Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן
Chapters
Summary June 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.
Transcript
פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק לחוקרים את הכישורים להעסיק לבבות אנושיים תורמים לבדיקות סמים פיזיולוגיות פרה-קליניות. רקמה זו מנצלת הן צבעי מתח וסידן לאפיון בו זמנית של פוטנציאל הפעולה הלבבית ותנאי סידן תאיים בפרוסות רקמות אנושיות. כדי להקים את מערכת המיפוי האופטי, צרף אמבט רקמות עם שכבת ג'ל polydimethylsiloxane התחתונה למערכת חיסון ולהפיץ ליטר אחד של פתרון התאוששות ב 37 מעלות צלזיוס מחומצן עם 100%חמצן דרך מערכת חיסון בקצב זרימה מהיר מספיק כדי לשמור על הטמפרטורה ולמנוע הצטברות של חיסון אמבטיה.
לאחר מכן השתמש במטרה כדי להתאים את המיקוד והיישור של שתי מצלמות CMOS ולהשתמש במקור אור LED ירוק עם אורך גל של 520 פלוס או מינוס חמישה ננומטר כדי לרגש את רגישות המתח וצבעי מחוון הסידן בו זמנית. לפני קבלת חלקי רקמות, מערבבים תסכול קרדיופלגיה קפוא ונוזלי ומ מניחים את רקמת הלב באמבט הקר כקרח ומזהים את הקיר השמאלי ללא חדריים. הדבק את ג'ל האגרוז מראש לגב מחזיקי רקמת המתכת של הרטט.
חותכים קוביות קוביות סנטימטר אחד של רקמה בתסומה cardioplegic קר ולהשתמש דבק עור אקטואלי במהירות לעלות בלוקים רקמה על מחזיקי רקמת מתכת עם משטחים אנדוקרדיאליים פונה כלפי מעלה. מעבירים את מחזיקי המתכת לאמבטיה הרטטית של פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח, כך שהרקמות שקועות לחלוטין ומעבירות את הלהב לקצה הקדמי של הרקמה. הפעל את הרטט כדי להתחיל לחתוך עם הפרמטרים המוגדרים מראש, השלכת הפרוסות הראשונות מספר עד הלהב מגיע מעבר trabeculae לתוך רקמת אנדוקרדית חלקה.
כאשר הרקמה הניסיונית הושגה, בזהירות להעביר כל פרוסה לתוך מסנני תאים בודדים 100 מיקרומטר ניילון רשת בצלחת תרבות המכילה טמפרטורת החדר מחומצן פתרון ההתאוששות של Tyrode ולכסות את הפרוסות עם מדיחי רשת כדי לשמור על פרוסות הרקמה מן קרלינג. כאשר כל הפרוסות נאספו, בזהירות להעביר כל פרוסה לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכיל שלושה מיליליטר של PBS ל הבאר. שוטפים את הפרוסה בנדנדה עדינה וחוזרים על תהליך זה שלוש פעמים עם PBS סטרילי טרי לפני העברת הדגימות לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכילה שלושה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס תרבות בינונית לבירה.
ואז למקם את הצלחת על שייקר מסלולית ב 20 מהפכות לדקה באינקובטור לח ב 37 מעלות, 30% חמצן, ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 20 דקות של דגירה בתפיסת התאוששות לפרוסות חתוכות טריות או מיד לאחר culturing, בזהירות להעביר את פרוסת העניין לאמבט רקמת מערכת חיסון ולהצמיד את ארבע הפינות לשכבת הג'ל תוך החלת מתיחה מינימלית על הרקמה. אפשר לפרוסות לנוח באמבטיה זו עם פתרון התאוששות במחזור במשך כ 10 דקות לפני הוספת 0.3 כדי 0.5 microliters של מלאי Blebbistatin למאגר של פתרון התאוששות.
בעוד הפרוסה היא דגירה Blebbistatin, reconstitute 30 microliters של צבע רגיש מתח מלאי במיליליטר אחד של פתרון התאוששות ב 37 מעלות. לאחר 10 דקות של טיפול Blebbistatin, לכבות את המשאבות לאט לטעון 0.2 כדי 0.3 מיליליטר של פתרון צבע עובד על פני השטח של הפרוסה על פני תקופה של 30 שניות. לאחר 90 שניות, הפעל את המשאבות כדי לשטוף את כל צבע עודף.
לאחר שמת את הפרוסה עם מחוון סידן מלאי כפי שהודגם רק, למקד את המצלמות על הפרוסה קצב פרוסה אחת הרץ עם משך רוחב הדופק שתי אלפיות השניה ב 1.5 פעמים את משרעת של סף הצעידה מראש. מניחים כיסוי על פרוסת הרקמה ומאירים את הפרוסה בעזרת מקור אור העירור LED. לאחר מכן להקליט את אותות מתח וסידן הנפלטים עם המצלמות ב 1, 000 מסגרות לשנייה.
כדי למצב את נתוני המיפוי האופטי של המתח והסידן, בתוכנת הניתוח המתאימה, לחץ על פרמטרי מצב והסר רקע. לאחר מכן התאימו את הפרמטרים של מיזוג האותות כדי להשיג פוטנציאל פעולה אופטימלי ועקבות סידן ארעיות. כדי לחשב את מהירות ההתהוכה, בחר מפת הפעלה והזן זמן התחלה וסיום כדי לכלול פוטנציאל פעולה יחיד במעקב.
לאחר מכן לחץ על מפה אזורית ובחר את האזור המעניין כדי להציג את מפת ההפעלה של האזור הנבחר. לאחר מכן, בחר מפת מהירות של מוליך ובחר את שעות ההתחלה והסיום. התאימו את ערכי הרזולוציה בין פיקסלים בהתאם להגדרה לפי הצורך.
לחצו על 'צור מפה וקטורית' לבחירת אזור מעניין והצגת הווקטורים של מהירות ההיתוך באזור זה. הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הווקטורים הכלולים בניתוח וכן זווית ההפצה הממוצעת של וקטורים של מהירות ההיוך באזור שנבחר יוצגו. כדי לחשב את משך הפעולה הפוטנציאלי, בחר משך פעולה פוטנציאלי, מפת משך זמן ארעי סידן ובחר את שעות ההתחלה והסיום כדי להקיף פוטנציאל פעולה אחד מלא.
לאחר מכן לחץ על חישוב משך זמן פוטנציאלי של פעולה אזורית כדי לבחור אזור מעניין וליצור את מפת משך הזמן הפוטנציאלי של הפעולה. כדי לקבוע את זמן העלייה, בחר את זמן העלייה ובחר את זמני ההתחלה והסיום כדי לבחור את ההתרוממות של פוטנציאל פעולה אחד בודד או סידן ארעי. הזן את ערכי אחוז ההתחלה והסיום ולחץ על חשב כדי לבחור את אזור העניין ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח זמן העלייה.
כדי לקבוע את ריקבון הסידן, בחר ריקבון סידן והזן את זמני ההתחלה והסיום כדי להקיף את כל חלק הריקבון של אות סידן חולף יחיד. לאחר מכן לחץ על חשב טאו כדי לבחור את אזור העניין ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח קבוע הזמן של ריקבון הסידן. בניסוי מייצג זה, פוטנציאל הפעולה ועקבות סידן ארעיות הותנו.
זמני ההפעלה נקבעו עבור כל פיקסל ומפות isochronal של זמני ההפעלה היו התווה מן המתח המותנה עקבות סידן. וקטורים של מהירות הולכה חושבו לפי זמני ההפעלה והרזולוציה הידועה בין פיקסלים. קבוע ריקבון חולף סידן נמדד על ידי התאמת פולינום לחלק המתפורר של עקבות הסידן.
משך הפעולה הפוטנציאלי ומשך הסידן ארעי נמדדו כמשך הזמן שבין זמן ההפעלה לאחוז מסוים של הקיטוב מחדש או הסרת הסידן מהציטופלסמה בהתאמה. גם זמני העלייה של עקבות המתח והסידן נמדדו ומופו. בניתוח מייצג זה, ההשפעה של טוקסורוביצין על הולך לב נבדקה וכתוצאה מכך הפחתה של מהירות ההוליכות הרוחביות.
חשוב לוודא כי הפרוסות נמצאות במעצר cardioplegic מלא כדי למזער את הנזק לרקמה במהלך הליך חיתוך כדי להשיג פרוסות קיימא. בסוף הפרוטוקול, ניתן להקפיא או לתקן את הפרוסות להערכה מולקולרית. לאחר מכן ניתן לקבוע את המסלולים המקניסטיים המעורבים בתופעה האלקטרופיזיולוגית של העניין.
התפתחות מודל פרוסת לב אנושי זה אפשרה את חקר התגובות לטיפולים ומחלות ברקמת הלב האנושית הממדת את הפער בין מחקרים בבעלי חיים למחקרים קליניים. בעת עבודה עם רקמות אנושיות בעת ביצוע טכניקה זו, הקפד ללבוש את PPE המתאים ולנקוט בכל אמצעי זהירות אחרים הדרושים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
