प्रोस्टेट कैंसर और अन्य उम्र संबंधी विकृतियों या चयापचय रोगों में एक Biophysical उत्प्रेरक के रूप में अध्ययन करने के लिए कैसे तहखाने झिल्ली अकड़न

Cancer Research
 

Summary

यहाँ हम biophysical microenvironment जहां crosslinking और तहखाने झिल्ली (बीएम) उन्नत ग्लिकेशन endproducts (उम्र) द्वारा प्रेरित की वृद्धि की कठोरता रोग प्रासंगिकता है मॉडलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल समझाओ।

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Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

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Abstract

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि biophysical उम्र से संबंधित विकृतियों और चयापचय विकारों (जैसे कैंसर, मधुमेह, microvascular रोग, रेटिनोपैथी, नेफ्रोपैथी और न्यूरोपैथी) के दौरान वृद्धि की मोटाई और तहखाने झिल्ली (बीएम) की कठोरता से संबंधित microenvironment अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन । मॉडल के आधार गैर enzymatic glycolaldehyde (GLA) के साथ इलाज के द्वारा पुनर्गठित बीएम (RBM) मैट्रिक्स की crosslinking Maillard प्रतिक्रिया के माध्यम से उन्नत ग्लिकेशन endproduct (उम्र) पीढ़ी को बढ़ावा देना है। प्रयोगशाला तकनीकों के उदाहरण है कि उम्र पीढ़ी, गैर एंजाइमी crosslinking पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जी एल ए में वृद्धि की कठोरता का इलाज किया RBM रेखांकित कर रहे हैं। भामिति विश्लेषण और immunofluorescent माइक्रोस्कोपी, सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide द्वारा अपने गैर एंजाइमी crosslinking द्वारा अपनी उम्र सामग्री: इनमें से निर्धारण के लिए मूल निवासी RBM और कठोर RBM (जीएलए के साथ इलाज) (फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस के साथ इलाज) की तैयारी शामिलजेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी, और इसके rheometry का उपयोग कर वृद्धि की कठोरता। प्रक्रिया यहाँ वर्णित RBM की कठोरता (लोचदार moduli, ई), 3.2 गुना तक बढ़ाने के लिए बनाम रोगग्रस्त मानव प्रोस्टेट ऊतक स्वस्थ में किए गए माप के साथ लगातार इस्तेमाल किया जा सकता है। biophysical उम्र बढ़ने और रोगग्रस्त प्रोस्टेट के साथ जुड़े microenvironment विश्राम करने के लिए ग्रंथि तीन प्रोस्टेट सेल प्रकार मूल निवासी RBM और कठोर RBM करने पर पेश किया गया: RWPE -1, प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं (पेक्स) एक सामान्य प्रोस्टेट ग्रंथि से निकाली गई; BPH-1, एक प्रोस्टेट ग्रंथि सौम्य prostatic hyperplasia (BPH) से प्रभावित से निकाली गई पेक्स; और PC3, मेटास्टेटिक कोशिकाओं को एक माध्यमिक हड्डी के ट्यूमर प्रोस्टेट कैंसर से होने से निकाली गई। एकाधिक मापदंडों आकार, आकृति और 3 डी ग्रंथियों बनाम कड़ी RBM देशी पर RWPE -1 और बीपीएच -1 द्वारा गठित acini की आक्रामक विशेषताओं, और औसत सेल लंबाई, प्रवासी वेग और 3 डी spher की सेल आंदोलन के हठ सहित मापा जा सकता हैएक ही परिस्थितियों में PC3 कोशिकाओं द्वारा गठित OIDs। सेल रास्ते और प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण संकेत भी मूल्यांकन किया जा सकता है।

Protocol

1. बी.एम. कठोरता के प्रेरण जीएलए उपचार से प्रेरित (गैर enzymatic Crosslinking)

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा बी.एम. मैट्रिक्स (10 एमएल) की एक जमे हुए शीशी पिघलना तक शीशी की सामग्री बन गए हैं तरल (8-16 घंटा) (एक ठंडे कमरे या फ्रिज में बर्फ पर खड़े)।
    सावधानी: एक ठंडे कमरे / रेफ्रिजरेटर नहीं किया जाता है, तो बर्फ के साथ पूरी बोतल को कवर किया। इस solidifying से बी.एम. के शेयर समाधान नहीं कर पाएगा।
  2. भविष्य प्रयोगों के लिए और दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए, बी.एम. मैट्रिक्स के प्रत्येक नए 10 मिलीलीटर शीशी से 25 x 0.4 मिलीलीटर aliquots तैयार करते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस निर्माता ने संकेत समाप्ति की तारीख तक पर स्टोर शीशियों। जब जरूरत, 4 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों 2 घंटे के लिए बर्फ पर खड़े पिघलना।
  3. बर्फ की एक भी सतह तैयार करें। बर्फ की चोटी पर एक 8 अच्छी तरह से चैम्बर गिलास स्लाइड कोटिंग प्रक्रिया के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान बनाए रखने के लिए रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर बी.एम. मैट्रिक्स की एक शीशी पिघलना।
    ध्यान दें: एक 0.4 मिलीलीटर बी.एम. मैट्रिक्स की शीशी सीओए के लिए पर्याप्त हैएक पूरे 1 एक्स 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड टी। शीशी बर्फ में शामिल किया है जबकि solidifying से बी.एम. मैट्रिक्स को रोकने के लिए से निपटने रखें।
  4. एक 200 μl पिपेट कैंची का उपयोग टिप के वितरण के अंत काट दिया। 4 डिग्री सेल्सियस तक कुंद-एंडेड 200 μl विंदुक टिप शांत और एक 200 μl क्षमता pipetting सहायता करने के लिए उस पर जगह है। विंदुक टिप में ठंड बी.एम. मैट्रिक्स समाधान के 40 μl ले लो और ठंडा 8 अच्छी तरह से चैम्बर गिलास स्लाइड पर एक कुएं में हस्तांतरण।
    नोट: बीएम समाधान के 40 μl 0.8 2 सेमी की एक सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त है। विंदुक युक्तियाँ कोटिंग प्रक्रिया के दौरान ठंडा बी.एम. समाधान के solidification से बचने के लिए रखें। बी.एम. मैट्रिक्स समाधान में हवा के बुलबुले को लागू करने और यह सुनिश्चित अच्छी तरह से समान रूप से किनारों पर एक दृश्य meniscus के गठन के बिना लेपित है मत करो।
  5. कुओं और कक्षों की आवश्यकता की संख्या के हिसाब से दोहराएँ कदम 1.4।
  6. कोटिंग के बाद, polymerization को बढ़ावा देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड जगहबी.एम. की। तरल RBM के अवांछित अशांति से बचने के लिए इनक्यूबेटर दरवाजा बंद को बहुत ध्यान से। 30 मिनट ऊष्मायन समय RBM जेल के निर्जलीकरण से बचने के लिए अधिक नहीं है।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप जेल मूल निवासी पुनर्गठन बीएम (RBM) है। 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन कदम 5% सीओ 2 की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, सुविधा के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (आर्द्रीकरण के साथ) पर सेट में इस कदम प्रदर्शन करते हैं।
  7. 50 मिमी glycolaldehyde (GLA) 0.2 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.8) में पतला तैयार करें। एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित।
    1. 50 मिमी जी एल ए के 250 μl के अंतिम मात्रा में एक crosslinking प्रतिक्रिया के लिए, 0.5 एम सोडियम cyanoborohydride या 100 मिमी जीएलए (2x शेयर) के 125 μl और 0.2 एम फॉस्फेट बफर के 100 μl (पीएच 7.8 करने के लिए 2.5 एम aminoguanidine के 25 μl जोड़ने )। एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा स्टॉक समाधान जीवाणुरहित।
      सावधानी: सोडियम cyanoborohydride एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, faceshield और श्वासयंत्र पहने हुए एक धूआं हुड में काम संभाल लेना।
  8. polymerized RBM जेल कवर और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते एक अर्द्ध कठोर RBM जेल या 14 घंटा एक कड़ा RBM जेल का उत्पादन करने का उत्पादन करने के लिए जी एल ए समाधान के 250 μl जोड़ें।
    नोट: जी एल ए की मात्रा polymerized RBM जेल कवर होगा जोड़ा गया है और उसी के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। अलग जीएलए ऊष्मायन बार उपयोग किया जाता है, तो RBM जैल (2.4 कदम देखें) RBM कठोरता में गुना वृद्धि निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 250 μl में एक देशी RBM जेल incubating द्वारा एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
    2. 50 मिमी सोडियम cyanoborohydride या 250 मिमी aminoguanidine के अलावा द्वारा, दो अतिरिक्त नियंत्रण जहां crosslinking प्रतिक्रिया के दौरान Schiff आधार या Amadori अभिवर्तन पुनर्व्यवस्था के गठन हिचकते हैं तैयार करें।
  9. तैयार 1 एम ग्लाइसिन ईthyl एस्टर (जी) पीबीएस में पतला। एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित।
  10. , जी एल ए नियंत्रण RBM जैल और नियंत्रण मूल निवासी RBM जैल से पीबीएस से अवरोधकों युक्त समाधान संकेत ऊष्मायन समय के बाद, ध्यान से Crosslinked RBM जैल से जीएलए समाधान निकालने। RBM जैल के सभी के लिए जी समाधान के 250 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: यह कदम crosslinking प्रतिक्रिया quenches।
  11. सभी RBM जैल जी एल ए और जी के सभी निशान को दूर करने के लिए 500 μl पीबीएस में 10 बार धोएं। RBM जैल उनकी निर्जलीकरण को रोकने के लिए पीबीएस के 400 μl में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    1. उम्र संचय, गैर एंजाइमी crosslinking और viscoelastic गुण (कदम 2.1-2.4) के लिए RBM जैल का विश्लेषण। उनकी viscoelastic गुण की rheometric विश्लेषण के लिए क्लोनिंग के छल्ले में RBM जैल (2.4 चरण) तैयार करें।
    2. सेल संस्कृति के लिए, RBM जैल कुल्ला 500 μl संस्कृति के साथ 2 बार मेरेकोशिकाओं को बोने से पहले दीया (चरण 5 और 6)। विंदुक टिप जेल सतह को छूने के बिना धीरे washes प्रदर्शन करना।

2. गैर enzymatic crosslinking और RBM की कठोरता की मात्रा जीएलए के साथ व्यवहार

  1. भामिति विश्लेषण
    1. में जीएलए इलाज उम्र संचय उपाय और भामिति विश्लेषण का उपयोग Maillard प्रतिक्रिया की सीमा निर्धारित करने के लिए RBM जैल नियंत्रित करते हैं।
      1. चरण 1.11 के बाद, 8 कुओं चैम्बर स्लाइड्स में RBM जैल से पीबीएस हटाने और 250 μl ठंडा दोहरा आसुत जल जोड़ें। 16-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं कि यह सुनिश्चित करने मैट्रिक्स पूरी तरह से तरलीकृत है।
        नोट: इस समाधान में RBM पेप्टाइड्स ऑटो फ्लोरोसेंट गुण के साथ उम्र के होते हैं।
      2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को तरलीकृत बी.एम. समाधान स्थानांतरण और समाधान के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य = 370 एनएम, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य = 440 एनएम) का उपयोग करने का फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को मापने।
  2. एसडीएस पृष्ठ विषैली गैस ब्रोमाइड पेप्टाइड्स का विश्लेषण
    1. एक polyacrylamide जेल पर जी एल ए का इलाज और नियंत्रण RBM जैल हल है कि जीएलए crosslinking और मैक्रो-तंतुओं के गठन के लिए प्रेरित किया गया है इस बात की पुष्टि करने के लिए।
      1. तरलीकृत बी.एम. समाधान कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर कदम 2.1.1.2 पर एकत्र अपकेंद्रित्र।
      2. 2 जी / विषैली गैस ब्रोमाइड acetonitrile में पतला मिलीग्राम से युक्त एक शेयर समाधान तैयार है।
        सावधानी: हमेशा के लिए एक धूआं हुड में विषैली गैस ब्रोमाइड संभाल जबकि एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, faceshield और श्वासयंत्र पहने।
      3. 20 मिलीग्राम / एमएल विषैली गैस ब्रोमाइड + 70% वी / वी फार्मिक एसिड के 500 μl में सतह पर तैरनेवाला, फिर से निलंबित बी.एम. जेल गोली निकालें और आरटी पर रातोंरात सेते हैं।
      4. एक आणविक वजन काट 3.5 केडीए के साथ एक डायलिसिस कैसेट में resuspended बी.एम. जेल गोली हस्तांतरण करने के लिए एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का प्रयोग करें।
      5. एक 500 मिलीलीटर कांच दोहरा आसुत जल की 500 मिलीलीटर और एक चुंबकीय हलचल बार युक्त बीकर में कैसेट डूब।यह एक चुंबकीय उत्तेजक पर रखें और (एक ठंडे कमरे में) रातोंरात dialyze 4 डिग्री सेल्सियस पर (16 घंटा) विषैली गैस ब्रोमाइड और फार्मिक एसिड के सभी निशान हटाने के लिए।
      6. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कैसेट से dialyzed बी.एम. समाधान के हस्तांतरण के लिए एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का प्रयोग करें।
      7. एक 12% वी / वी polyacrylamide जेल 10,11 पर प्रत्येक बी.एम. नमूने के 25 μl का विश्लेषण करें। एसडीएस पृष्ठ के बाद, विषैली गैस ब्रोमाइड मैट्रिक्स पेप्टाइड्स 13 के electrophoretic पैटर्न कल्पना करने के लिए polyacrylamide जेल 12 की चांदी धुंधला बाहर ले।
  3. Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
    1. जीएलए के immunofluorescent धुंधला इलाज किया प्रदर्शन और साथ एंटी-एज / pentosidine, विरोधी कोलेजन चतुर्थ और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया crosslinked RBM में जमा उम्र और कोलेजन चतुर्थ / laminin फाइबर संरचनात्मक rearrangements कल्पना करने के लिए विरोधी laminin एंटीबॉडी जैल 13 RBM जैल नियंत्रित करते हैं।
      नोट: हमेशा Enti को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोगincubations और विंदुक टिप के साथ RBM सतह को छूने के बिना washes के दौरान RBM जेल पुन। इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा 3 डी acini संस्कृतियों का विश्लेषण करने की जानकारी के लिए संदर्भ 6 देखते हैं और 3 डी acini के confocal माइक्रोस्कोपी के लिए संदर्भ 14 देखें।
      1. धो जीएलए पीबीएस + के 300 μl आरटी पर (पीबीएस युक्त 0.1 मिमी 2 CaCl और 0.5 मिमी 2 MgCl) 5 मिनट के लिए के साथ 8 कुओं कक्ष स्लाइड में इलाज और नियंत्रण RBM जैल 2 बार।
      2. हटाये पीबीएस + तो डब्ल्यू / वी paraformaldehyde (पीएफए) पीबीएस + में पतला प्रत्येक RBM जेल कवर करने के लिए 4% की 300 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं RBM घटकों को ठीक करने के लिए।
      3. 4% w / पीएफए ​​समाधान वी निकालें। 75 मिमी एनएच 4 सीएल + 0.5 मिमी 2 MgCl समाधान के 300 μl जोड़ें और (दोहराने 5x) आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते निर्धारण बुझाने के लिए।
      4. 130 मिमी NaCl, 7 मिमी ना 2 HPO 4, 3.5 मिमी NAH: बाँझ पानी में निम्नलिखित समाधान बनाकर इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर (बफर यदि) तैयार करें2 4 पीओ, 7.7 मिमी NaN 3, 0.1% w / v गोजातीय सीरम albumin, 0.5% वी / वी पॉलीथीन ग्लाइकोल tert- octylphenyl आकाश और 0.05% वी / वी पॉलीथीन ग्लाइकोल Sorbitan monolaurate।
      5. यदि सप्लीमेंट द्वारा बफर अवरुद्ध तैयार करते हैं 20% वी / वी बकरी सीरम के साथ बफर।
      6. शमन समाधान निकालें और RBM जैल के लिए बफर अवरुद्ध अविशिष्ट प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए अगर 300 μl जोड़ें। एक मिलाते हुए मंच पर आरटी पर 2 घंटा सेते हैं।
      7. यदि अवरुद्ध बफर निकालें और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 300 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए RBM जैल सेते हैं बफर अवरुद्ध अगर में (1: 500 माउस विरोधी pentosidine एमएबी; 1/250 खरगोश विरोधी कोलेजन चतुर्थ PAB; 1 / 250 खरगोश विरोधी laminin ए / सी PAB)।
        नोट: अब से 20 घंटे के लिए incubations 4 डिग्री सेल्सियस पर RBM पतला कर सकते हैं।
      8. एक मिलाते हुए मंच पर प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और कमरे के तापमान पर अगर बफर के 300 μl के साथ 3 बार (10 मिनट प्रत्येक) धो लें।
      9. यदि बफर निकालें औरयदि अवरुद्ध बफर में 500: एक fluorochrome 1 पतला साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 300 μl (बकरी विरोधी खरगोश या विरोधी माउस आईजीजी [एच + L]) जोड़ें। एक मिलाते हुए मंच पर आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
      10. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए यदि बफर के 300 μl में सेते हैं। यदि बफर निकालें और कमरे के तापमान पर पीबीएस + के 300 μl में 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
      11. फिक्स और एक दूसरी बार बुझाना, के रूप में (कदम 2.3.1.2 और 2.3.1.3) ऊपर वर्णित है।
      12. बढ़ते मीडिया में दाग RBM जैल माउंट और epifluorescent या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रमुख घटकों के घने बंडलों के गठन का विश्लेषण।
        नोट: immunofluorescence द्वारा 3 डी acini संस्कृतियों का विश्लेषण करने के विवरण के संदर्भ 6 देखते हैं और epifluorescent और 3 डी acini के confocal माइक्रोस्कोपी के लिए संदर्भ 14 देखें।
  4. rheological विश्लेषण
    1. जीएलए के rheometric विश्लेषण इलाज किया प्रदर्शन और RBM जैल नियंत्रण उनके वी को मापने के लिएiscoelasticity (कठोरता)।
      1. RBM जैल कि 1 मिमी 8 मिमी की एक व्यास के साथ एक परिपत्र सांचे में मोटी हैं सेट करें। ऐसा करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से अंदर एक क्लोनिंग की अंगूठी (8 मिमी व्यास) जगह और बीएम मैट्रिक्स समाधान के लिए कदम 1.3-1.6 में वर्णित के रूप में तैयार जोड़ें।
        नोट: प्रयोगों के लिए इस्तेमाल RBM जैल की सटीक आवृत्ति के लिए, rheometric विश्लेषण के लिए तैयार RBM जैल एक ही सतह क्षेत्र और RBM जैल 8 अच्छी तरह से कक्षों में सेट अप के रूप में मोटाई की आवश्यकता है। RBM जैल चित्रा 3 में विश्लेषण 1 मिमी मोटी और व्यास में 8 मिमी थे।
      2. के रूप में (1.11 कदम करने के लिए 1.8) ऊपर वर्णित 14 घंटे के लिए RBM जैल पीबीएस, जी एल ए 6 घंटे के लिए और जी एल ए के साथ क्लोनिंग के छल्ले में स्थापित समझो।
      3. एक 8 मिमी समानांतर थाली दाँतेदार ज्यामिति के साथ एक rheometer पर 8 मिमी व्यास RBM जैल की लोचदार मापांक (ई) को मापने, 1-3% तनाव की एक सीमा से अधिक, 1Hz की एक निश्चित आवृत्ति दोलन और 21 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर। के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिएईसीएम जैल के rheometric विश्लेषण संदर्भ के संदर्भ 13,15,16 देखते हैं।
        नोट: ई 'निम्नलिखित समीकरण E = 2 * के उपयोग के माध्यम जी परिणामस्वरूप कतरनी भंडारण मापांक (G)' से निर्धारित किया जाता है * (1 + V) जहां वी, संदर्भ 13,15 में वर्णित के रूप में 0.5 की पॉसों के अनुपात है 16।

3. संस्कृति और सामान्य पीईसी लाइन की हैंडलिंग, RWPE -1

  1. बढ़ो RWPE -1 keratinocyte सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं (KSFM) 5 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ पूरक, 50 माइक्रोग्राम / एमएल गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (BPE) और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 50 यू / एमएल पेनिसिलिन ( पूरा KSFM)।
    नोट: उपकला करने वाली mesenchymal की प्रेरण से बचने के लिए (EMT) की तरह संक्रमण सीरम को RWPE-1 कोशिकाओं का खुलासा नहीं करते। अनुमति दें पूरा KSFM 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से निकालने के बाद 30 मिनट के लिए आरटी पहुँचने के लिए और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के रूप में इस EGF और BPE निष्क्रिय करेगा में गर्म नहीं करना है।
  2. महाप्राण पूराRWPE -1 कोशिकाओं का एक मिला हुआ 10 सेमी 2 थाली से KSFM, पूर्व गर्म पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला और 5 0.05% की मिलीलीटर वी / वी सुनिश्चित करना है कि सभी कोशिकाओं समाधान के साथ कवर कर रहे हैं trypsin जोड़ें।
    1. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर की 5 से 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (आर्द्रीकरण के साथ) मानक की स्थिति पर सेट में कोशिकाओं की जगह। 5 मिनट के बाद trypsinization की हद तक की जाँच करें और धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए संस्कृति की थाली नल।
      नोट: RWPE-1 कोशिकाओं trypsinization की लंबी अवधि को बर्दाश्त नहीं है तो यह एक ही समय में अधिक से अधिक दो प्लेटों को संभालने के लिए नहीं की सलाह दी है। यह भी प्रतिरूप चयन से बचने के लिए थाली से सभी कोशिकाओं को अलग कर देना महत्वपूर्ण है।
  3. जब सभी RWPE-1 कोशिकाओं disassociated है, 2% वी / वी भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त trypsin बुझाने के लिए गर्म पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरित करने से पहले सेल समुच्चय को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
  4. 125-150 पर disassociated कोशिकाओं अपकेंद्रित्र x25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जी, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और जब तक एकल कक्षों के निलंबन प्राप्त की है पूरी KSFM के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं की गोली फिर से निलंबित।
  5. स्थानांतरण एक नया ट्यूब में फिर से निलंबित कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर और एक 1 पर कोशिकाओं का प्रचार करने के लिए पूरा KSFM के 9 मिलीलीटर जोड़ें: बाद में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए 5 बीतने के कमजोर पड़ने। acini की स्थापना के लिए एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं के बाकी गणना (धारा 5.1 देखें)।
    नोट: संस्कृति के बाद लंबी अवधि के बाद से 10 से अधिक मार्ग के लिए मत संस्कृति RWPE-1 कोशिकाओं वे सही वास्तुकला के साथ acini फार्म नहीं है।
  6. संस्कृति मीडिया बदलें सुनिश्चित करने के लिए EGF और BPE सक्रिय रहते हैं हर 48 घंटा।
    नोट: किसी भी उपचार है कि 48 घंटा से आगे बढ़ाने के लिए इस माध्यम का परिवर्तन को शामिल करें।

4. संस्कृति और बीपीएच सेल लाइन की हैंडलिंग, बीपीएच -1

  1. संस्कृति बीपीएच -1 RPMI में कोशिकाओं 1640 मीडिया के साथ 5% वी / वी एफसीएस पूरित, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन। गर्मसंस्कृति मीडिया, पीबीएस और 0.25% w / v उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक trypsin-0.53 एम EDTA समाधान।
    नोट: प्रकोष्ठों भी 2.5% वी / वी एफसीएस 8 के साथ मीडिया में संवर्धित किया जा सकता।
  2. BPH-1 कोशिकाओं का एक मिला हुआ 10 सेमी 2 थाली से संस्कृति मीडिया Aspirate और कोशिकाओं सीरम के साथ संस्कृति मीडिया के सभी निशान कि trypsin प्रतिक्रिया बुझा सकता है दूर करने के लिए पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 2 एक्स धो लें।
  3. पीबीएस Aspirate और कोशिकाओं को कवर करने के लिए trypsin EDTA के समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें। एक मशीन 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और (आर्द्रीकरण) के साथ 5% सीओ 2 पर सेट में थाली रखें। trypsin EDTA के समाधान निकालें जब कोशिकाओं गोल कर रहे हैं, लेकिन पकवान में जुड़े रहते हैं। पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  4. पीबीएस के हटाने के बाद, एकल कक्षों के निलंबन का उत्पादन करने के लिए संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  5. पूरा मीडिया के 8 मिलीलीटर के साथ एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर ले लो और BPH-1 कोशिकाओं थाली ONTबाद में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए 5 बीतने के कमजोर पड़ने: OA 10 सेमी 2 संस्कृति एक 1 पर थाली। acini की स्थापना के लिए एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं के बाकी गणना (धारा 5.2 देखें)।
    नोट: बीतने संख्या का एक रिकॉर्ड रखें पुराने बीपीएच -1 कोशिकाओं के रूप में एक उचित वास्तुकला के साथ acini फार्म नहीं है। एक मार्ग संख्या 10 से अधिक वांछित नहीं है।
  6. संस्कृति मीडिया बदलें हर 72 घंटा।

मूल निवासी है और कठोर RBM पर प्रोस्टेट ग्रंथि acini की 5. 3 डी संस्कृति

  1. बीएम समाधान के 2% वी / वी के साथ पूरक RWPE-1 कोशिकाओं, acini फार्म 5,000 पूरा KSFM के 300 μl में 3.5 चरण में तैयार कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।
  2. BPH-1 कोशिकाओं, acini फार्म 2,500 बी.एम. समाधान के 2% वी / वी के साथ पूरक RPMI 1640 संस्कृति मीडिया के 300 μl में 4.5 कदम में तैयार कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।
    नोट: बीपीएच-1 कोशिकाओं RWPE-1 कोशिकाओं की तुलना में बड़ा बीपीएच-1 कोशिकाओं की इतनी कम संख्या संस्कृति के 6 दिन बाद acini का एक समान वितरण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाता हैसंरचना।
  3. धीरे देशी और आयु stiffened RBM पर कोशिकाओं बीज के लिए और ध्यान से एक मशीन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सेट में संस्कृतियों जगह (आर्द्रीकरण) के साथ एक और भी अच्छी तरह से और कहा कि प्रत्येक कोशिका विभाजित बढ़ रही acini का वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक acina उत्पादन करने के लिए।
  4. हर 2 दिन सुनिश्चित करने के लिए है कि कोशिकाओं के विकास के कारकों सामान्य acina के लिए आवश्यक है 2% वी / वी बी एम समाधान युक्त ताजा संस्कृति मीडिया के साथ संस्कृति मीडिया की जगह homeostasis।
  5. Brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 13 से बढ़ संस्कृतियों में कोष्ठकी आकृति विज्ञान मॉनिटर।
    नोट: संस्कृति में 3 दिनों के बाद व्यक्ति की कोशिकाओं> 3 कोशिकाओं का एक समूह के रूप में होगा और ~ की एक व्यास के साथ 1 सप्ताह प्रोस्टेट ग्रंथि acini के बाद 50 माइक्रोन मनाया जाएगा।
  6. 2.3 में वर्णित सेल मैट्रिक्स आसंजन, सेल सेल adhesions, apico-बेसल polarity और invasiveness 13 के मार्करों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence प्रदर्शन करने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें।

6. प्रोस्टेट के 3 डी संस्कृति के मूल निवासी और कठोर RBM पर ट्यूमर सेल समुच्चय

  1. 1640 RPMI माध्यम में संस्कृति PC3 कोशिकाओं से युक्त 10% वी / वी एफसीएस और 50 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन। उपयोग करने से पहले संस्कृति मीडिया, पीबीएस और 0.25% w / v trypsin-0.53 एम EDTA समाधान गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. PC3 कोशिकाओं का एक मिला हुआ 10 सेमी 2 संस्कृति पकवान से संस्कृति मीडिया Aspirate और धोने कोशिकाओं पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 2x एफसीएस के सभी निशान कि trypsin प्रतिक्रिया बुझाने कर सकते हैं हटा दें।
  3. पीबीएस Aspirate और कोशिकाओं को कवर किया और 1 मिनट के लिए सेते हैं trypsin EDTA के समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. कोशिकाओं गोल हो जाते हैं, लेकिन पकवान से जुड़ी रहना, ध्यान से trypsin-EDTA समाधान aspirate और पीबीएस के 3 मिलीलीटर से धो लें जबtrypsin के सभी निशान को हटा दें।
  5. पीबीएस के हटाने के बाद, एकल कक्षों के निलंबन का उत्पादन करने के लिए संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  6. एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में PC3 सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर ले लो और संस्कृति मीडिया के 9 मिलीलीटर जोड़ें। बाद में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए एक 10 सेमी 2 संस्कृति पकवान (1:10 कमजोर पड़ने) पर कोशिकाओं थाली। एक hemocytometer का उपयोग शेष कोशिकाओं की गणना।
  7. बीएम समाधान के 2% वी / वी के साथ पूरक RPMI 1640 संस्कृति मीडिया के 300 μl में कदम 6.6 में तैयार संस्कृति में एक ढाल जेल के गठन के लिए अनुमति देने के लिए 2,500 PC3 कोशिकाओं पतला।
  8. धीरे देशी और आयु stiffened RBM पर कोशिकाओं बीज के लिए और ध्यान से इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (आर्द्रीकरण के साथ) पर सेट में संस्कृति अच्छी तरह से जगह में spheroids बढ़ रही है का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
  9. संस्कृति मीडिया बदलें हर 72 घंटा।
  10. कड़ी (आयु अमीर) RBM के प्रभाव का अध्ययन करने के लिएप्रोस्टेट ट्यूमर सेल प्रवास, छवि PC3 brightfield वीडियो समय चूक तापमान / सीओ 2 नियंत्रण और एक humidified कक्ष 17 का उपयोग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं पर।
    नोट: PC3 कोशिकाओं मूल निवासी RBM पर किस्में में आगे बढ़ने और एक लुमेन के साथ acini फार्म नहीं है, लेकिन अगर मूल निवासी RBM पर 72 से अधिक मानव संसाधन विकसित करने के लिए छोड़ दिया है वे 3 डी spheroids बनेगी।
  11. डाटा अधिग्रहण के बाद, मैन्युअल PC3 कोशिकाओं को ट्रैक और उनके पलायन की गति, आकार (बढ़ाव अनुपात) और पलायन 17-19 के हठ की गणना।
    नोट: हठ = अनुपात डी / टी, डी = दूरी शुरू से ही सेल प्रक्षेपवक्र, टी = सेल प्रक्षेपवक्र की कुल लंबाई का अंत करने के लिए।

Representative Results

कड़ी RBM पर 3 डी प्रोस्टेट acini संवर्धित

संस्कृति में 6 दिनों के बाद, पेक्स सामान्य प्रोस्टेट ऊतकों से निकाली गई (RWPE-1) (चित्रा 1 ए) और बीपीएच ऊतक (बीपीएच-1) (चित्रा 1 बी) के मूल निवासी (पीबीएस इलाज) RBM तरफ के फार्म का acini कि उपकला की वर्दी spheroids में आयोजित कर रहे हैं कोशिकाओं। ये acini भी शिखर करने वाली बेसल polarity और एक दृश्य ल्यूमिनल अंतरिक्ष 13,20 के साथ उच्च स्तरीय आयोजन पेक्स के लक्षण हैं।

Acini सामान्य प्रोस्टेट ऊतकों से निकाली गई पेक्स द्वारा गठित (RWPE-1) (चित्रा 1 ए) और stiffened (आयु अमीर) RBM (जीएलए के साथ इलाज) पर बीपीएच ऊतक (बीपीएच-1) (चित्रा 1 बी) के एक बाधित वास्तुकला (स्थानांतरण आकार और कोशिकाओं में बहुभुज को गोलाकार से फैला हुआ / आयु अमीर RBM) (चित्रा 1 ए में acini से पलायन)। इन acini भी अत्यधिक बेतरतीब पेक्स कि एक छोटे या न के बराबर ल्यूमिनल अंतरिक्ष 13 के साथ उनकी शिखर करने वाली बेसल polarity खो दिया है की विशेषता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं मूल निवासी है और कठोर पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) के रूप में 3 डी ग्रंथियों acini बढ़ी (ए) RWPE -1 कोशिकाओं के Brightfield छवियों पीबीएस (देशी) या के साथ इलाज किया RBM जैल पर 6 दिनों के लिए 12 घंटे तक के लिए हो 14 घंटा (; कड़ी आयु अमीर) के लिए 50 मिमी glycolaldehyde; स्केल बार 50 माइक्रोन =। (बी) बीपीएच-1 कोशिकाओं, के रूप में पैनल में वर्णित बड़े हो; स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन; डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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तालिका 1:। प्रोस्टेट उपकला RWPE -1 acini के लक्षण मूल निवासी, अर्द्ध कठोर और कठोर पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) पर हो RWPE -1 acini (GLA RBM 14 घंटा (देशी), glycolaldehyde के लिए पीबीएस के साथ पूर्व इलाज पर बड़े हो रहे थे ) 6 घंटे के लिए (अर्द्ध कठोर) या 14 घंटा (कठोर) के लिए जी एल ए। कोष्ठकी आकार के लिए, प्रतिशत (%) दौर के मानक विचलन (एसडी) ±, अर्द्ध बहुभुज और बहुभुज acini 5 स्वतंत्र प्रयोगों से गणना की गई है (50 acini शर्त के अनुसार मात्रा निर्धारित)। सापेक्ष कोष्ठकी आकार 3 स्वतंत्र प्रयोगों से (देशी RBM = 100%) की गणना की गई। invasiveness के लिए, ± एक या एक से अधिक फैला हुआ कोशिकाओं के साथ एसडी acini% 3 स्वतंत्र प्रयोगों से गणना की गई। मोड़ो परिवर्तन मूल निवासी की स्थिति के लिए संगत मान द्वारा अर्द्ध कठोर या कठोर शर्तों के तहत प्राप्त औसत मूल्य विभाजित करके गणना की है। पी मूल्यों छात्र टी-परीक्षण (α = 0.05) का उपयोग कर की गणना की।

ontent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> आयु निर्भर वृद्धि हुई RBM कठोरता PC3 प्रोस्टेट ट्यूमर सेल प्रवास को बढ़ावा देता है

PC3 कोशिकाओं मूल निवासी RBM पर हो एक दूसरे को (2A चित्रा) से स्वतंत्र रूप से, निरंतर सेल सेल से संपर्क बनाए रखने के द्वारा विस्थापित जबकि PC3 कोशिकाओं की उम्र अमीर (कठोर) पर हो RBM चाल। बाद संस्कृति PC3 कोशिकाओं में 72 घंटा देशी पर foci (spheroids) फार्म (पीबीएस इलाज) RBM, जबकि पर कड़ा (आयु अमीर) RBM PC3 कोशिकाओं spheroids से नहीं करते हैं और स्वतंत्र रूप से विस्थापित (चित्रा 2 बी)। कड़ी (आयु अमीर) RBM पर PC3 कोशिकाओं मूल निवासी RBM (चित्रा -2) पर हो PC3 कोशिकाओं की तुलना में अधिक लम्बी कर रहे हैं। कड़ी RBM पर PC3 कोशिकाओं मूल निवासी RBM (चित्रा 2 डी) पर हो PC3 कोशिकाओं की तुलना में तेजी से पलायन। कड़ी RBM पर PC3 कोशिकाओं दृढ़ता में कमी प्रदर्शित मूल निवासी RBM (चित्रा 2 ई) पर हो PC3 कोशिकाओं की तुलना में।

चित्रा 2:। मूल निवासी है और कठोर पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) पर प्रोस्टेट ट्यूमर सेल प्रवास (ए) 14 घंटे के लिए पीबीएस (देशी) या 50 मिमी glycolaldehyde के साथ इलाज किया RBM जैल पर हो PC3 कोशिकाओं के Brightfield छवियों (आयु अमीर, कठोर) । प्रकोष्ठों एक brightfield माइक्रोस्कोप (10X उद्देश्य) और 12 सेल प्रक्षेप पथ उत्पन्न करने के लिए ट्रैकिंग के द्वारा पीछा घंटे के लिए प्रति घंटा 1 छवि के अधिग्रहण दर का उपयोग imaged थे। दिखाया छवियाँ 0, 3, 6, 9 और 12 घंटे के बाद समय बिंदुओं के अनुरूप हैं। एकल कक्षों के trajectories 12 घंटा समय बिंदु के लिए दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) PC3 कोशिकाओं 72 घंटे के लिए देशी या कड़ा RBM पर सुसंस्कृत, और imaged पैनल (ए) में वर्णित है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। विस्तार 2X बढ़ाई चयनित क्षेत्र से पता चलता है। (सी) मतलब ± एसडी सेल लंबाई (माइक्रोन); मूल निवासी RBM और कठोर RBM के बीच महत्वपूर्ण अंतर (पी = 1.2 x 10 -23)। ( (ई) मतलब ± एसडी सेल आंदोलन के हठ (अनुपात डी / टी, जहां डी = शुरू से ही सेल प्रक्षेपवक्र, टी = सेल प्रक्षेपवक्र की कुल लंबाई के अंत करने के लिए दूरी); मूल निवासी RBM और कठोर RBM (पी = 0.0007) के बीच महत्वपूर्ण अंतर है। पैनलों सीई> 10 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया के लिए, डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

शुद्ध RBM जैल 6 में से 3 डी MECS ग्रंथियों acini की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल 4 मिलीग्राम / एमएल प्रकार के अलावा मैं RBM मैट्रिक्स के लिए कोलेजन द्वारा पिछले एक अध्ययन में संशोधित किया गया था। कोलेजन के अलावा RBM जेल से 175 ± 37 1589 ± 380 पास्कल को बढ़ाने की लोचदार मापांक में हुई। कठोरता में यह 9.1 गुना वृद्धि विकास, अस्तित्व, प्रवास और MECS 21 के भेदभाव संग्राहक। - (-) - राइबोज़ प्रकार मैं कोलेजन कि RBM जेल में जोड़ा गया था की गैर enzymatic crosslinking बढ़ावा देने के लिए प्रोटोकॉल डी के साथ एक इलाज के कदम शामिल करके फिर से संशोधित किया गया था। कठोरता में परिणामी 15 गुना वृद्धि MECS की ऑन्कोजेनिक परिवर्तन के साथ सहयोग करने की अपनी आक्रामक व्यवहार 22 बढ़ावा देने के लिए मिला था। उनका कहना है प्रकार की प्रयोगात्मक दृष्टिकोण मैं RBM जैल के लिए कोलेजन कोलेजन फाइबर, जो केवल स्ट्रोमा के बीच शारीरिक बाधा के बाद मानव ऊतकों में होता है साथ MECS की सीधी बातचीत की सुविधाऔर बीएम द्वारा प्रदान की उपकला प्रोटिओलिटिक गिरावट आए। शुद्ध RBM जैल जीएलए के साथ पूर्व इलाज में पेक्स से 3 डी ग्रंथियों acini पैदा करके, मौजूदा प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए कैसे बी.एम. कठोरता से प्रति उनकी आक्रामक व्यवहार (चित्रा 3) को गति प्रदान कर सकते हैं रास्ता खुल जाता है। बी.एम. कठोरता के स्तर में इस प्रोटोकॉल में प्रेरित शारीरिक प्रासंगिकता है। 6 घंटा और 14 घंटे के लिए 50 मिमी जीएलए के साथ ऊष्मायन क्रमश: 175 ± 90 और 322 ± 160 शुद्ध RBM जेल की लोचदार moduli वृद्धि हुई पीबीएस (तालिका 1) के साथ इलाज RBM जैल में 122 ± 55 पास्कल की तुलना में। RBM कठोरता में यह 1.7 के लिए 3.2 गुना वृद्धि सामान्य प्रोस्टेट या BPH ऊतक 23-26 की तुलना में घातक में मनाया कठोरता में 2.5 3.4 गुना वृद्धि का स्मरण दिलाता है। जैसा कि पीईसी acini में उम्र और RBM कठोरता के संचय से प्रेरित 13 morphological परिवर्तन हाल के एक प्रकाशन में उल्लिखित गिरफ्तारी से एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बदलाव के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैबहुभुज आकार के ounded, ल्यूमिनल / कुल कोष्ठकी क्षेत्र, और उम्र के अमीर RBM (चित्रा 3) में acina से पलायन फैला हुआ कोशिकाओं की कमी हुई। Immunoblotting भी EMT के मार्कर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सिकुड़ा व्यवहार (जैसे फॉस्फोरिलेटेड मायोसिन प्रकाश श्रृंखला -2, pMLC2 13) बनाम कड़ी RBM सामान्य में उगाया पेक्स में (चित्रा 3) (ई cadherin 13 के जैसे हानि)। Immunofluorescent धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग आगे मूल्यांकन बी.एम. कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के laminin, कोलेजन चतुर्थ और उम्र संचय 13), सेलुलर शिखर करने वाली बेसल polarity (EEA1 की जैसे शिखर स्थानीयकरण: जल्दी endosomal प्रतिजन 1; और GM130: 130 केडीए सीआईएस Golgi मार्कर 13) और आसंजन अणुओं के सेलुलर पैटर्न (सेल सेल जंक्शनों से 13 जैसे ई cadherin स्थानीयकरण) (चित्रा 3)।

चित्रा 3:। विभिन्न यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का अवलोकन आरेख को दर्शाया गया है तैयार करने और पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) glycolaldehyde (Maillard प्रतिक्रिया) के साथ, कैसे कठोर RBM करने पर कोशिकाओं बीज के लिए, कैसे कठोर RBM विश्लेषण करने के लिए ठोस बनाना करने के लिए कैसे ( Maillard प्रतिक्रिया) और प्रक्रियाओं है कि उम्र के अमीर RBM से प्रेरित सेलुलर और आणविक परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की हद तक। उम्र, उन्नत ग्लिकेशन endproducts; बी.एम., तहखाने झिल्ली; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, जल्दी endosomal प्रतिजन 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; जी एल ए, glycolaldehyde; जी, ग्लाइसिन एथिल एस्टर; GM130, 130 केडीए सीआईएस Golgi मार्कर; पी-MLC2 (Thr18 / Ser19), मायोसिन प्रकाश श्रृंखला -2 स्थलों पर phosphorylated 18 और 19 सेरीन threonine; RBM, पुनर्गठन तहखाने झिल्ली; एसडीएस पृष्ठ, सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन। RWPE1 acini स्केल पट्टी के लिए = 10 माइक्रोन; PC3 ट्यूमर सेल के लिएspheroids स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ 13 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

- (-) - राइबोज़ RBM के लिए crosslinking एजेंट के रूप में चुना है यदि D समस्या निवारण चरण आवश्यक हो जाएगा। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान यह पाया गया कि 1 एम डी के साथ उपचार - (-) - 72 घंटे के लिए राइबोज़, पहले RBM / कोलेजन जैल 22 के लिए वर्णित के रूप में, निर्जलीकरण और RBM जैल की सिकुड़न में हुई। - (-) - डी की कम सांद्रता के मूल्यांकन राइबोज़ और कम उपचार बार इस सीमा को पार करने के लिए मदद मिल सकती है।

जहां RBM कठोरता के उच्च स्तर वांछित हैं प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में एक संभावित सीमा से सामना हो सकता है। अब ऊष्मायन बार और जी एल ए के उच्च सांद्रता RBM जेल कठोरता के उच्च स्तर को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह जरूरी होगा आकलन इन उपचार की स्थिति सेल अस्तित्व और प्रसार पर प्रभाव पड़ता है, चाहे के रूप में पहले 13 में वर्णित है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीरम के साथ RWPE-1 कोशिकाओं के ऊष्मायन एक प्ररूपी EMT-जैसे संक्रमण और सीरम या सीरम युक्त सामग्री के लिए जोखिम से बचा जाना चाहिए लाती है। उदाहरण के लिए, यदि प्रयोगों कम आरएनए (siRNA) ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स हस्तक्षेप के अभिकर्मक शामिल है, प्रक्रिया KSFM में उगाया RWPE -1 कोशिकाओं का उपयोग कम सीरम अभिकर्मक मीडिया के लिए कोशिकाओं स्विचन के बिना अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस खामी जीन के स्तर से समझौता कर सकता हासिल मुंह बंद जब क्षणिक siRNA का उपयोग कर मॉडल में दृष्टिकोण। कुछ प्रोटीन लक्ष्य के लिए यह ट्यून करने योग्य जीन मुंह बंद करने और प्रोटीन के स्तर में कमी के लिए वांछित inducible shRNA वैक्टर को रोजगार के लिए सलाह दी है। रूपांतरों कि stromal सेल या ट्यूमर सेल जुड़े lysyl oxidase (LOX) 17 से एंजाइमी crosslinking को शामिल भी भविष्य के मॉडलों में शामिल किया जा सकता है।

jove_content "> इस प्रोटोकॉल समर्थक आक्रामक (RWPE -1, बीपीएच -1) पेक्स में उम्र पर निर्भर बी.एम. कठोरता से शुरू हो रहा तंत्र और आक्रामक पीटीसी (PC3) में विरोधी मेटास्टेटिक लक्ष्यों के मूल्यांकन के भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी। यह देखते हुए कि बीपीएच एक चयापचय विकार 27 माना जाता है, इस प्रोटोकॉल भी चयापचय विकारों और बढ़ प्रोस्टेट कैंसर के खतरे के बीच की कड़ी के बारे में हमारी समझ में सुधार की दिशा में मार्ग प्रशस्त। बी.एम. को देखते हुए कठोरता उम्र के लिए अपने जोखिम से प्रेरित अन्य कैंसर में invasiveness के लिए एक ट्रिगर हो सकता है कि प्रकार, यह प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए इसी तरह के मॉडल है कि अन्य अंगों (जैसे स्तन, पेट, अंडाशय, अग्न्याशय) से सामान्य उपकला कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं को शामिल स्थापित करने के लिए ब्याज की हो जाएगा।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है, साथ में उनकी समय के साथ, चित्रा 4 में संक्षेप हैं। प्रारंभिक कदम के दौरान यह 4 डिग्री सेल्सियस पर RBM के शेयर समाधान बनाए रखने के लिए यह अपनी नीति को रोकने के लिए thaws जबकि आवश्यक हैymerization। जब तक वे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा कर दिया है पिपेट सुझावों के आरएम शेयर समाधान में नहीं रखा जाना चाहिए। अगले कदम के लिए यह भी सुनिश्चित करने के लिए कक्ष स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस तक equilibrated है इससे पहले कि वे RBM समाधान के साथ लेपित हैं महत्वपूर्ण है। जैसे ही RBM समाधान के तापमान 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर की वृद्धि हुई है यह अपरिवर्तनीय polymerization एक जेल के रूप में करने से गुजरना होगा। यह जरूरी है RBM सुनिश्चित करने के लिए कि यह रूपों एक भी सेल संस्कृति और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए उपयुक्त सतह polymerization चरण के दौरान परेशान नहीं है कि। के साथ या Maillard प्रतिक्रिया (सोडियम cyanoborohydride और amingoguanidine) के अवरोधकों के बिना जी एल ए के साथ ऊष्मायन की अवधि निर्धारित होगा कि कैसे कड़ी RBM जेल हो जाता है। यह जीएलए के साथ एक 6 घंटा ऊष्मायन का उपयोग करने के लिए अगर अर्द्ध कठोर शर्तों के लिए आवश्यक हैं की सिफारिश की है, और 14 घंटा ऊष्मायन यदि कड़ी शर्तों के लिए आवश्यक हैं (तालिका 1)। वैकल्पिक ऊष्मायन बार या जीएलए की सांद्रता विभिन्न स्तरों यदि इस्तेमाल किया जा सकताकठोरता के वांछित हैं। RBM जैल के इस मामले रियोलॉजिकल विश्लेषण में एक आवश्यक कदम के रूप में शामिल किए जाने की जरूरत है। और पीबीएस के साथ बाद में धोने कदम जी के साथ ऊष्मायन से Maillard प्रतिक्रिया शमन के कदम के बाद, RBM जैल तुरंत इस्तेमाल किया या सेल संस्कृति के लिए उनके उपयोग करने से पहले अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक बार सेल संस्कृतियों स्थापित कर रहे हैं यह हर दो दिन (किसी भी उपचार सहित) संस्कृति के माध्यम से बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। यह जांच के तहत मापदंडों के अनुसार 3-12 दिनों के लिए 3 डी सेल संस्कृतियों को बनाए रखने की सिफारिश की है। 3 डी के लिए पीईसी acini यह 3 डी पीटीसी spheroids विश्लेषण पहले उदाहरण में संस्कृति के 3 दिनों के बाद सिफारिश की है के लिए 6 दिनों के बाद संस्कृतियों का विश्लेषण करने की सिफारिश की है, और।

चित्रा 4
चित्रा 4:। महत्वपूर्ण कदम है और समय के साथ प्रोटोकॉल का सरल अवलोकन संकेत Floडब्ल्यू आरेख को दर्शाया गया है तैयार करने और पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) महत्वपूर्ण कदम है और संकेत समय के साथ glycolaldehyde (Maillard प्रतिक्रिया) के साथ ठोस बनाना करने के लिए कैसे। अंक जहां प्रोटोकॉल रोका जा सकता है, और RBM जैल संग्रहीत है, यह भी संकेत कर रहे हैं। RBM, पुनर्गठन तहखाने झिल्ली; जी एल ए, glycolaldehyde; जी, ग्लाइसिन एथिल एस्टर; पर, रात भर; पीबीएस, फॉस्फेट खारा बफर; आर टी, कमरे के तापमान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I - Material for monolayer culture
BPH-1 CaP Cell Line Database PCaCL-132 Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media  ThermoFisher Scientific 17005-075 Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum  First Link UK Ltd 02-00-850 Store at -20 ºC in aliquots
PC3  American Type Culture Collection CRL-1435
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets Oxoid BR0014G
RPMI 1640 medium  Sigma-Aldrich R5886 warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1  American Type Culture Collection CRL-11609
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
Name Company Catalog Number Comments
II - Material for 3D culture
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Aminoguanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 396494 Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well  Thermo Scientific Nunc Lab-Tek TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract  AMS Biotechnology 3445-005-01 Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide  Sigma-Aldrich C91492 Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid Sigma-Aldrich 695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) Sigma-Aldrich 50060 Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA) Sigma-Aldrich G6805
Sodium cyanoborohydride  Sigma-Aldrich 71435 Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns Appleton Woods BC680
Name Company Catalog Number Comments
III - Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThemoFisher Scientific D3571 light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders Sigma-Aldrich C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11001 light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11034 light sensitive
Goat serum Abcam ab7481 Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media  Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb TransGenic Inc KH012
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich F8775 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody   Acris Antibodies R1041 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb Santa Cruz Biotechnology Inc sc-7292 Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) Sigma-Aldrich T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) Sigma-Aldrich P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer ThemoFisher Scientific 66333
Name Company Catalog Number Comments
IV - Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X magnification) microscope Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast  Olympus 
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer BMG Labtech
Name Company Catalog Number Comments
V - Software
Image J 1.47v National Institute of Health, USA
MetaXpress Molecular Divices

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References

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  2. Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132, (2), 278-291 (1988).
  3. Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7, (1), 64-71 (2013).
  4. Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29, (5), 402-410 (2010).
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