Las mediciones espaciales de perfusión, presión del fluido intersticial y liposomas acumulación en tumores sólidos

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Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

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Abstract

La acumulación intra-tumoral heterogénea de liposomas es un determinante crítico de su eficacia. Tanto la microcirculación tumor caótica y elevado IFP están vinculados a la distribución heterogénea intra-tumoral de los sistemas de administración de fármacos basados ​​en la nanotecnología, tales como liposomas. En el presente estudio, la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación de las nanopartículas se investigó mediante la experimentación in vivo. Esto se logró mediante la evaluación de la microcirculación del tumor usando contraste dinámico mejorado tomografía computarizada (DCE-CT) y la medición de IFP tumor utilizando un nuevo sistema de colocación de la aguja robótica guiada por imagen conectado al escáner micro-CT. La acumulación intra-tumoral de los liposomas se determinó mediante una evaluación basada en imágenes CT de una formulación liposomal de nanopartículas que encapsulan de forma estable el agente de contraste iohexol (CT-liposomas). de formación de imágenes CT permite para co-localización de la distribución espacial dehemodinámica tumorales, IFP y la acumulación CT-liposoma en un modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo individual de cáncer de mama. Medidas condujeron al descubrimiento de que la perfusión y la fracción de volumen de plasma son fuertes mediadores de la distribución intra-tumoral de los liposomas. Además, los resultados sugieren que IFP juega un papel indirecto en la mediación de distribución de liposomas a través de la modulación de flujo de sangre.

Introduction

La medición de la acumulación intra-tumoral de los sistemas de administración de fármacos de nanopartículas puede proporcionar una herramienta importante para determinar si una concentración adecuada de fármaco citotóxico se ha alcanzado dentro del tumor. El desarrollo de sistemas de liposomas "imagen-poder" permite no invasiva y cuantitativa in vivo de detección del vehículo de suministro de fármacos usando técnicas de imagen como la tomografía por emisión de positrones (PET) 1, fluorescencia óptica 2, y la tomografía computarizada (TC) 3, 4 y la resonancia magnética (MRI) 5. Imaging se ha utilizado para determinar la farmacocinética y la biodistribución de los sistemas de liberación de liposomas y para revelar el grado de heterogeneidad inter-sujeto y intra-tumoral en la acumulación de nanopartículas 6,7. Sin embargo, las imágenes de las nanopartículas por sí sola no identifica las barreras biológicas que han contribuido a su mala acumulación y distribución. Este conocimiento es de suma importancia para la racional el desarrollo de formulaciones más eficaces y estrategias para mejorar la acumulación intra-tumoral 8. Se ha demostrado que las estrategias terapéuticas se pueden aplicar para modular barreras biológicas específicas que resulta en la mejora del transporte de nanopartículas 9. Además, las formulaciones de nanopartículas se han desarrollado para superar específicamente específico barrera biológica de transporte 10. En ambos escenarios, las mediciones de barreras biológicas podrían ser usados ​​para guiar el uso de una estrategia de administración de fármacos de nanopartículas apropiado.

Microcirculación del tumor y elevada IFP se cree que son dos determinantes principales de la acumulación intra-tumoral de nanopartículas, tales como liposomas, en tumores sólidos 9,11. Sin embargo, otras barreras que contribuyen a la mala a la acumulación de liposomas incluyen una densa matriz extracelular, vasculatura impermeable, y la presión de tejido sólido 12. Estas barreras se relacionan en un espacio-temporalmanera, con el flujo sanguíneo anormal y la presión del fluido intersticial elevada siendo dos factores importantes que impulsan la entrega inicial y la extravasación de las nanopartículas. Como se discutió previamente, el establecimiento de la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación intra-tumoral de los liposomas es imprescindible para la interpretación adecuada de los datos de imagen de los liposomas. En este documento métodos cuantitativos para medir la relación entre la microcirculación del tumor, IFP elevada, y la acumulación de nanopartículas en un tumor sólido, se presentan. Esto se logra mediante la realización de mediciones de co-localizada de la distribución intra-tumoral de un agente de liposoma contraste CT utilizando imágenes de CT volumétrica, la microcirculación tumor usando contraste dinámico mejorado de formación de imágenes de tomografía computarizada, y IFP tumor usando un sistema de posicionamiento de la aguja robótica guiada por imagen, denominado el robot CT-13 IFP.

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Protocol

Todos los experimentos in vivo se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network.

1. Modelo animal

  1. Cultura entre 5 a 7 x 10 6 MDA-MB-231 células tumorales de adenocarcinoma de mama en DMEM junto con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 veces la dilución de penicilina-estreptomicina.
  2. células de la cosecha cuando son 80% de confluencia usando una solución de tripsina-EDTA 0,05%. Después de 3 a 5 min neutralizar la tripsina-EDTA con un volumen de 3 veces de DMEM. Tomar una alícuota de 15 l de células y contar usando un hemocitómetro. Centrifugar las células en un gránulo durante 5 min a 200 xg, y volver a suspender en HBS a una concentración de 10 x 10 6 células por ml.
  3. Subcutánea Implant (SC) tumores mediante la inyección de 1 a 2 x 10 6 células en la extremidad posterior de cada 8 a 12 semanas de ratón SCID hembra de edad (n = 5). Utilice una aguja de 25 G estándar para inyección.
  4. monitor de tumor de crecimiento usando calibres (volumen = 0,5 x largo x ancho 2) y comienzan las mediciones una vez que los tumores SC han alcanzado un volumen> 200 mm 3 (aproximadamente 7 a 9 días).

2. CT-liposomas Preparación y caracterización

  1. Preparación de liposomas
    1. Disolver componentes lipídicos (200 mmol / l) para los CT-liposomas, incluyendo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol (CH), y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3 -phosphoethanolamine-N-poli (etilenglicol) 2000 (DSPE-PEG2000) en etanol anhidro a 70 ° C en una relación molar de 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. Evaporar el etanol mediante el mantenimiento de calor a 70 ° C, a continuación, añadir el agente de contraste CT iohexol (300 mg / ml de yodo) a la solución tal que la concentración final de lípidos es de 100 mM.
    3. Mantener la solución a 70 ° C durante 4 horas con agitación frecuente.
    4. Para obtener vesículas unilamelares, extruir la muestra 5 times a través de dos apilados de 200 nm de tamaño de poro de membranas a una presión de 250 psi y extruir de nuevo por 5 ciclos a través de dos membranas de tamaño de poro 80 nm apilados a 400 psi usando un extrusor de lípidos 10 ml. Pipetear un volumen de 10 ml de los liposomas en la extrusora al principio de cada ciclo de extrusión y recoger en un vial de vidrio de tubo o cónico estéril después de cada ciclo de extrusión.
    5. Retire el iohexol un-encapsulado por 16 hr de la diálisis usando un peso molecular 100 kDa cortada (MWC) bolsa de diálisis contra un exceso de volumen de 250 veces de solución tamponada con HEPES 0,02 mM de solución salina (HBS, pH 7.4). Por ejemplo, colocar 1 ml de solución de liposomas en el interior de la bolsa de diálisis con 250 ml de HBS fuera de la bolsa en un vaso de precipitados.
    6. Se concentran las CT-liposomas usando un sistema de flujo 750.000 econó- MWC comercial tangencial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se concentra hasta una concentración final de yodo de aproximadamente 55 mg ml -1.
  2. Caracterización de liposomas
    1. Medir la eficiencia de encapsulación por ruptura de las CT-liposomas utilizando un exceso de volumen de 10 veces de etanol para liberar el ioxehol y luego diluir el uso de un exceso de volumen de 100 veces de agua desionizada (es decir, 10 l de liposomas se rompieron usando 100 l de etanol y después se diluyó a un volumen final de 10 ml).
    2. Determinar la concentración de iohexol con un espectrómetro UV con detección a una longitud de onda de 245 nm. Calcular la eficiencia encapsulaciones tomando la cantidad relación de agente iohexol liberado a la cantidad de agente añadido durante la preparación.
    3. Medir el potencial zeta y diámetro hidrodinámico usando un sistema analizador de tamaño de partícula de dispersión de luz dinámica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir la solución CT-liposoma por 200x (es decir, 5 l de liposoma en 1 ml de volumen final) en agua desionizada para facilitar las mediciones.

3. La TC de la microcirculación del tumor y TC-liposomaDistribución

NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para realizar una exploración volumétrica si se utilizan diferentes versiones de software o equipo.

  1. Anestesiar a cada ratón utilizando 2% de isoflurano mezclado con aire u oxígeno médico y confirmar apretando el dedo del pie y observar ninguna reacción. Aplique un ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Inmovilizar a los animales en una posición boca abajo con cinta adhesiva a una placa de patas de plástico fino.
  2. Coloque una costumbre 27 G catéter, conectado a 20 cm en la tubería PE10, en la vena lateral de la cola y seguro en su lugar con varios trozos de cinta adhesiva.
  3. Preparar una jeringa de 1 ml para contener por lo menos 200 l de las CT-liposomas. Preparar una jeringa de 1 ml con solución salina para usar para limpiar el catéter. Finalmente, preparar una jeringa de 1 ml con al menos 150 ml de iohexol libre mezclado con solución salina (9: 1 relación en volumen).
  4. Coloque el ratón boca abajo sobre la superficie del escáner micro-CT. Utilice el sistema de posicionamiento láser para colocar el tumor en aproximadamente la misma orientación para cada exploración.
  5. Coloque la jeringa CT-liposoma en una bomba de jeringa y conecte el catéter a la jeringa. Ajuste la velocidad de la bomba de 10 l por segundo.
  6. Inicializar el sistema mediante la realización de una exploración de calibración claro-oscuro usando el software de la consola CT-escáner. Seleccione la opción de escaneo claro-oscuro para cada protocolo de obtención de imágenes de interés, seleccione brillante-oscuro del menú desplegable y pulse el botón de exploración para iniciar la calibración.
  7. Realizar un volumétrica anatómica micro-CT del tumor antes de cualquier inyección de agente de contraste. Observe el indicador de software de la consola escáner CT para garantizar la seguridad del escáner CT-enclavamientos se han despejado. En el escáner CT consola de selección de exploración seleccione una energía de rayos X de 80 kV, una corriente del tubo de 70 mA, y capta 1.000 proyecciones de imágenes con el tiempo de 16 seg. Presione el botón de exploración para iniciar la exploración.
  8. Utilice la bomba de jeringa para inyectar un bolo de CT-liposomas a una concentración de 400 kg de yodo mg-1. Colocar la bomba para inyectar un volumen de aproximadamente 150 l (suponiendo un 25 g de ratón). Presione el botón de "inicio" en la bomba para inyectar. vaciar manualmente el catéter con 50 l de solución salina (el doble del volumen del catéter) para asegurar la cantidad total de agente fue inyectado y el catéter está claro.
  9. Espere 10 minutos después de la inyección de CT-liposomas y luego realizar una segunda exploración anatómica utilizando el mismo método y configuración se describe en 3.5.
  10. Realizar un análisis DCE-CT mediante el establecimiento de la bomba de jeringa para inyectar un volumen de 100 l de la iohexol libre mezclado con solución salina (9: 1 proporción en volumen) con el mismo ajuste de velocidad de inyección se describe en 3.3.
    1. En la consola CT-escáner seleccionar la dinámica de la exploración 5 min que utiliza un ajuste de energía de rayos X de 80 kV, una energía tubo de 90 mA, y captura 416 proyecciones de imágenes por segundo durante la primera 30 sec y seguido por una adquisición cada 10 seg . Captura 5 seg de datos DCE-CT y luego presione el botón de inicio en el injection bomba.
    2. Después de la exploración CT-DCE realizar un análisis de micro-CT anatómica volumétrica.
  11. Capturar imágenes anatómicas CT entre 48 y 72 horas después de la inyección de CT-liposomas, utilizando los mismos ajustes volumétricos de TC como se describe en los pasos 3.5.
  12. Reconstruir los datos de CT y CT-DCE anatómicos utilizando el software de GPU-reconstrucción.
    1. Cargar la imagen en el software de reconstrucción. Seleccione la región de interés para ser reconstruido mediante la elaboración de un retorno de la inversión sobre la imagen, usando un ratón. Establecer la ubicación de almacenamiento y el nombre del fotografiado reconstruido y seleccione el tipo de archivo de salida como '.mat'.
      NOTA: El software se ajusta automáticamente el tamaño de vóxel reconstruido a 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 para las exploraciones anatómicas y 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 para las exploraciones de TC-DCE. Haga clic en el botón 'iniciar la reconstrucción'.
  13. Utilice la pre-inyección y exploraciones posteriores a la inyección de 10 min de la CT-liposoma para calcular lafracción de volumen de plasma como se describió previamente 3. Además, el uso de la pre-inyección y 5 min después de la inyección exploraciones de iohexol para calcular la fracción de volumen intersticial como se describió previamente 7.
  14. Obtener una intensidad curvas de tiempo (TIC) mediante la importación de los datos de DCE-CT en el software que proporciona la capacidad de identificar una región de interés (ROI) dentro del volumen del tumor. A continuación, calcular la mejora media CT en el retorno de la inversión como una función de tiempo. En este experimento se desarrolló de software personalizado para identificar a un retorno de la inversión y calcular el TIC.
  15. Obtener estimaciones cuantitativas de la perfusión y la permeabilidad vascular mediante el ajuste de las TIC medidos usando un modelo cinético trazador de dos compartimentos. De montaje se puede realizar utilizando software de análisis de DCE-CT y utilizar las estimaciones a priori de la fracción de volumen de plasma y fracciones de volumen intersticial como parámetros fijos en el modelo cinético trazador de dos compartimentos. Utilizar métodos previamente reportados para obtener estimaciones a priori del plasmaA y fracciones de volumen intersticiales 14.

4. Las mediciones espaciales de tumor de presión del fluido intersticial

  1. Para medir IFP conectar la aguja espinal 25 G al transductor de presión y al sistema de adquisición IFP a través de 50 cm de tubo de polietileno PE20. Enjuague todo el sistema con una solución de sulfato de heparina / solución salina (01:10). Esterilizar la aguja con isopropílico al 70% antes de su uso.
  2. Encienda el sistema de adquisición y el lanzamiento del software de adquisición de IFP y cargar los archivos de configuración para calibrar el sistema para adquirir mediciones IFP en mmHg. Haga clic en el botón ADQUISICIÓN para recoger datos de forma continua IFP.
  3. Realizar mediciones IFP entre 48 y 72 horas después de la inyección de CT-liposomas (esto corresponde a la hora aproximada de la acumulación de pico de las CT-liposomas en el tumor), utilizando los métodos descritos en 4.8. Coloque la aguja IFP al robot CT-IFP.
  4. Realizar análisis de calibración para alinear los sistemas de coordenadas parael robot CT-IFP y el escáner CT. Añadir el archivo adjunto marcador de referencia para el robot CT-IFP y realizará una tomografía computarizada volumétrica cuatro con el marcador de referencia en cuatro posiciones diferentes.
    1. Iniciar el software de control del robot CT-IFP, inicializar el robot, y mover el robot a las tres posiciones mediante la introducción de las x, y, z posiciones de orientación y haciendo clic en el botón "ir".
    2. Tome una tomografía computarizada en la siguiente x, y, z las coordenadas: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; y (4) 0,0,10. Seleccionar un 90 kV, 10 mA, 16 seg exploración usando el software CT-escáner y pulse 'Start' para iniciar la exploración. Reconstruir la exploración como se describe en 3.10.
  5. Poner en marcha el software de alineación robot CT-IFP. Haga clic en el botón "añadir" cargado en la región '' Datos de Registro y seleccionar las cuatro exploraciones de registro reconstruidas obtenidos en 4.3, a continuación, haga clic en "abierto".
    NOTA: La ubicación de píxel del marcador de referencia se introducirá automáticamente en el software.
    1. Haga clic en el botón 'Calcular Transform' y haga clic en el botón 'Aplicar Transform'. Esto genera datos de alineación que se utiliza para convertir el sistema de coordenadas del robot CT-IFP al escáner CT sistema de coordenadas. Después de completada la calibración, coloque la plataforma animal para el robot CT-IFP.
  6. Anestesiar a cada ratón utilizando 2% de isoflurano mezclado con aire u oxígeno médico y confirmar apretando el dedo del pie y observar ninguna reacción. Inmovilizar animal sobre la plataforma robot CT-IFP y la posición del ratón de tal manera que el tumor es accesible para el sistema de robot CT-IFP. Inmovilizar el tumor usando la cinta de tal manera que no se mueve durante la inserción de la aguja IFP.
  7. Realizar un análisis de micro-CT anatómica antes de insertar la aguja IFP. Reconstruir los datos de la TC utilizando los pasos descritos en 3.10.
  8. Cargar los datos CT de inserción pre-aguja en el software de alineación robot CT-IFP. Ajustar la ventana y el nivel de visualizar el tumor. Haga clic en el the borde del tumor en cualquier imagen, a continuación, haga clic en una segunda ubicación en la costa.
    NOTA: El software calculará una serie de posiciones a lo largo de una línea recta entre las dos posiciones. Nota la x, y y z coordenadas de una serie de 5 a 8 posiciones espaciadas uniformemente de la lista.
  9. Preparar el sistema IFP por el lavado de la aguja con una solución salina de heparina antes de la inserción.
  10. Introduzca las primeras posiciones de la aguja predeterminados en las direcciones x, y, z, en el software de control del robot CT-IFP y pulse el botón-pasar a 'ir' para mover el robot a la posición deseada. Haga clic en el botón "Insertar la aguja 'para insertar la aguja en el tejido.
    1. Después de insertar la aguja de asegurar una buena comunicación de fluido entre la aguja y el tejido IFP pellizcando y la liberación de la tubería PE20, tomando nota de que los aumentos de medición IFP y vuelve al valor previo a pellizcos en el software de adquisición de IFP. Eliminar las medidas que no vuelven a los valores basales.
  11. adquirir unaTC anatómica con la aguja insertada, a continuación, haga clic en el botón de "retracción de la aguja" en el software de control del robot CT-IFP para retraer la aguja del tejido. Rechazar cualquier medición IFP donde el valor IFP no regresa al valor pre-inserción de la aguja después de la retirada de la aguja. Esto significa que la aguja puede haber sido obstruido durante la medición. Repita los pasos 4.8 a 4.10 para cada posición de la aguja.
  12. Determinar la posición de la aguja dentro del volumen de tumor mediante el cálculo de las posiciones X, Y y Z del puerto de aguja en relación con el centro de masa del volumen del tumor como se identifica en la TC volumétrica post-inserción de la aguja.
  13. Devolver los animales a su jaula después de todas las mediciones se han completado. No deje desatendida animales, y tener cuidado para observarlos hasta que haya recuperado y son capaces de mantener decúbito esternal.

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Representative Results

El protocolo antes mencionado debe ceder CT-liposomas con una concentración de encapsulado de iohexol, diámetro de los liposomas, y el potencial zeta de 55 mg ml -1 significa, 91,8 ± 0,3 nm y -45,5 ± 2,5 mV, respectivamente. Figura 1a incluye imágenes de DCE-CT representante resultados, produciendo una serie temporal de datos volumétricos que muestran los cambios temporales en la acumulación intra-tumoral de iohexol. Selección de una ROI dentro del tumor produce un TIC que se puede cuantificar usando trazadores métodos de modelado cinético para obtener estimaciones de la perfusión, la permeabilidad vascular, la fracción de volumen de plasma, y la fracción de volumen intersticial (Figura 1b). En este estudio, se utilizó un modelo cinético trazador de dos compartimentos y un ajuste a la medida TIC usando una curva de rutina de ajuste no lineal implementada en Matlab 14. Segmentar el volumen del tumor en múltiples regiones de interés de igual tamaño permite la cuantificación de tque la distribución espacial de los parámetros hemodinámicos dentro del volumen del tumor (Figura 1c). La segmentación se puede realizar de forma manual, lo que consume tiempo y es difícil, o automáticamente tal como se realizó aquí usando un algoritmo que divide el tumor en múltiples regiones de interés de igual tamaño usando un sistema de coordenadas esféricas. Los métodos de DCE-CT proporcionan estimaciones cuantitativas de la distribución espacial de la perfusión, la permeabilidad vascular, la fracción de volumen de plasma, y ​​la fracción de volumen intersticial. Se observaron estos parámetros para ser espacialmente heterogénea con niveles más altos de la perfusión, plasma y fracciones de volumen intersticial a lo largo de la periferia en comparación con el volumen central tumor.

El método de imagen volumétrica CT revela la biodistribución y la distribución intratumoral de CT-liposomas. La figura 2A muestra la biodistribución de CT-liposomas a las 48 horas después de la inyección. El agente sigue circulando en THsistema vascular e, con la absorción sustancial observado en el bazo y el hígado. Se observó la acumulación intra-tumoral de CT-liposomas a ser heterogéneo, con la acumulación predominantemente periférica en comparación con el centro, como se indica mediante las regiones brillantes dentro del volumen del tumor (Figura 2b).

De imagen volumétrica CT se puede utilizar para realizar un seguimiento de la ubicación de las mediciones IFP realizados con el Configuración robot CT-IFP. La figura 3a muestra la colocación de la aguja IFP dentro del volumen del tumor como imágenes utilizando alta resolución de micro-CT. La aguja puede ser claramente identificada dentro del volumen del tumor que permite la localización espacial de las mediciones IFP dentro del volumen del tumor (Figura 3b). Es posible generar un mapa espacial de IFP en todo el tumor mediante la realización de múltiples mediciones IFP dentro del volumen de tumor. El IFP espacial a continuación, se puede correlacionar con las mediciones correspondientes demicrocirculación tumor y la acumulación CT-liposoma.

De imagen volumétrica CT permite un marco común de referencia por lo que es posible co-localizar las mediciones de la hemodinámica, IFP, y la acumulación CT-liposoma. Figura 4 da un ejemplo de las medidas espacialmente co-localizadas de acumulación CT-liposoma, IFP, perfusión, la permeabilidad vascular, la fracción de volumen de plasma, y ​​la fracción de volumen intersticial. Se observó que la perfusión y la fracción de volumen de plasma fue significativamente correlacionado con la acumulación intra-tumoral de CT-liposomas en subcutáneos MDA-MB-231 tumores. Además, la distribución radial de IFP correlaciona con las mediciones hemodinámicas. Estos resultados sugieren que existe una compleja relación espacio-temporal entre la microcirculación del tumor, el IFP y la acumulación intra-tumoral de los liposomas 14.

Figura 1 Figura 1: Imaging DCE-CT de la microcirculación del tumor (a) Una serie representativa de imágenes temporales CT tomados en el volumen del tumor, que representan la cinética de agente de contraste en función del tiempo.. El contorno rojo representa un retorno de la inversión donde se mide la curva de intensidad de tiempo (TIC). (B) El TIC es apto utilizando un modelo cinético trazador de dos compartimentos para proporcionar estimaciones cuantitativas de los parámetros hemodinámicos dentro de la ROI. (C) la distribución espacial de los parámetros hemodinámicos Representante cuantitativos en el tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: volumétrica CT-Obtención de imágenes de liposoma Acumuladores ación. (a) Una imagen representativa-rendido volumen 3D que demuestra la biodistribución de CT-liposomas. (B) Representante axial, coronal y sagital tomadas a través del centro del tumor que muestra la acumulación intra-tumoral del CT-liposomas a las 48 horas después de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Guiada por Imágenes Medidas IFP (a) Una imagen en 3D representativa volumétrica del sistema de robot CT-IFP (verde) de inserción posterior a la aguja en un tumor subcutáneo a las 48 horas después de la inyección de CT-liposomas (naranja). Una imagen de TC representante de la inserción posterior a la aguja (b)./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Las mediciones co-localizada de la microcirculación del tumor, el IFP, y la acumulación CT-liposoma panel que muestra un espacio de co-localización representante de la acumulación tomada después de la inyección, el IFP, la perfusión, la permeabilidad vascular, la fracción de volumen de plasma de 48 h CT-liposoma y fracción de volumen intersticial. Vuelva a imprimir con permiso de 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos para la medición basada en imágenes presentadas en este documento permiten la determinación de la distribución espacial de las propiedades de la microcirculación del tumor, IFP, y la acumulación CT-liposoma. Los anteriores intentos de relacionar estas propiedades se han basado en la realización de mediciones a granel a través de múltiples animales portadores de tumores y por lo tanto carecen de la sensibilidad a dilucidar los mecanismos responsables de la heterogeneidad en la acumulación intra-tumoral que comúnmente se ha observado para sistemas de administración de fármacos de tamaño nano-15. DCE-CT proporciona una herramienta para medir las variaciones intra-tumoral en las propiedades de la microcirculación del tumor, CT volumétrica proporciona una descripción exacta de la cinética de deposición CT-liposomas, y el sistema de robot CT-IFP proporciona una herramienta para realizar la asignación espacial de las IFP en el mismo animal. Por otra parte, las imágenes de DCE-TC es un método clínicamente aprobado para la medición de la hemodinámica tumorales en el ámbito clínico, por lo que los resultados de este estudio trad potencialmente clínicamenteuna mesa.

Dada la complejidad de las mediciones, hay varios factores críticos para garantizar la recogida de conjuntos de datos robustos. DCE-CT basado en la cuantificación de la microcirculación del tumor es sin duda el más difícil asegurar estimaciones precisas de la hemodinámica tumorales. Se requiere la obtención de TIC con una alta relación señal-ruido (SNR) y el empleo de un algoritmo de ajuste robusto para cuantificar las TIC 16,17. La inspección visual de tics pueden utilizar para eliminar datos de baja SNR del análisis. Por otra parte, si no se tiene cuidado a continuación, la instalación de alta SNR Los tics pueden también dar lugar a estimaciones erróneas de la perfusión del tumor, la permeabilidad vascular, la fracción de volumen de plasma, y la fracción de volumen intersticial 16. Con el fin de maximizar la precisión de cuantificación se empleó una estrategia para obtener estimaciones de los modelos independientes de las fracciones de plasma y el volumen intersticial, que se utilizan posteriormente como parámetros fijos durante el ajuste del modelo de TIC medidos. Este metodoasegura estimaciones robustas de la perfusión del tumor y la permeabilidad vascular se obtienen 15.

robusto análisis de la distribución intratumoral de CT-liposomas requiere la realización de la TC volumétrica después de la acumulación suficiente del agente. A partir de estudios anteriores, la acumulación de pico del tumor TC-liposomas se produce entre 48 a 72 horas en xenoinjertos de ratones 3,15. Además existe una relación lineal entre la concentración de CT-liposoma y mejora de contraste en formación de imágenes CT permite la cuantificación sencilla de las variaciones en la acumulación intra-tumoral de CT-liposomas 15.

Las mediciones precisas de IFP utilizando el método basado en la aguja requieren una buena comunicación de fluido entre el catéter y el tejido. Además, es importante sólo los tumores de uso que tienen alta IFP tumor central de (> 5 a 10 mmHg), de lo contrario habrá variaciones espaciales mínimos en IFP. mediciones espaciales de IFP utilizando el CT-IFP robarot systemcan ser un reto debido al movimiento del tejido causada por la inserción de la aguja. previa de imágenes y la colocación posterior a la aguja es crucial para identificar con precisión la colocación de la aguja; sin embargo, puede ser difícil de relacionar la posición entre la colocación de agujas posteriores debido a la deformación del tejido entre las mediciones. Se encontró que la elección al azar posiciones de la aguja da como resultado la deformación tisular significativa durante la inserción de la aguja. Como resultado, este método proporciona el mapeo espacial menos precisa de IFP. Por el contrario, la realización de mediciones a lo largo de una pista lineal a través del volumen del tumor y la inserción de la aguja tangencial a la pista puede mejorar la precisión espacial de las mediciones de IFP. Inserción de la aguja tangencial a la pista minimiza los efectos de la deformación del tejido a lo largo de la dirección de la pista de medición.

Este estudio demostró la capacidad de medir la distribución espacial de la microcirculación del tumor, IFP y acumulación CT-liposoma en un tumor individual. Después de dominar estas técnicas, es entonces posible llevar a cabo estas mediciones de manera independiente o en conjunto para caracterizar el microambiente tumoral y sus efectos en la administración de fármacos. El uso de estos métodos en el modelo de xenoinjerto de mama MDA-MB-231 reveló que la perfusión y la fracción de volumen de plasma son fuertes mediadores de la distribución intra-tumoral de los liposomas 14. No se encontró que era una fuerte relación entre el IFP y distribución de liposomas. Sin embargo, IFP fue fuertemente correlacionada con las mediciones de la perfusión del tumor, lo que sugiere que IFP puede jugar un papel indirecto en la mediación de distribución de liposomas a través de la modulación del flujo sanguíneo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

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References

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