Kontinuerlig-bølge-thuliumlaser for oppvarming av dyrkede celler for å undersøke cellulære termiske effekter

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Et originalt eksperimentelt oppsett for oppvarming av celler i en kulturrett med bruk av 1,94 μm kontinuerlig-bølgende laserstråling er introdusert her. Ved hjelp av denne metoden kan de biologiske responsene av retinale pigmentepiteliale (RPE) celler etter ulike termiske eksponeringer undersøkes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Miura, Y., Pruessner, J., Mertineit, C. L., Kern, K., Muenter, M., Moltmann, M., Danicke, V., Brinkmann, R. Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects. J. Vis. Exp. (124), e54326, doi:10.3791/54326 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En opprinnelig metode for oppvarming av dyrkede celler ved bruk av en 1,94 μm kontinuerlig-bølge-thuliumlaser for biologisk vurdering er introdusert her. Thulium laserstråling absorberes sterkt av vann, og cellene på bunnen av kulturretten oppvarmes gjennom termisk diffusjon. En laserfiber med en diameter på 365 um er satt ca. 12 cm over dyrkningsskålen, uten noen optikk, slik at laserstrålediameteren er nesten ekvivalent med den indre diameteren av dyrkningsretten (30 mm). Ved å holde en konsekvent mengde kulturmedium i hvert eksperiment, er det mulig å bestråle cellene med en høyt reproducerbar temperaturøkning.

For å kalibrere temperaturøkningen og dens fordeling i en cellekulturskål for hver effektinnstilling, ble temperaturen målt i løpet av 10 s med bestråling i forskjellige stillinger og på mobilnivå. Temperaturfordelingen ble representert ved hjelp av en matematisk grafikkprogramvareProgrammet, og mønsteret på tvers av kulturretten var i gaussisk form. Etter laserbestråling kan forskjellige biologiske eksperimenter utføres for å vurdere temperaturavhengige celleresponser. I dette manuskriptet presenteres levedyktighetsfarging ( dvs. å skille mellom levende, apoptotiske og døde celler) for å bestemme terskeltemperaturene for celleapoptose og død etter forskjellige tidspunkter.

Fordelene ved denne metoden er presisjonen av temperaturen og tidspunktet for oppvarming, samt dens høye effektivitet i oppvarmingsceller i en hel cellekulturskål. Videre tillater det å studere med et stort utvalg av temperaturer og tidsvarigheter, som kan styres godt av et datastyrt operativsystem.

Introduction

Forståelse av temperaturavhengige cellebiologiske responser er av stor betydning for vellykkede hypertermi-behandlinger. Retinal laser fotokoagulasjon med en termisk laser, brukt i oftalmologi, er en av de mest etablerte laserbehandlinger i medisin. Synlig lys, hovedsakelig fra grønn til gul bølgelengder, brukes i retinal laserbehandling. Lyset absorberes sterkt av melaninet i retinale pigmentepiteliale (RPE) celler, som danner det ytre cellemonolaget av netthinnen. Det har vært ny interesse blant leger og forskere ved svært mild termisk bestråling (sub-synlig fotokoagulering) som en ny terapeutisk strategi for ulike typer retinal lidelser 1 , 2 . Etter denne trenden, er vår interesse i RPE-celler med lette oppvarming under presis temperaturkontroll, en teknikk som kalles temperaturstyrt fototermisk terapi (TC-PTT).

Nylig optoAkustisk teknologi fra vårt institutt har gitt mulighet for sanntidsmåling av temperaturøkninger på bestrålede steder i netthinnen. Dette muliggjør kontroll over temperaturøkningen under bestråling 3 . Siden sublethal hyperthermia på retina, forårsaket av oppvarming av RPE-celler sublethalt, ikke er blitt vurdert tidligere på grunn av umuligheten av å måle og kontrollere temperaturen, har de temperaturavhengige celleresponsene av RPE-celler etter termisk laserbestråling Blitt studert svært lite til dags dato. Dessuten har ikke bare temperaturforskjellen blitt diskutert i detalj, men også differansen i celledriftene til de overlevende celler etter sublodal og dødelig bestråling. Derfor, for å samle vitenskapelig bevis på TC-PTT-baserte behandlinger, tar vi sikte på å belyse de temperaturavhengige RPE-cellens biologiske responser og deres mekanismer ved hjelp av in vitro eksperimentelle oppsett.

For tHans formål er det nødvendig å etablere en celleoppvarming oppsett som oppfyller følgende betingelser: 1) muligheten for rask temperatur øker, 2) en nøyaktig kontrollert tid og temperatur og 3) et relativt høyt antall undersøkte celler for biologiske eksperimenter . Når det gjelder oppvarmingsmetoden, er en klinisk laser, som en frekvensdoblet Nd.YAG-laser (532 nm), dessverre uegnet til oppsamling av cellekultur. Dette skyldes sterkt redusert antall melanosomer i dyrkede RPE-celler. Lasertallabsorpsjonen kan være inhomogen, og temperaturøkningen på cellulær nivå varierer mellom eksperimenter, selv når det bestråles med samme strålingskraft. Flere tidligere studier har rapportert bruken av svart papir under oppvaskbunnen under bestråling 4 eller bruk av ytterligere melanosomer som fagocytiseres av kulturcellene før forsøkene 5 , 6 . Mange avIn vitro biologiske studier for å vurdere hypertermi-induserte celleresponser har blitt utført ved bruk av en kokeplate, et vannbad eller en CO 2- inkubator med en temperaturinnstilling 7 . Disse metodene krever en lang varmetid fordi det tar litt tid ( dvs. flere minutter) for å nå ønsket temperatur. Videre er det vanskelig å oppnå en detaljert termisk historie ( dvs. temperatur multiplisert med tiden) på mobilnivå ved hjelp av disse metodene. Dessuten kan temperaturen mellom cellene ved forskjellige stillinger i en kulturrett skille fra variabel temperaturdiffusjon. I de fleste tilfeller er denne temperatur- og romtemperaturinformasjonen under hypertermi ikke tatt i betraktning for biologiske analyser, selv om biologisk cellerespons kan bli kritisk påvirket av temperaturen og tidsvarigheten av den økte temperaturen.

For å overvinne disse problemene, en fortsettelseNuous-wave thulium laser ble brukt her for å varme opp cellene. Thulium laserstråling (λ = 1,94 μm) absorberes sterkt av vann 8 , og cellene på bunnen av kultiveringsskålen blir termisk stimulert utelukkende gjennom termisk diffusjon. Laserfibre med en diameter på 365 μm er satt ca. 12 cm over dyrkningsskålen, uten optikk i mellom. Laserstrålediameteren divergerer slik at den nesten er ekvivalent med den indre diameteren av kulturretten (30 mm) på overflaten av dyrkningsmediet. Med en konsistent mengde dyrkningsmedium er det mulig å bestråle cellene med temperaturøkningen Av høy repeterbarhet. Variabel effektinnstilling muliggjør bestråling med opptil 20 W, og medietemperaturen på mobilnivå kan økes opp til ΔT ≈ 26 ° C på 10 s.

Ved å endre bestrålingsbetingelsene er det også mulig å endre laserstråleprofilen for å variere temperaturfordelingenPå i en kulturrett. For eksempel er det mulig å undersøke med en Gauss-lignende temperaturfordeling, som i den nåværende studien, eller med en homogen temperaturfordeling. Sistnevnte kan være fordelaktig for å undersøke virkningene av temperaturavhengige celleresponser mer spesifikt for sub-dødelig temperaturøkning, men ikke for celledødspenning eller sårhelingrespons.

Samlet sett kan thulium-laserbestråling muliggjøre undersøkelse av forskjellige typer biologiske faktorer, som gen / proteinuttrykk, celledødskinetikk, celleproliferasjon og utvikling av cellefunksjonalitet etter forskjellige termiske eksponeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RPE-cellekultur

  1. Isolering av RPE-celler fra svine øyne
    1. Hent ferske enucleated svin øyne fra det lokale slakteriet. Hold dem kule (4 ° C) og i et mørkt miljø.
    2. Fjern ekstracellulært vev med saks og suge øynene i en antiseptisk oppløsning i 5 minutter.
    3. Plasser øynene i sterilisert fosfatbuffert saltløsning uten kalsium og magnesium (PBS (-)) til bruk.
    4. Ved hjelp av en skalpell, tråkk sclera på ca 5 mm bakre til hornhinnen limbus. Reseks hele fremre delen av øyet ved å skjære med saks hele veien gjennom, parallelt med hornhinnen limbus.
    5. Fjern den fremre delen av øyet ( dvs. hornhinnen og objektivet) og glassplaten. Tilsett 1 ml PBS (-) og fjern forsiktig nevralhinnen.
      MERK: Denne øyekoppen, som består av sclera, choroid og RPE, er nå klar.
    6. Tilsett forvarmet (37 ° C) 0,25% trypsin i PBS (-) til øyekoppen. Juster volumet slik at ca 80% av øyekoppen er fylt med denne trypsinoppløsningen.
    7. Inkubér øyekoppen med trypsinoppløsningen i en 5% CO2-inkubator ved 37 ° C i 10 minutter.
    8. Fjern øyekoppen fra inkubatoren og erstatt 0,25% trypsinoppløsningen med en PBS (-) løsning med 0,05% trypsin + 0,2% etylendiamintetraeddiksyratetranatriumsalt (EDTA · 4N). Inkubér øyekoppen i inkubatoren i 45 minutter.
      MERK: Etter 45 minutter vil RPE-cellene enten være løst festet til Bruchs membran eller allerede løsrevet og flytende i trypsin-EDTA-løsningen.
    9. Samle RPE-cellene ved forsiktig pipettering. Samle celler og oppløsning i et konisk rør fylt med 10 ml dyrkningsmedium (DMEM høy glukose med L-glutamin), inkludert 10% svin serum, antibiotikum / antimykotisk og natriumpyruvat (1 mM).
      MERK: Serumet kan nøytralisere effekten av trypsin.
    10. SentrifugerCelle suspensjon ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    11. Fjern supernatanten og tilsett 10 ml frisk medium. Sentrifuger igjen under de samme forholdene i 5 minutter.
    12. Fjern supernatanten og legg til nytt medium, slik at cellekonsentrasjonen resulterer i 5 x 10 5 celler / mL (bestemt ved å telle cellene ved hjelp av et hemocytometer). Bland godt med mild pipettering.
    13. Fordel cellesuspensjonen i cellekulturretter. Bruk 3 ml per 60 mm diameter dyrkingsskål.
      MERK: Denne kulturen kalles passasje null (P0).
    14. Opprettholde cellene i en 5% CO 2- inkubator ved 37 ° C. Bytt halvparten av det kondisjonerte mediet til frisk medium hver annen dag.
    15. Subkultur (trinn 1.2) hvis det blir sammenflytende.
  2. Subkultur av RPE-cellekulturen
    1. Fjern kulturmediet og skyll cellene to ganger med PBS (-).
    2. Inkubér cellene med PBS (-) løsning med 0,05% trypsin + 0,2% EDTA iNa 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C i 5 minutter.
    3. Løsne RPE-cellene ved forsiktig pipettering og oppsam cellesuspensjonen i et konisk rør fylt med 10 ml dyrkningsmedium, inkludert 10% svineserum.
    4. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Fjern supernatanten og legg til nytt kulturmedium, noe som gjør cellekonsentrasjonen 5 x 10 5 celler / mL (bestemt ved å telle celle nummeret med et hemocytometer). Fordel cellene i nye kultivarer av 60 mm diameter, som beskrevet i trinn 1.1.13.
      MERK: Cellekulturen er nå passasje 1 (P1).
    6. Etter at konfluens er nådd, subkulturer Pl-kulturen til P2, ved bruk av samme fremgangsmåte beskrevet i trinnene 1.2.1-1.2.5. Fra P2-kulturen, frøene cellene på mindre kulturretter (30 mm indre diameter) i stedet for 60 mm diameter kulturretter.
    7. For forsøkene, bruk P2 eller P3 kulturer.

2. ThulIum laserbestråling

  1. Bygging av bestrålingsstasjonen
    1. Koble en thuliumlaserenhet (1,94 μm, effektområde: 0-20 W) til en 0,22-NA, 365 μm kjerne diameter fiber.
    2. Mekanisk fikser fibertappen til metallarmen som er horisontalt festet til det vertikale metallposten til bestrålingsstasjonen. Plasser det vertikale innlegget slik at spissen av laserfibrene er plassert over varmeplaten som cellekulturretten skal plasseres under bestråling.
    3. Legg et hvitt papir på kokeplaten og drei den sikte strålen på (λ = 635 nm, maks = 1 mW, diameter på papirnivå ≈ 30 mm). Marker omkretsen til siktebjelken på hvitboken, slik at posisjonen der kulturretten skal plasseres under bestråling, er kjent.
      MERK: Fiberspissenes z-plan kan være foranderlig. Uten ytterligere bildeoptikk, plasseres laserpunktdiameteren på cellekulturplanet, 12 cm under fibertappen, iS ca. 30 mm, som nesten er ekvivalent med den indre diameteren av cellekulturretten. En skjematisk tegning av oppsettet er vist i figur 1 .

Figur 1
Figur 1: Skjematisk bilde av Thulium laserbestrålingsstasjonen. En kulturrett er plassert på varmeplaten. Cellene er plassert 12 cm under thuliumlaserfiberspissen, slik at strålestørrelsen er nesten identisk med kulturdiameterens indre diameter (ca. 30 mm). Laserbestrålingsprosedyren styres av en tidsstyrt rutine av den skreddersydde systemdesignplattformen. Strøminnstillingen må bestemmes før bestrålingsprogrammet startes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Laserbestråling av cellekulturen
  1. 1 time før bestråling, erstatt kulturmediet fullstendig med 1,2 ml friskt medium.
    MERK: Dette er et KRITISK STEG, og må følges nøye.
  2. Plasser bestrålingsstasjonen ( dvs. varmeplaten og stolpen som skal feste laserfibre) på en ren benk.
  3. Fjern cellekulturretten fra inkubatoren og plasser den på merket posisjon på varmeplaten (trinn 2.1.3).
  4. Bruk vernebriller. Slå på thuliumlaseren. Still inn effekten som ønsket på laserenheten (innstillbar fra 0 - 20 W). Slå på utslippet.
  5. Start en systemdesignplattform som styrer laserbestråling og timingprotokoll (tilleggsfil).
  6. Umiddelbart etter at kultiveringsretten er satt på kokeplaten, klikk på "forvarmingstid" for å starte timeren i 140 s ("forvarmingstid 1"); Dette vil holde kulturmedietemperaturen på 37 ° C før bestråling.
    MERK: Etter 140 s, vil det lyde en pipelyd, og neste timer ("forvarmingstid 2") starter automatisk med å telle 8 s. I løpet av denne 8 s kan eksaminatoren åpne kulturretten. Etter 148 s av forvarming vil en 10 s-lang laserbestråling på cellekulturen bli utført automatisk. I tilfelle nødstilfeller, må du utstyre laserenheten med en kraftuttak for å stoppe laseren umiddelbart. Dette er et KRITISK TRIN og må følges nøye. Et spesielt forsiktighetsspørsmål gjelder åpning av dekselet på parabolen rett før bestråling, ved begynnelsen av 8 s forvarmingstid. Å åpne dekselet kan kjøle ned middels overflate veldig raskt.
  7. Etter bestråling, legg straks dekselet tilbake på kultiveringsretten, la kultiveringsretten stå på kokeplaten i ytterligere 7 s, og legg den tilbake i 5% CO 2- inkubatoren ved 37 ° C.
  • Måling av temperaturfordelingen vedMobilnivå (temperaturkalibrering)
    1. Lag små hull (ca. 300 μm i diameter) nær bunnen på fire sider (hver 90 °) av en 30 mm diameter kulturrett (uten celler); Bruk spissen av en nål (20G) oppvarmet med en Bunsen-brenner. Forsegl hullene med elektrisk isolasjonstape fra utsiden og lag et lite hull med en fin nål slik at bare et fint termoelement (200 μm i diameter) kan settes inn gjennom dette hullet under vanntette forhold.
    2. På utsiden av kultursnålbunnen trekker du 2 vinkelrette diametre og stiller krysspunktet ( dvs. midt på bunnen) som koordinat null (0). Merk hver 3 mm radialt til utsiden ut av parabolen ( dvs. 0, 3, 6, 9, 12 og 15 mm) i hver retning langs linjene ( figur 2 , blå prikker); Antall poeng skal være 21 totalt.
    3. Fyll cellekulturskålen med 1,2 ml nytt dyrkningsmedium. Plasser kulturen dIsh på en varmeplade ved 37 ° C, sett et fint termoelement (200 μm i diameter) inn i sidhullet, og legg det følsomme spissen på en merket posisjon som skal måles.
    4. Bruk vernebriller. Slå på thuliumlaseren og sett inn strømmen manuelt (mellom 0 og 20 W, i 0,1-W trinn) av laserutformingen.
      MERK: For temperaturkalibrering skal målinger med effekt i trinn på 3 W være tilstrekkelig.
    5. Slå på systemdesignplattformen og klikk på "Start Temp Acquisition" -knappen (tilleggsfil) for å starte temperaturmåling.
    6. Gjør samme prosedyre som i trinn 2.2.6.
      MERK: Kontrollprogrammet måler temperaturen på det innsatte termoelementet hver 100 ms og viser temperaturprogresjonen under bestråling i GUI.
    7. Gjør disse prosedyrene for alle 21 målepunkter og ved forskjellige strøminnstillinger. Gjenta hele prosedyren tre ganger for alle punkter og for all strøminnstillingGs for å oppnå pålitelige data.
    8. Eksporter temperaturdata som csv-data, som til slutt kan konverteres til et regneark. Gjennomsnittlig maksimal temperatur på slutten av bestråling for tredobbelte målinger ved hvert punkt. Gjennomsnitt verdiene fra punktene i samme sirkel (4 poeng i alt, unntatt det sentrale punktet).
    9. Plot den oppnådde gjennomsnittlige maksimale temperaturen på en graf, slik at avstanden fra midten av fatet (mm) som x-aksen og temperaturen øker (ΔT, ° C) som y-aksen. Bruk passformfunksjonen til et matematisk program for å passe en gaussisk modell til de rå dataene. Lag en Gaussisk passformtemperaturfordeling.
  • Figur 2
    Figur 2: Poengene for temperaturkalibrering i en cellekulturrett. Temperaturdataene ble målt i midten og ved 5Radiale punkter over 4 forskjellige vinkler (blå prikker). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    3. Biologiske vurderinger for cellespørsmål etter ulike termiske bestrålinger

    1. Vurdering av cellens levedyktighet ( dvs. levende, apoptotisk og død) etter ulike kraftinnstillinger og bestemmelse av celledødsgrensen
      1. På de angitte tidspunktene ( dvs. 3, 24 og 48 timer etter bestråling), vask cellene med PBS (-) og bruk et kommersielt tilgjengelig sett for å vurdere cellelevbarhet ( dvs. vital, apoptotisk, død) i henhold til produsentens protokoll.
      2. Klargjør en fargeløsning ved å tilsette 5 μl fluoresceinisotiocyanat (FITC) -annexin V, 5 μl etidium homodimer III og 5 μL Hoechst 33342 til 100 μl 1x bindingsbuffer (alt er kitkomponenter). Forbered nok fargeløsning for å dekke cellene. Inkubér cellene i 15 minutter.
      3. Vask cellekulturen med bindingsbufferen to ganger, erstatt bindingsbufferen med PBS (-), og sett kulturen på scenen av et fluorescensmikroskop.
      4. Bytt lysbanen til det okulære objektivet, velg filteret 4 ', 6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI), slå på belysningslyset og finn det fokuserte planet med 4x-målet.
      5. Bytt lysbanen til kameraet, finn bildet på dataskjermen i mikroskopbildingsprogramvaren, og juster fokuset.
      6. Bruk stingfunksjonen ( dvs. funksjonen til å ta opp flere bilder over parabolen og deretter lage et enkelt, stort bilde) av mikroskopspesifikk programvare for å oppnå fluorescensbildet av hele cellekulturretten. Bruk 3 forskjellige filter sett-DAPI, FITC og tetrametylrhodamin (TRITC) til bilde Hoechst 33342-positive celler (alle cellekjerner), FITC-annexin V-positiVe-celler (apoptotiske) og henholdsvis ethidium homodimer III-positive celler (død).
      7. Mål radiusen (mm) for den døde (etidium homodimer III-positiv) regionen og den ytre / indre radius av det apoptotiske (annexin V-positive) båndformsområdet i de farget cellekulturer. Påfør disse radiene til den monterte Gauss-funksjonen av temperaturfordelingen for den tilsvarende effektinnstillingen. Beregn nøyaktig temperaturen på felgen til den døde eller apoptotiske regionen for å klargjøre terskeltemperaturene for celledød og apoptotisk forandring.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Temperaturfordeling etter ulike strøminnstillinger

    Alle temperaturutviklinger for hver enkelt bestråling ble overvåket ved temperaturkalibrering. Fra disse dataene ble den maksimale temperaturen ved det målte punkt oppnådd og definert som T max (° C). Som vist i figur 3A , ble programmet utført på tidspunktet da kulturretten ble plassert på varmeplaten. Etter 140 s "forvarmingstid 1", som var nødvendig for å arkivere en stabil mediumtemperatur ved 37 ° C, ble kappen på kulturretten fjernet i løpet av 8 s "forvarmingstid 2." På slutten av "forvarmingstid 2" startet laserutslipp automatisk. Denne kurven er en representativ temperaturprogresjon for en 10 s bestråling. Under bestråling økte temperaturen, og umiddelbart etter laserutslippet varSlått av, temperaturen begynte å synke. Den maksimale temperaturen i sentrum av kulturretten ble definert i denne studien som T max (° C). T max var proporsjonal med laserkraften ( figur 3B ). Figur 3C viser fordelingen av maksimal temperatur for hver kraft over kulturretten. Fordelingen er klokkeformet, som vist i figur 3C , og passer til en Gauss-funksjon i henhold til følgende formel:

    T (r) = t base + A · ligningen

    Hvor r, t base , A og w står for avstanden fra sentrum (mm), den laveste temperaturen for kurven, amplituden og bredden på kurven, henholdsvis. Parametrene (t base , A og w) av den monterte GAussisk kurve for hver strøminnstilling, nemlig for hver T max , vises i tabellen ved siden av grafen.

    Figur 3
    Figur 3: Temperaturkalibreringsdata. En representativ temperaturutvikling ved den sentrale posisjon etter en enkelt bestråling ved 4,9 W (T max = 43 ° C) ( A ), Proportionalforholdet mellom laserkraften og den maksimale ΔT ved den sentrale posisjonen til en cellekultur ( B ) Og temperaturfordeling over kulturretten etter ulike strøminnstillinger (C). (A) Programmet utføres fra tidspunktet hvor kulturretten er plassert på varmeplaten. Etter 140 s av "forvarmingstid 1", som er nødvendig for å arkivere en stabil mediumtemperatur ved 37 ° C, fjernes dekselet til kulturretten for 8-s "forvarmingstid2. "På slutten av" forvarmingstid 2, "starter laserutslippet automatisk. Denne kurven er en representativ temperaturprogresjon i sentral posisjon under en 10-sekunders bestråling på 4,9 W. Under bestråling øker temperaturen og Straks etter at laseremisjonen er slått av, begynner temperaturen å senke. Den maksimale temperaturen oppnås ved bestrålingens slutt, som er definert i denne studien som T max (° C). (B) Laserkraften og den maksimale Temperaturøkning (ΔT max ) er proporsjonal. (C) De gaussiske funksjonene til de målte temperaturfordelingene over kulturretten. Parametrene for funksjonene, bestemt med et matematisk program, vises i tabellen på siden av grafen . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Cellleabilitet etter termisk bestråling

    Som vist i figur 4A er det tre forskjellige fargemønstre som indikerer cellelevedannelse etter laserbestråling: 1) ingen annexin V / etidium homodimer III-positiv ( dvs. bare leve), 2) annexin V-positiv i midten ( dvs. nesten Bare tidlig apoptose), og 3) etidium homodimer III-positiv i midten ( dvs. døde celler) omgitt av apoptotiske celler ved grensen mellom døde og levende celler ( figur 4B ). Størrelsen på de døde / apoptotiske områdene er generelt avhengig av T max og etterbestrålingstid opptil 48 timer etter bestråling. Ingen tilsynelatende levedyktighetsendring ble oppdaget i kulturer bestrålt med T max ≤43 ° C. Den eneste apoptotiske endringen kunne observeres på et tidlig tidspunkt (3 timer), etterfulgt av en sen Celle død etter en bestråling med T max = 47 ° C. Umiddelbar eller tidlig celledød (opptil 3 timer) ble funnet i kulturer bestrålt med T max ≥ 51 ° C (tabell 1).

    Figur 4
    Figur 4: Fleksibilitetsmønster etter forskjellige kraftinnstillinger (A) og et eksemplarisk bilde ved de døde og apoptotiske områder etter dødelige laserbestråling (B).
    (A) Tre farger kan forekomme, avhengig av temperaturen. (B) Apoptotiske sonen (FITC-annexin V-positiv: grønn) rundt det døde området (ethidium homodimer III-positiv: rød). Alle celler er positive for Hoechst 33342 (blå), og cellene med blå kjerne er levende celler. Bildet ble tatt 24 timer etter en bestråling ved T max = 59 ° C. Bar = 100 μm./files/ftp_upload/54326/54326fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Tabell 1
    Tabell 1: Annexin V og Ethidium Homodimer III Respons på ulike temperaturer og tider.

    Bestemmelse av terskeltemperaturen for celledød

    Den gjennomsnittlige radius av det døde området (rødt) og det apoptotiske området (grønt) ble målt og anvendt på Gauss-funksjonen av temperaturfordelingen for å bestemme terskel-topptemperaturene for celledød og apoptose etter 10 s av bestråling. Ifølge denne analysen var de gjennomsnittlige terskeltemperaturene for fullstendig celledød 3 timer, 24 timer og 48 timer etter bestråling henholdsvis 54,0 ° C, 50,9 ° C og 50,1 ° C. Den gjennomsnittlige threshoLd-temperaturen for celleapoptotisk endring var lavere ved ca. 2 - 3 ° C, med terskel-temperaturene i henholdsvis 3 timer, 24 timer og 48 timer ved henholdsvis 51,7 ° C, 48,0 ° C og 47,0 ° C ( figur 5 ).

    Figur 5
    Figur 5: Terskeltemperaturer for apoptose og celledød.
    Gjennomsnittlig terskeltemperatur for fullstendig celledød (positiv for Hoechst 33342, annexin V og etidium homodimer III) og for apoptose (positiv kun for Hoechst 33342 og annexin V) ved forskjellige tidspunkter etter bestråling, beregnet ut fra resultatene av fluorescens-levedyktighetsfarging . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Ved å diskutere temperaturrelaterte biologiske cellulære responser, er ikke bare temperaturen, men også varigheten av den økte temperaturen av betydning, da de fleste biokjemiske prosesser er tidsavhengige. Spesielt innen laser-indusert hypertermi i oftalmologi, på grunn av det korte tidsområdet, fra millisekunder til sekunder, er det vanskelig å undersøke cellulære termiske effekter med presis temperaturkontroll. Derfor er det ønskelig med en laserbestrålingsoppsett som passer for cellekulturmodellen og med et operasjonssystem som muliggjør streng temperatur og tidskontroll. Den biologiske vurdering av cellerespons etter termisk eksponering, som proteinekspresjon eller sekresjon, krever gjentatte kvantitative evalueringer på et tilstrekkelig antall berørte celler. Dette har vært et hinder for studier ved hjelp av laserflater flere hundre mikrometer i diameter, som i kliniske behandlinger. Kvantitativ analyse ved en enkelt laserpunkt er ganske burdensome. I denne studien har man forsøkt å oppfylle disse kravene så mye som mulig. Ved å bruke en 1,94 μm bølgelengde kontinuerlig-bølge-thuliumlaser med et bestrålingsstyringsprogram, kunne en temporell temperaturstigning gjennomføres i en hel cellekultur innen en kort tidsramme. Siden temperaturfordelingen kan justeres ved å endre lysbanen, kan forskjellige typer hypertermi-relaterte eksperimenter utføres ved hjelp av dette oppsettet.

    Begrensningen av den presenterte teknikken er umuligheten av å gjennomføre samtidige temperaturmålinger under laserbestrålingen av cellene. Siden bruk av termoelementer ikke er egnet for steriliserte cellekulturer, må temperaturkalibrering utføres separat fra cellebestråling. Tatt i betraktning de mulige variasjonene i laserkraftutgangen, ville sanntids-temperaturmålinger under hver laserbestråling være ideell til direkte å vurdere cellesvar som svarer tilTermisk dose. Dessuten ble temperaturfordelingen som ble brukt her, opprettet ved datainterpolering basert på målingene ved 21 poeng på en kulturrett og ved flere forskjellige effektinnstillinger. Derfor, for å overvinne disse begrensningene og kritiske punkter, er det vårt mål å utvikle en alternativ metode som gjør det mulig å måle temperaturen på kulturretten mens laserbestråling utføres. Vi tar sikte på å få informasjon om romlig temperatur samtidig. Infrarød avbildning (termografi) er en mulig metode for å måle temperaturen under laserbestråling 10 . Den store fordelen med denne metoden er sanntids temperaturmåling på mobilnivå for hver bestråling; Etterfølgende cellebiologiske responser kan alltid være individuelt sammenlignet med temperaturhistorien under bestråling. Med tanke på kostnadseffektivitet og brukervennlighet er det imidlertid ikke mulig å bruke termografi for celleoppvarmingseksperimenter for hver laboratorieory.

    I metoden ved bruk av en thuliumlaser med en bølgelengde på 1,94 um, blir vannet i cellekulturretten oppvarmet på overflaten, og termisk diffusjon og konveksjon brukes til oppvarming av cellene. Høyden av dyrkningsmediet i denne bestrålingsoppsettet med 1,2 ml dyrkningsmedium er 935 um ved den sentrale posisjonen (fra en tidligere måling ved bruk av optisk koherensomografi). Nivået på absorpsjon av thuliumlaseren i vann er svært høy (absorpsjonskoeffisient: 127 cm -1 ved 35 ° C) og 72% av lyset absorberes i de første 100 μm av dyrkningsmediet. Det er nesten ingen absorpsjon (0,0007%) ved en dybde på 935 μm.

    Det er viktig å merke seg at en av de kritiske punktene i protokollen er å legge til samme mengde medium (1200 μL) for hver bestråling. Bruke forskjellige mengder kulturmedium kan føre til høydeforskjellene, noe som kan medføre forskjeller i temperaturen iNcrease av cellene. Det andre kritiske punktet vedrører tidspunktet for åpningen av kulturretten. Det må gjøres samtidig - i denne studien, 8 s før starten av bestrålingen, når systemet gir en lyd. Forskjeller i denne timingen kan variere grunntemperaturen på grunn av kjøling forårsaket av omgivende luft (ca. 23 ° C). Dette kan føre til signifikante forskjeller i den laserinducerte temperaturen.

    For temperaturkalibrering ble samme mengde medium (1,2 ml) som ble brukt i forsøkene benyttet for å måle temperaturfordelingen i bunnen av cellefrie dyrkingsretter. Mellomhøyden med et celle monolag kan imidlertid være forskjellig fra den uten celler, selv med samme mengde mediet tilsatt. Måling ved hjelp av optisk koherens tomografi viste at det er en 58 μm forskjell i den sentrale posisjonen mellom retter med og uten sammenflytende celle monolayer (877 μm uten celler, sammenlignet tO 935 μm med celler). Denne forskjellen er potensielt på grunn av kapillærvirkningen av cellene. 58-μm forskjellen i høyde i sentral posisjon kan skyldes ca. 40 μl medium (målt data). Det ble også bekreftet at denne forskjellen i høyde ikke forårsaket betydelige forskjeller i T max ved alle strøminnstillinger. Derfor har vi konkludert med at denne forskjellen ikke signifikant påvirker resultatene av analysene gjort i denne studien. Likevel, for å samle mer presis temperaturinformasjon, som beskrevet ovenfor, bør en metode for kalibrering av temperaturen ved hjelp av en cellekulturrett som inneholder et cellemonolag, utvikles. Videre er det også nødvendig med matematisk modellering av termisk diffusjon og konveksjon i hele kulturmediet.

    I denne studien ble cellene oppvarmet med en Gauss-temperaturfordeling. Det er flere mulige metoder for å varme hele mediet mer jevnt over tid. En Er å bruke en laser kilde med en lavere absorpsjonskoeffisient i vann. Imidlertid er ulempen at lasertene i dette tilfellet må ha høyere effekt, da bare en liten prosentandel av lyset absorberes over ca. 0,9 mm. En annen mulighet er å avbilde den distale fiberspissen av en multimode optisk fiber som overfører laserlyset inn i kulturrettens plan; Forstørrelsen kan velges vilkårlig av optikken.

    Det andre høydepunktet i denne protokollen er dets evne til å bestemme terskeltemperaturen for celledød og apoptose ved hjelp av det fluorescerende bildet av levedyktighetsfarging og lateral temperaturfordeling. Et langsiktig mål er ikke bare å bestemme cellelevbarhet, men også for å belyse temperaturområdet for cellebiologiske responser relatert til cellefunksjonalitet, slik som proteinuttrykk og celleproliferasjon. Bestemmelsen av celledødtærskeltemperaturen er av stor interesse for forskere"> 10. Ved hjelp av denne metoden kan det være mulig å bestemme de kritiske faktorene for celledød, inkludert apoptose. Kritiske faktorer for termisk laserinducert celledød kan bestemmes ikke bare gjennom temperaturhistorien, men også gjennom endogene faktorer ( Dvs. intra / ekstracellulære faktorer på molekylivå.) Besvare disse spørsmålene kan bane vei for å forstå celledødsmekanismer og kinetikk etter ulike termiske eksponeringer og i forskjellige retinale patologier. Videre kan det også bidra til å klargjøre klinisk observerte problemer, Slik som den inter-individuelle forskjellen som respons på laserbehandling eller variabiliteten i arrstørrelse etter retinalfotokoagulering, selv når den opprinnelige spotstørrelsen var nesten identisk ("atrofisk kryp") 11 .

    Det endelige målet med denne studien er å bidra til å utvikle temperaturstyrt fototermisk terapi av netthinnen. For å oppnå dette, i parallell wiDen tekniske utviklingen av temperaturmåling 3 , videre utredning av RPE-celleadferd etter termisk eksponering, bestemt ved bruk av denne metoden, vil være til stor nytte.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av et forskningsbidrag fra det tyske føderale departementet for utdanning og forskning (stipend nr. 13GW0043C) og og et europeisk kontor for luftfartsforskning og utvikling (EOARD, gi # FA9550-15-1-0443)

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796-500ML Add (2)-(4) before use. Warm in 37 °C water bath before use.
    Antibiotic Antimycotic Solution (100 ×) Sigma-Aldrich A5955-100ML Containing 10,000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1mL. Add 5.5 mL in 500 mL medium bottle (1) before use.
    Sodium pyruvate (100 mM) Sigma-Aldrich S8636-100ML Add 5.5 mL in 500 mL medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)
    Porcine serum Sigma-Aldrich 12736C-500ML Add 50 mL in 500 mL medium bottole (1) before use (final: 10%)
    Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
    Trypsin from porcine pancreas Sigma-Aldrich T4799-25G
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED-100G
    Human VEGF Quantikine ELISA Kit R&D System DVE00
    Oxiselect Total Glutathione Assay Kit Cell Biolabs, Inc STA-312
    Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit PromoKine PK-CA707-30018
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipments
    Thulium laser Starmedtec GmbH Prototype 0-20 W
    365 mm core diameter fiber LASER COMPONENTS Germany CF01493-52
    Thermocouple Omega Engineering Inc HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
    Heating plate MEDAX
    Microplate reader (spectrofluorometer) Molecular Device Spectramax M4
    cell homogenizer QIAGEN TissueLyser LT
    Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE Ti
    mathematical software program The Mathworks. Inc MATLAB Release 2015b
    system-design platform National Instrument Labview Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59, (1), 21-28 (2015).
    2. Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, (9), 1263-1272 (2010).
    3. Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17, (6), 061219 (2012).
    4. Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, (8), 1686-1691 (1995).
    5. Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (7), 3065-3073 (2006).
    6. Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11, (9), 8826-8835 (2011).
    7. Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46, (16-17), 1747-1750 (2013).
    8. Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14, (3), 258-268 (1994).
    9. Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
    10. Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16, (3), (2011).
    11. Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96, (1), 96-103 (1989).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

      Usage Statistics