Внедрение системы Связной Антистоксова комбинационное рассеяние (CARS) на Ti: Sapphire и ОРО лазер на основе стандартного лазерного сканирующего микроскопа

Общая цель этой процедуры заключается в реализации дополнительной микроскопической техники под названием CARS, которая позволяет получать химически селективную визуализацию без меток на стандартном многофотонном лазерном сканирующем микроскопе, основанном на фемтосекундном титан-сапфировом лазере и оптическом генераторе параметров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии или нейронауки, такие как понимание заболеваний, связанных с липидами, механизмов проникновения в кожу или кожных заболеваний. Основное преимущество данной методики заключается в том, что ее легко реализовать на стандартной лазерной сканирующей микроскопии на основе Ti:Sapphire и OPO лазеров.

Демонстрировать процедуру будут Хасан Бухаддауи, научный сотрудник и руководитель платформы визуализации лаборатории, и Василий Мицканюк. Включите титано-сапфировый и ОПО-лазеры, как представлено в текстовом протоколе. Включите компьютер с микроскопом.

Включите компонентные переключатели микроскопа. Запустите программу, дважды кликнув по иконке на рабочем столе, и настройте ее в соответствии с текстовым протоколом. Затем поместите дихроичное зеркало с длиной волны среза на 760 нанометров в ползунок бокового порта.

Расположите его в бесконечном пространстве над носовой частью объектива. Установите узкополосный фильтр и отражательный куб перед PMT1 так, чтобы они записывали только сигнал CARS на расстоянии 670 нанометров для воспроизведения представленных результатов. Затем поместите специальные узкополосные фильтры перед PMT3 для флуоресцентного наблюдения миелина и перед PMT4 для наблюдения ГВГ.

В программном обеспечении задайте сигнал на детекторе с помощью специального полосового фильтра. Откройте инструмент «Путь света» в меню диспетчера настроек на вкладке «Сбор», затем активируйте нужный ФЭУ и выберите цвет для канала. Например, используйте зеленый для CARS, а пурпурный для SHG.

Два луча, исходящие от одного и того же титанового сапфирового лазера, не синхронизированы, когда они достигают микроскопа, потому что луч OPO задерживается при его генерации. Следуйте этой процедуре для их повторной синхронизации, регулируя длину одной из лазерных площадок с помощью линии задержки. Требуется использование светосильного фотодиода и светосильного осциллографа.

Во-первых, с помощью кабелей BNC подключите входной канал CH1 осциллографа к электрическому выходу лазера BNC для синхронизации. Далее подключаем входной канал CH2 к фотодиоду. Затем выберите канал CH1 в качестве триггера, нажав триггерное меню, затем кнопку главного меню источника, а затем кнопку бокового меню, которая соответствует каналу, выбранному как CH1.

Теперь расположите и закрепите оптическими монтажными штифтами фотодиод в фокальной плоскости объектива 10-кратного воздушного микроскопа. В инструменте Channels (Каналы) определите длину волны титан-сапфирового лазера на 830 нанометрах при низкой мощности, что составляет менее 1% от полной мощности. В инструменте Acquisition Mode (Режим съемки) уменьшите область сканирования до одной точки, чтобы осветить фотодиод самым маленьким лучом.

Затем включите лазерное сканирование, нажав на кнопку непрерывного сканирования. Нажмите кнопку «Автонастройка» на осциллографе и вручную переместите фотодиод, чтобы получить последовательность импульсов на экране осциллографа. Нажмите кнопку «Выполнить/Стоп», чтобы заморозить дисплей.

Затем выключите титано-сапфировый лазер. В программном обеспечении нажмите инструмент «Каналы», снимите флажок с лазером 830 нм и установите сигнал OPO на 1107 нм и низкое энергопотребление. Затем включите лазерное сканирование ОПГ, запишите последовательности импульсов лазера ОПГ на осциллографе и выключите сканирование лазера ОПГ.

Теперь сравните временной сдвиг между титан-сапфировым и OPO-сигналами. Рассчитайте длину линии задержки, которая будет использоваться для позиционирования зеркал. Прежде чем продолжить, наденьте защитные очки и снимите с запястий все цепочки, браслеты или часы.

Теперь откройте лазерную линию титан-сапфир, где будет реализована линия задержки путем снятия защитных трубок. Затем выберите длину волны в видимом диапазоне для того, чтобы иметь возможность легко наблюдать за лазерным лучом, например, 700 нанометров при малой мощности, и включите лазерное сканирование. Теперь вставьте две ирисовые диафрагмы в открытую лазерную линию с помощью оптических монтажных стоек.

Расположите одну радужную оболочку на выходе из линии задержки, а другую — у входа в перископ. Затем уменьшите апертуру ирисовой диафрагмы и отрегулируйте положение диафрагмы в соответствии с траекторией лазерного луча, а затем закрепите их на оптическом столе. Наконец, отрегулируйте вертикальное положение третьей подвижной ирисовой диафрагмы.

Диафрагмы такого размера будут служить в качестве регулятора для процедуры переюстировки для проверки положения лазерного луча при последовательном позиционировании четырех зеркал линии задержки. Теперь поместите зеркало M1 на компактное кинематическое крепление зеркала у входа в линию задержки и отрегулируйте его положение и ориентацию для поддержания высоты луча с помощью подвижной ирисовой диафрагмы. Затем поместите зеркала M2 и M3 под углом 90 градусов на столик для трансляции в соответствии с рассчитанной длиной линии задержки и отрегулируйте их ориентацию с помощью подвижной ирисовой диафрагмы.

Установите M4 на выходе из линии задержки непосредственно перед диафрагмой и тщательно отрегулируйте ее положение и угол, чтобы она соответствовала траектории лазерного луча через две неподвижные диафрагмы ирисы. Теперь поместите карту просмотра лазера на выходе объектива микроскопа и проверьте профиль лазерного луча. При необходимости немного отрегулируйте ориентацию М4, чтобы наблюдать равномерный яркий диск.

Наконец, переместите быстрый фотодиод под лазерный луч в плоскости фокусировки образца. Затем наблюдайте временной сдвиг между титан-сапфировым лазерным лучом и пучком ОПОГ на осциллографе. При необходимости измените длину линии задержки, переместив весь этап трансляции для синхронизации импульсов.

Пространственное перекрытие двух лучей, необходимых для сигнала CARS, получается путем визуализации флуоресцентных полистирольных шариков, закрепленных на предметном стекле микроскопа. Сфокусируйтесь на бусинах с помощью 20-кратного объектива для воды. Теперь в инструменте «Каналы» на вкладке «Приобретение» добавьте первый трек или используйте существующий трек.

Выберите длину волны на 830 нанометров и низкую мощность для титан-сапфирового лазерного луча. Переключите цвет на зеленый в одном поле дорожки в окне Каналы и в блоке PMT3 или PMT4 в окне светового пути. Затем добавьте вторую дорожку для лазерного луча OPO и установите длину волны на 1107 нанометров и низкую мощность.

Переключите цвет на красный в поле «Дорожка два» в окне «Каналы» и в поле PMT3 или PMT4 в окне «Путь света». Теперь выберите максимальную область сканирования и отрегулируйте усиление обеих дорожек на 600. Затем последовательно нанесите скан двух лучей на образец, кликнув по непрерывному.

Наблюдайте за изображением в области экрана в 2D-виде. Увеличьте мощность обоих лазеров. При необходимости слегка сдвиньте привод фокусировки, чтобы найти плоскость фокусировки бусин.

Наконец, отрегулируйте обрезку и увеличьте изображение на одной бусине или на группе соседних бусин. Далее с помощью перископического контроллера перекрываем лучи в плоскости XY. В программном обеспечении откройте вкладку «Обслуживание».

Нажмите на параметры системы и отобразите окно инструментов моторизованного перископа. Более подробная информация обсуждается в текстовом протоколе. После наложения изображений с обоих лазерных лучей достигается синхронизация.

Чтобы добиться точной временной регулировки для активации CARS, подготовьте предметное стекло с каплей оливкового масла и накройте его крышкой. Затем с помощью объектива с 20-кратным погружением в воду сфокусируйтесь на краю защитного стекла. Теперь, на первом треке, установите длину волны на 830 нанометров для титан-сапфирового лазерного луча и на 1107 нанометров для ОПГ.

Переключите оба лазера на первую дорожку, чтобы получить одновременное сканирование. Начните с обоих лазеров на низкой мощности. Затем в окне пути света снимите флажок PMT4 и выберите PMT1.

Затем выберите максимальную область сканирования и включите лазерное сканирование, нажав на кнопку непрерывного сканирования. Отрегулируйте коэффициент усиления на 600 и, при необходимости, увеличьте мощность на оба лазера. Далее отрегулируйте интенсивность отображения в блоке управления опцией отображения дисплея.

Затем медленно перемещайте этап трансляции линии задержки до тех пор, пока сигнал не станет значительно усиленным. Затем уменьшите мощность обоих лазеров. Теперь проверьте, является ли сигнал сигналом CARS, поочередно выключив один из двух лазеров.

Если интенсивность сигнала становится слабее или исчезает, получен сигнал CARS. Поскольку конечная система предназначена для людей, не являющихся физиками, закройте световой путь линии задержки корпусом и трубками, чтобы избежать прямого доступа к вредному, невидимому лазерному лучу с высокой пиковой мощностью. Тем не менее, предоставьте доступ к ручке этапа перевода.

Для наблюдения за миелиновой оболочкой использовали флуро-миелиновый красный краситель, обладающий селективностью по отношению к миелину. Одновременное освещение на 830 и 1095 нанометрах обеспечивает сигнал CARS. Круги соответствуют миелиновой оболочке вокруг аксонов в поперечном разрезе.

Та же структура обнаруживается при наложении CARS и флуоресцентных изображений. Уровень детализации CARS и флуоресцентной маркировки очень похож. Потенциально устраняя необходимость использования красителя.

Система также может одновременно генерировать второй гармонический сигнал от коллагеновых волокон, находящихся на внешней стороне седалищных нервов. Для записи сигнала на 550 нм используется другой детектор, так как для записи сигнала CARS используется узкополосный фильтр на 670 нм. Волокна проиллюстрированы ложно-пурпурным цветом.

Один только сигнал CARS ясно показывает миелиновые оболочки. При одновременной визуализации обоих сигналов миелиновые оболочки зеленого цвета видны в окружении коллагеновых волокон пурпурного цвета. Сигнал CARS требует меньше энергии, чем сигналы SHG или THG.

Сигналы CARS достигались с помощью четырех милливатт на 830 нанометрах и 13 милливатт на 1095 нанометрах, в то время как для получения сигнала SHG требовалось 50 милливатт на 1095 нанометрах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как шаг за шагом модифицировать одну из траекторий лазерного луча для временной синхронизации обоих лазерных лучей. Реализация линии задержки может быть достигнута за несколько недель биологами, имеющими базовую подготовку в области экспериментальной оптики, или в сотрудничестве с физиками.

Не забывайте, что работа с мощными, невидимыми лазерными лучами может быть чрезвычайно опасной. Кроме того, следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков во время выполнения процедуры и окончательное ограждение траектории лазерного луча.