור האוורור שלהם: (1) איטי כלי Lateral מפנה (STLVs) עם oxygenator קואקס במרכז, או (2 כלי יחס ממדים גבוהים) (HARVs) עם חמצון באמצעות קרום העברת גז שטוח, גומי סיליקון. כלים אלה מאפשרים מעבר של גז יעיל תוך הימנעות היווצרות בועה והטורבולנטיות סוגרת. תנאים אלה לגרום זרימה למינרית וכוח גזירה מינימלי שמודלים מופחת הכבידה (כבידה) בתוך כלי התרבות. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושית המורכבת קו תא אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים מתורבתים במיקרוגרבטיציה שמספק bioreactor RWV. </ P>

Introduction

פריצת הדרך הראשונה בבניית מודל 3-D מדווח מוקדם של 1980, כאשר מדענים החלו לחקור סוגים שונים של הפיגום (למשל., Laminin, אני סוג קולגן, קולגן IV, ו פיברונקטין) וקוקטיילים של גורמי גדילה כדי לשפר תא אל תא אינטראקציות ECM של "סטטי" 3-D מודלי 1-7. מאז, הבעיה העיקרית עם המודלים האלה כבר מגבלות בהעברת חומרי מזון וחמצן בתוך מבנים בינוני ורקמות 8. בניגוד תאים בסביבה vivo שמקבלת זרימה קבועה של חומרי מזון וחמצן מן סובבי רשתות של כלי דם, האופי סטטי של מודלים אלה מעכב את ההפצה היעילה של אותם התאים. לדוגמה, אגרגטים התא שנוצר במודלים במבחנה סטטי החורגות כמה מילימטרים בגודל תמיד יפתחו היפוקסי, ליבות נמקי 9. Bioreactors RWV עלול לעקוף בעיה זועל ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרים דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים 10-12 חמצן. עם זאת, עד כה, עבודה באמצעות מתקני גידול RWV הייתה מוגבלת הכללת סוגי תאים אחד או שניים 13-17. יתר על כן, במקום אוריינטציה מרחבית דומה רקמות הילידים, תאים אלה יצרו אגרגטים התא. הסיבה העיקרית המגבלות האלה כבר החוסר של פיגום מסוגל לשלב תאים בצורה משולבת. הפיגומים ששמשו מתקני גידול RWV עד כה מורכבים, עם כמה יוצא מן הכלל 16-18, בעיקר של microbeads הסינטטי, בלוני צינורי או גיליונות קטנים 13-15,19-23. רכב וגמישות אלו הם חומרים נוקשים אשר לא ניתן להשפיע, וכדי שבו תאים מחוברים פני השטח שלהם. לפיכך, אין זה סביר כי מודלים אלה יספקו מערכת שבה להעריך, בצורה משולבת, מרכיבי התאים השונים כגון תאי סטרומה (למשל., פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון ואת אנדותל) כי הסעיףhould להיות מפוזר בתוך הפיגום לחקות רקמה אנושית מקרוב.

כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושי מורכב קו תא אפיתל המעי לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, תאי אנדותל, פיברובלסטים ו 24. תאים אלה היו בתרבית במיקרוגרבטיציה לספק ידי bioreactor RWV 13,25-30. במודל 3-D שלנו, ECM הוא בעל מאפיינים ברורים רבים, כגון osmolality דומה עד בינוני התרבות (למשל., מעצורי diffusional זניחים במהלך התרבות) ואת היכולת לשלב תאים וחלבונים מטריקס רלוונטיים אחרים, כמו גם קשיחות המתאים לשמש bioreactors 24. מערכות ביולוגיות מורכבות מאוד, ובמהלך השנים האחרונות, חלה תזוזה במוקד המחקר רירי לקראת בחינת אינטראקציות תא עם סביבתם ולא לומד אותם isolation. בפרט, את החשיבות של אינטראקציות תאי תאים בהשפעת הישרדות תא מעיים והבחנה מתועדת היטב 31-34. באופן ספציפי, את התקשורת בין תאי אפיתל הנישה שלהם יש השפעה עמוקה על הרחבת תא אפיתל בידול 35. אכן, מקובל כי לא רק תא אל תא, אלא גם תא אל ECM אינטראקציות הן קריטיות התחזוקה וההתמיינות של תאי אפיתל במודלי תרבות 3-D. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים במעיים ECM כגון קולגן אני 24,36,37, 38 laminin ו -39 פיברונקטין הם סייעו המשפיעים תאי האפיתל במעי לרכוש התמצאות מרחבית דומה רירית הילידים. לפיכך, הפיתוח של טכנולוגיות חדשות, כמו המודל 3-D שלנו 24, שיכול לחקות את המגוון פנוטיפי של המעי נדרש אם חוקרים מתכוונים לשחזר את האדריכלות הסלולר מבנית המורכבתותפקוד של microenvironment הבטן. מודלים אלה מייצגים כלי חשוב בפיתוח וההערכה של תרופות פומיות חדשות ומועמדי חיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל דגימות הדם נאספו מתנדבים שהשתתפו מספר פרוטוקול HP-00,040,025-1. האוניברסיטה של ​​דירקטוריון סקירה המוסדית מרילנד פרוטוקול שאושר זה והסמיך את אוסף דגימות דם ממתנדבים בריאים עבור המחקרים כללו בכתב היד הזה. מטרת מחקר זה הוסבר מתנדבים, וכל המתנדבים נתן הודיע, חתמו הסכמה לפני לקיחת הדם.

הערה: ראה טבלה 1 להכנת תוספת בינונית. ראה טבלה 2 לעריכת התקשורת והתרבות 3-D.

1. הכנת כלי תרבות

  1. פתחו את הברגת הפקק של הנמל מילוי של 50-כלי מ"ל ולמלא עם 50 מ"ל של מדיום תרבות סטרילי (למשל., RPMI). לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים במנדף למינרית.
  2. החזר את המכסה ולנגב בכל מדיום נשפך על כל משטח עם אתנול 70%.
  3. אפשר הספינה כדי incubאכלתי לארוחת דקות 15 לפחות כדי O / N ב RT.
  4. השתמש ביציאת המילוי כדי להשליך את המדיום תרבות ולהוסיף 30 מ"ל של מדיום תרבות 3-D.
  5. נגב בכל מדיום נשפך על כל משטח עם 70% אתנול.

2. הכנת התאים

  1. קו תאים אנושיים אפיתל (HCT-8) 24,40.
    1. התרבות תאים ב RPMI בתוספת 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין, 1 פירובט נתרן מ"מ, 10 מ"מ HEPES חיץ 10% בסרום שור העובר מומת חום (FBS ) (תוספת 1). בשעה 70% confluency, תאים פיצול ביחס של 1: 5.
  2. פיברובלסטים גס אדם (תאים-18Co CCD) 24,41.
    1. תרבות תאים במדיום של Basal הנשר מועשר תוספת 1 ​​בשעת confluency, תאי פיצול ביחס של 1:. 3.
  3. האנדותל וריד טבור אדם (HUVEC) תאים
  4. התרבות תאים ב האנדותל בסל בינוני (EBM) מועשר בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, 3 מיקרוגרם / מ"ל מוסף צמיחה תא האנדותל (ECGs), ומשלימים 1 בשעה 70% confluency, תאים פיצול ביחס של 1: 2..
  • לימפוציטים / מונוציטים
    1. לבודד תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מן הדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות באמצעות טכניקות סטנדרטיות 43.
      1. בקצרה, בעזרת פיפטה מ"ל-10, בזהירות להוסיף 30 מ"ל של דם מדולל (1: 1 דם: בופר פוספט (PBS)) לתוך צינור מ"ל-חרוטי 50 המכיל 10 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה צפיפות. לאחר שלב צנטריפוגה, לימפוציטים ומונוציטים יתגוררו בשכבה "הלבנה" בין תקשורת צנטריפוגה הצפיפות ושכבות פלזמה.
      2. אסוף את השכבה הלבנה בעזרת פיפטה העברה. הימנע זיהום גרנולוציט ידי הגבלת אוסף המדיה צנטריפוגה צפיפות. לאחר שטיפת 43, use PBMC כמו שהוא או cryopreserved בנוזל N 2.
        הערה: חשוב להדגיש כי PBMC מורכב בעיקרו של לימפוציטים ומונוציטים, עם חלק קטן של תאים דנדריטים סוגי תאים אחרים.
  • לגדול כל התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2.
  • 3. הכנת תאים קולגן מוטבע

    1. לקבוע את מספר הוסיף צורך בהתבסס על מספר תנאי ניסוי כדי להיות הגדרה. מניחים את המספר המתאים של מוסיף לתוך הבארות של צלחת 6 באר.
    2. כן השעיה של HUVEC ו פיברובלסטים:
      1. פעמיים שטפו את צלוחיות ב PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין, 0.25% (1x) עם ethylenediaminetetraacetate 0.05% טריפסין-tetrasodium (טריפסין-EDTA). הוסף פתרון טריפסין מספיק כדי לכסות את מכלול שטח הפנים תרבית תאים. ניתוק מתרחש בדרך כלל תוך 5 עד 15 דקות
      2. לאסוףתאים מנותקים בתוך שפופרת מיליליטר-50 המכילה 30 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) -30% בינוניים FBS.
      3. צנטריפוגה הצינור ב XG 500 במשך 10 דקות.
      4. Resuspend התאים 30 מ"ל של מדיום FBS% DMEM-30.
      5. לספור את המספר הכולל של תאי קיימא על ידי דילול 20 μl של תאי resuspended עם 20 μl של צבע כחול Trypan. טען את hemocytometer עם תערובת תאים. PBMCs בת קיימא תהיה לבן ברור; PBMC nonviable ירכוש לצבוע ולהיות כחול.
        1. Resuspend כל סוג תא במדיום DMEM-30% FBS בריכוז של 5 - 8 x 10 מ"ל 7 תאים - 1.
    3. כן ג'ל קולגן המכיל תאים
      הערה: כל כלי ידרוש ההכנה ~ 5 מיליליטר של ג'ל קולגן תא המכיל.
      1. בתוך צינור מ"ל-חרוטי 50 להכין את התערובת קולגן על ידי הוספת 1 x DMEM התקשורת, בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -10% חום-inactivated FBS בתוספת 3 מ"ג / שור מ"ל קולגן-I, 10 מיקרוגרם / laminin מ"ל, 40 מיקרוגרם / קולגן IV מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין, 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteoglycan סולפט הפרין ו -15 מ"מ NaOH (כדי להגיע pH פיזיולוגי).
      2. סגור את הצינור ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים עד לקבלת תערובת הוא הומוגני לחלוטין. למנוע היווצרות בועה.
        חשוב: שמור את התערובת על הקרח כדי למנוע gelification.
        1. צעד קריטי: אם התערובת מפתחת הופעה חומצי (צבע צהבהב), להוסיף כמה טיפות של 1 סטרילי N NaOH לנטרל את התערובת.
      3. להוסיף HUVEC ו פיברובלסטים מרוכז בצפיפות של 1.0 - 1.2 ו -1.5 - 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל, בהתאמה לתערובת מועשר קולגן (כמתואר לעיל). סגור את צינורות ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים עד לקבלת תערובת הוא הומוגני לחלוטין. למנוע היווצרות בועה. חשוב: שמור את התערובת על הקרח כדי למנוע gelification.
      4. להוסיף 4 - 5 מ"ל של קולגן תא המכילג'ל לכל כנס, שנטען בעבר לתוך צלחת גם 6, ואפשר gelify בשכונה עם תנועה קטנה או לא עבור שעה 1.
      5. אחרי השעה 1, להעביר את צלחת 6-היטב על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 1 - 2 שעות נוספות.
      6. החזר את הצלחת 6-היטב את מכסה המנוע, ועם העזרה של מלקחיים סטרילית אזמל חתוך בסביבה נקיה מחיידקי הקרום מן הכנס ניתוק ג'ל המכיל תאים מן הקרום. חותך את ג'ל המנותקת לריבועים קטנים (~ 5 x 5 מ"מ).
      7. מוסיפים את הריבועים תא המכיל קטן לתוך Harv 50 מ"ל באמצעות יציאת המילוי.
    4. כן השעיה של תאי אפיתל-8 HCT:
      1. פעמיים שטפו את צלוחיות ב PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין, 0.25% (1x) עם טיפול טריפסין- EDTA. הוסף פתרון טריפסין מספיק כדי לכסות את מכלול שטח הפנים תרבית תאים. ניתוק מתרחש בדרך כלל תוך 10 עד 15 דקות.
      2. איסוף תאים מנותקים 30 מיליליטר של מדיום DMEM-30% FBS.
      3. CentrifUge DMEM-30% בינוניים FBS המכיל צינור ב XG 500 במשך 10 דקות.
      4. Resuspend התאים 30 מ"ל של מדיום FBS% DMEM-30.
      5. לספור את המספר הכולל של תאי קיימא כמתואר 3.2.5.
      6. Resuspend לתאי האפיתל HCT-8 במדיום DMEM-30% FBS בריכוז של 10 מ"ל 7 תאים - 1.
      7. הוסף 1 מ"ל של תאי אפיתל HCT-8 מרוכז לתוך Harv 50 מ"ל באמצעות יציאת המילוי.
    5. באמצעות יציאת המילוי, להוסיף בינוני תרבות 3-D נוספת עד הספינה היא כמעט מלאה (~ 20 מיליליטר).
    6. החזר את מכסה ולנגב את שפתו של הנמל מילוי עם אתנול 70%.
    7. מניחים מזרק בכל נמל מזרק של RWV: מקום 5 מ"ל-מזרק המכיל 3 - בינוני תרבות 4 מ"ל של 3-D בנמל אחד מזרק 5 מ"ל ריק בנמל אחרים.
    8. הסר את כל בועות גלויות על ידי משייך לתוך המזרק הריק בעוד הנפח בינוני בערך באותה המוזרק דרך יציאת מזרק האחרת.
    9. מניחים את vesSels ב bioreactor, להפעיל את הכוח ואת לקבוע את המהירות לכ 13 עד 14 סיבובים לדקה.
      הערה: שלב קריטי: סיבוב שיעור ייתכן שיהיה צורך מותאם כמה פעמים במהלך ניסוי כדי לשמור על התאים המקיפים בתוך הכלי, ובכך הימנעות ממגע עם קירות הכלי.
    10. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במיקרוגרבטיציה, שמספקת bioreactor RWV.
    11. שינוי התרבות בינוני כל 3 - 4 ימים על ידי החלפה כ 30 מיליליטר עם מדיום תרבות 3-D טרי.
    12. לאחר 4 ימים (± 1 יום), להסיר את הכלי מן bioreactor ולהוסיף לימפוציטים / מונוציטים הכלי (2 x 10 7 / כלי).
    13. מניח את הכלי בחזרה bioreactor ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ימים נוספים (± 1 יום).
    14. לאחר 5 ימים נוספים (יום 9 של התרבות), להוסיף לימפוציטים / מונוציטים כלי (2 x 10 7 / כלי) ולהמשיך התרבויות עד 12 ימים נוספים. שינוי התרבות בינוני כל 3 - 4 ימים על ידי החלפה כ 30 מיליליטר עם מדיום תרבות 3-D טרי.

    4. קציר 3-D תרבויות עבור היסטולוגיה

    1. בעזרת יבול פיפטה העברת כל שבר ג'ל קטן, הנקרא כיום "לבנות", לתוך צלחת שש היטב המכיל 10 מ"ל של חיץ פורמלין 10%. השאירו למשך 3 שעות ב RT או במשך 12 - 16 שעות ב 4 ° C..
    2. הכן את עיבוד הרקמות וקלטות הטבעה על ידי תיוג והוספת שתי חתיכות של כריות קצף ביופסיה לתוך כל קלטת.
    3. לטבול את הקלטות במאגר פורמלין 10%.
    4. בעזרת מלקחיים למקם את-בונה הקבועה בין שתי כריות הקצף.
    5. לטבול את הקלטות במאגר פורמלין 10%.
    6. המשך עם נהלים קבועים להטבעה, חתך, ומכתימי 44.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    יש לנו בעבר מהונדס מודל רב-תאי 3-D organotypic של רירית המעי האנושית המורכבת של שורת תאי אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים בתרבית בתנאים כבידה 24 (איור 1). פיברובלסטים ותאי אנדותל היו מוטבעים קולגן אני מטריקס מועשר חלבונים בממברנה במרתף במעיים נוסף 45 (כלומר., Laminin, קולגן IV, פיברונקטין סולפט הפרין proteoglycan) והוסיפו RWV bioreactors. אחרי 10 - 15 ימים, ניתוח מכתים היסטולוגית הפגינו נוכחות של מבנים דמויי שליה בתוך המבנים. כ 60 - 80% של תאי אפיתל אלה אורגנו בשכבה של תאים מקוטבים עם הגרעינים שלהם הממוקמים במיקום בסיס ליד ECM, אשר היא תכונה בולטת ביותר של תאי בדיל היטב (איור 2).

    אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
    איור 1: תרשים של בניית מודל 3-D. ארבעה צעדים הכרחיים כדי לבנות מערכת 3-D. ראשית, כדי להשיג את מספר התאים הדרושים על מנת ליצור את המודל 3-D, קו תאים אנושיים מעיים האנתרוציט אפיתל (HCT-8) ותאי ו פיברובלסטים אנדותל אדם מן המעלה הראשונה גדלים כמו monolayers ומחוברות 2-D. שנית, ECM מורכב קולגן אני מטריקס מועשר חלבונים בממברנה במרתף בטן נוספים (כלומר., Laminin, קולגן IV, פיברונקטין ו proteoglycan סולפט הפרין) מוכן. שלישית, פיברובלסטים ותאי האנדותל מוטבע תערובת קולגן-לי והוסיפו RWV bioreactors ואחריו תוספת HCT-8 לתאי האפיתל. הרביעית, לימפוציטים עיקרי מתווסף התרבות ב ימי 4 ו -9 (± 1 יום). "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2: השוואה בין במעי האנושי הרגיל, ומודלי Organotypic. Hematoxylin ו eosin מכתים של תאים בתרבית במודל כביד 3-D: רקמות הוכתמו סגולות פיגום מוכתם בורוד. תאים מהמודל 3-D היו בתרבית למשך 14 ( "a" ו "b") ו -20 ימים (ג). עשרים יום לאחר הזריעה, מספרים סלולריים הכוללים נשמרים, ותאים הראו מובחנות היטב תכונות סיסיות דמוית. תמונות מוצגות 100X ( "a" ו "b") ו 40X ( "ג") גדלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    ithin-page = "1">
    שם מוצר Pkg. גודל כינון ריכוז עבודה אִחסוּן
    פיברובלסטים Growth Factor-יסוד (bFGF) 25 מ"ג כדי להכין 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 25 מיקרוגרם של FGF לתוך 1 מ"ל של מדיום סטרילי (RPMI בתוספת 1% FCS), מערבולת לפזר, להוסיף 100 μl / aliquot 5 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    גזע פקטור Cell (SCF) 10 מ"ג כדי להכין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 10 מיקרוגרם של SCF לתוך 1 מ"ל של מדיום סטרילי (RPMI בתוספת 1% FCS), מערבולת לפזר, להוסיף 250 μl / aliquot 5 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    Hepatocyte Growth Factor (HGF) 5 מ"ג כדי להכין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 5 מיקרוגרם של HGF לתוך 1 מ"ל של מדיום סטרילי (RPMI בתוספת 1% FCS), מערבולת לפזר, להוסיף 200 μl / aliquot 2 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    אנדותלין 3 50 מ"ג כדי להכין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 50 מיקרוגרם של Endotelin לתוך 1 מ"ל של מדיום סטרילי (RPMI בתוספת 1% FCS), מערבולת לפזר, להוסיף 100 μl / aliquot 10 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    laminin 1 מ"ג להפשיר לאט 2 - 8 מעלות צלסיוס, מערבולת ולהוסיף 100 μl / aliquot 10 מ"ג / מ"ל C נוזלי -20 o, עובד aliquots -20 מעלות צלסיוס, להימנע fre חוזריםEze / פשרה
    Growth Factor (vascular endothelial VEGF) 10 מ"ג כדי להכין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 10 מיקרוגרם של VEGF לתוך 2 מ"ל של מים סטריליים, מערבולת לפזר, להוסיף 100 μl / aliquot 1 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    לוקמיה מעכבות פקטור (LIF) 50 מ"ג כדי להכין 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 50 מיקרוגרם של LIF לתוך 2.5 מ"ל של מים סטריליים, מערבולת לפזר, להוסיף 100 μl / aliquot 4 ng / ml אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    אדנין 25 גרם כדי להכין 0.18 M פתרון המניות; להוסיף adedine og 121.5 מ"ג לתוך 50 מ"ל של 0.05 M HCl (250 μl של 37.1% HCl לתוך 50 מ"ל מים)), מערבולת לפזר, מסנן לעקרלהוסיף 1 מ"ל / aliquot 1.8 x 10 -3 M אבקת 4 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, להימנע חוזרות ההקפאה / הפשרה
    אִינסוּלִין 50 מ"ג כדי להכין 5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 50 מ"ג של אינסולין לתוך 10 מ"ל של 0.005 M HCl (5 μl של 37.1% HCl לתוך 10 מ"ל מים)), מערבולת לפזר, מסנן לעקר ולהוסיף 0.5 מ"ל / aliquot 5 מ"ג / מ"ל אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    T3 100 מ"ג כדי להכין 2 x 10 -8 M פתרון המניות; להוסיף 3.4 מ"ג של T3 לתוך 25 מ"ל של 1 M NaOH, לדלל 0.1 מ"ל של פתרון זה לתוך 9.9 מ"ל של PBS, לדלל שוב 0.1 מ"ל של פתרון זה לתוך 9.9 מ"ל של PBS, מערבולת לפזר, מסנן לעקר ולהוסיף 0.5 מ"ל / aliquot 2 x 10 -11 M C אבקת -20 o, aliquots עובד -20 <sup> o C, להימנע חוזרות ההקפאה / הפשרה
    רעלן הכולרה 5 מ"ג כדי להכין 10 -7 M פתרון המניות; להוסיף 5 מ"ג של רעלן הכולרה לתוך 5 מ"ל סטרילי DDH 2 O (חנות ב -20 מעלות צלסיוס); לדלל 50 μl של פתרון זה לתוך 5 מ"ל DDH 2 O, מערבולת homogenise, לעקר לסנן ולהוסיף 0.5 מ"ל / aliquot 10 -10 M אבקת 4 - 8 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, להימנע חוזרות ההקפאה / הפשרה
    פיברונקטין 1 מ"ג כדי להכין 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 1 מ"ג של פיברונקטין לתוך 1 מ"ל מים distiled סטרילי. אפשר 30 דקות. עבור חומר להיכנס פתרון. לא עושה להתסיס או עיטורים. הוספת 100 μl / aliquot 10 מ"ג / מ"ל אבקת 4 - 8 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, להימנע חוזרות ההקפאה / הפשרה
    apo-transferrin 100 מ"ג כדי להכין 5 מ"ג / מ"ל פתרון המניות (1,000x); להוסיף 100 מ"ג של transferrin לתוך 20 מ"ל של מערבולת PBS לפזר, מסנן לעקר ולהוסיף 0.5 מ"ל / aliquot 5 מ"ג / מ"ל אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    הפרין 50 KU כדי להכין 50 מ"ג / מ"ל פתרון המניות (1,000x); להוסיף 50 מ"ג של הפרין לתוך 1 מ"ל של מערבולת מים כדי לפזר, מסנן לעקר ולהוסיף 1 מ"ל / aliquot 0.1 מ"ג / מ"ל אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה
    proteoglycan סולפט heparan 1 מ"ג כדי להכין 0.1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות; להוסיף 1 מ"ג של סולפט heparan לתוך 10 מ"ל של מערבולת מים סטריליים כדי לפזר, ולהוסיף 0.2 מ"ל / aliquot 2 מ"ג / מ"ל אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, להימנעהקפאת חוזרות / פשרה
    קולגן IV 5 מ"ג כדי להכין 2 מ"ג / מ"ל ​​solutin המניות: להוסיף 2 מ"ג של קולגן V לתוך 2.5 מ"ל של חומצה אצטית 0.25% סטרילית. אפשר 1 - 2 שעות עבור חומר להיכנס פתרון מערבולת עבור dillution טוב יותר.. להוסיף 400 μl / aliquot 80 מ"ג / מ"ל אבקת -20 מעלות צלסיוס, aliquots עובד -20 מעלות צלסיוס, למנוע הקפאת חוזרות / פשרה

    טבלה 1: מוגדרות מוסף בינוני הכנה.

    F-12 בינוני בתוספת
    מֵגִיב פתרון במלאי פתרון סופי כמות
    נסיוב עגל העוברי 10% 50 מ"ל
    פירובט נתרן 100 מ"מ 1 מ"מ 5 מ"ל
    L-Glutamine 200 מ"מ 2 מ"מ 5 מ"ל
    Hepes 1 M 10 מ"מ 5 מ"ל
    גנטמיצין 50 מ"ג / מ"ל 50 מיקרוגרם / מ"ל 500 μl
    פניצילין / סטרפטומיצין 10,000 U / ml / 10 מ"ג / מ"ל 100 U / ml / 100 מיקרוגרם / מ"ל 5 מ"ל
    אִינסוּלִין 5 מ"ג / מ"ל 5 מיקרוגרם / מ"ל 500 μl
    T3 2 x 10 - 8 מ ' 2 x 10 -11 M 500 μl
    אדנין 1.8 x 10 - 1 M 1.8 x 10 - 3 M 5 מ"ל
    transferrin 5 מיקרוגרם / מ"ל 500 μl
    הפרין 50 מ"ג / מ"ל 0.1 מ"ג / מ"ל 1 מ"ל
    ECGs 3 מ"ג / מ"ל 3 מיקרוגרם / מ"ל 5 מ"ל
    bFGF 25 מיקרוגרם / מ"ל 5 ng / ml 100 μl
    SCF 10 מיקרוגרם / מ"ל 5 ng / ml 250 μl
    HGF 5 מיקרוגרם / מ"ל 2 ng / ml 200 μl
    אנדותלין 3 50 מיקרוגרם / מ"ל 10 ng / ml 200 μl
    LIF 20 מיקרוגרם / מ"ל 4 ng / ml 100 μl
    VEGF 5 מיקרוגרם / מ"ל 1 ng / ml 100 μl
    רעלן Choleran 10 -7 M 10 -10 M 500 μl </ Td>
    הערה: הכמות שצוטטה לעיל היא להכנת 500 מיליליטר של תקשורת בתרבות 3-D. יש לאחסן מדיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות

    טבלה 2: הכנת 3-D תרבות מדיה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    בכתב היד הזה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל bioengineered של רירית המעי האנושי מורכב של סוגי תאים בכפולות כולל לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, פיברובלסטים, ותאי אנדותל, וכן 24 שורות תאים אפיתל במעי. ב 3-D מודל זה, הם תאים בתרבית בתוך תאי מטריקס עשיר קולגן בתנאים כבידה 24.

    כפי שתואר קודם לכן, את המאפיינים העיקריים של מודל זה הם: (i) את היכולת לחקות ארגון בשכבת רקמות אפיתל, (ii) האינדוקציה של קוטביות המתאימה של תאי אפיתל, צומת הדוקים, דסמוזומים ו microvilli, (iii) מז תרבות טווח (עד 20 ימים) עם כדאיות גבוהה של תאים ראשוניים (כלומר., פיברובלסטים ותאי אנדותל), (iv) הביטוי סמנים בידול כמו רקמות כולל villin, cytokeratin, E-cadherin ו mucin, (v) את היכולת לייצר כמויות גדולות של ציטוקינים (למשל., IL-8) ו phosphatase אלקליין על גירוי אנטיגני, (vi) הובלה של חומרים מזינים כגון גלוקוז (כלומר., ביטוי disaccharidases, ונוכחות של סוכר מובילים), ו (ז) בידול שושלת הרבה של תאים אפיתל במעי (כלומר., האנתרוציט קליט, globet ותאי M) 24.

    חשוב להדגיש כי על מנת להשיג תוצאות לשחזור באמצעות מודל 3-D שלנו החוקר חייב לעמוד בהנחיות תרבית תאים טובות 46-48. זה חיוני כדי לשלוט תאים באופן שיטתי על כדאיות, זיהום mycoplasma ושינויים בהתנהגות צמיחת תאים. אם מזוהה בעיה, ודא תחילה כי אין שינויים בלתי מורשים הוכנסו לפרוטוקול. אם הבעיה נמשכת, לעבור קבוצה חדשה של רכיבים הבינוניים השונים (נסיוב כולל) ו /או תאים. הגבלה של מודל 3-D שלנו היא השימוש של שורת תאי tumorigenic HCT-8 אפיתל. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי הנוכחות של קו HCT-8 מציעה את היתרון של להיות זמינים מסחרי. יתר על כן, אלה לתאי האפיתל אינם מבטאים גם אנטיגן לויקוציטים אנושיים קלסי או הלא קלסי (HLA) -class שאני מולקולות 49,50. לכן, הם מאפשרים את התרבות של תאי אפיתל עם PBMC של HLA-מחלקה אחרת שאני haplotypes בהעדר alloreactivity-PBMC תא אפיתל. יתר על כן, כאשר משווים את המערכת עם מערכות כגון תאי גזע הבטן organoids 51-53, דגם זה מציע יתרונות רבים. למרות organoids תאי גזע במעי לספק מידע רב ערך על ביולוגיה של התא והבחנה מעיים 51-53, מודל זה מאפשר חשיפה הפסגה ישירה מזינים, סמים פתוגנים. גם מודל זה מספק גישה קלה לתכנים luminal פפטידים ציטוקינים אנטי מיקרוביאליים כאלה. לעומת זאת, organoids הן קומפקטיות unשלה עם משטח לומינל מול פנימה. כתוצאה מכך, יש כמות של מוצרים מוגבלים שיכול להיות מוחדרת organoid לומן 54.

    אנו מאמינים כי מודל organotypic הרב התאי 3-D שלנו של רירית מעי האדם יש פוטנציאל רחב יריעה ככלי לגילוי בשנייה בריאות ומחלות, כולל אינטראקציה עם פתוגנים, סחר אנטיגן, ואת דלקתיות מטבולית מעבדת 24. לבסוף, בשל האופי הרב-תאיים של מודל 3-D שלנו, המודל שלנו יכול לאפשר gain- ואובדן-מחקרים באמצעות סוגי תאים חיסוניים כי צפויים להשפיע על התנהגות תא אפיתל in vivo.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
    2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
    3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
    4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
    5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
    6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
    7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
    8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
    9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
    10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
    11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
    12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
    13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
    14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
    15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
    16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
    17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
    18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
    19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. (2015).
    20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
    21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
    22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
    23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
    24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
    25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
    26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
    27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
    28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
    29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
    30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
    31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
    32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
    33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. (2010).
    34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
    35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
    36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
    37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
    38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
    39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
    40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
    41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
    42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
    43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
    44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. e51064 (2014).
    45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
    46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
    47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
    48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
    49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
    50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
    51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
    52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics