EOB-DTPA와의 조지아 (III) 단지에 대한 조사 그것

Chemistry

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Summary

EOB-DTPA의 분리 및 후속 착화 천연의 Ga (III) 및 (68)의 Ga 명세서 제시뿐만 아니라 표지 효율 모든 화합물 및 조사의 철저한 분석 시험 관내 안정성 및 N- 옥탄 올 / 물하는 수순 방사성 표지 복합체의 분배비.

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Greiser, J., Niksch, T., Weigand, W., Freesmeyer, M. Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue. J. Vis. Exp. (114), e54334, doi:10.3791/54334 (2016).

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Abstract

우리는 EOB-DTPA (-3,6,9- 트리 아자 -3,6,9- 트리스 (카르복시 메틸) -4- (에 톡시) -undecanedioic 산)의 하나님 (III)에서 복잡한 프로토콜의 분리 방법을 보여 그 소설 비 방사성, 즉, 자연 조지아 (III)뿐만 아니라 방사성 68 조지아 복합체의 제조. 착물 리간드뿐만 아니라의 Ga (III)는 핵 자기 공명 (NMR) 분광법, 질량 분석 및 원소 분석을 특징으로 하였다. 68 조지아 68의 Ge / 68 조지아 발생기로부터 표준 용출 방법으로 얻었다. 실험은 3.8-4.0를 실시했다 pH에서 EOB-DTPA의 68 조지아 - 라벨의 효율성을 평가한다. 설립 분석 기술 무선 TLC (박층 크로마토 그래피) 및 라디오 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)는 탐침의 방사 화학적 순도를 결정 하였다. 68 조지아의 추적자 '친 유성 n 옥탄 올 / 물 소소의 첫 번째 조사로는 pH 7.4 용액에 존재하는 68 종의 Ga N 계수 추출 방법에 의해 측정 하였다. 실시 하였다 생리적 pH에서 각종 미디어의 추적자 시험 관내 안정성의 측정, 다른 분해 속도를 드러내는.

Introduction

Gadoxetic 산, EOB-DTPA 리간드 Gd의 (III) 착물에 대한 일반적인 이름 인해 간 간세포 높은 퍼센티지는 특정 흡수에 간담 자기 공명 영상 (MRI). 2,3-에서 자주 사용되는 조영제 인 간담 배설의이 초점 병변 및 간 종양의 위치 파악을 가능하게한다. 2-5 그러나 MRI 기술의 특정 제한 사항 (예를 들면, 조영제의 독성, 밀실 공포증 또는 금속 임플란트 환자에서 제한 적용) 다른 진단 도구를 요구 .

양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 본문에 그 분포는 PET 스캐너로 기록되는 때 방사성 물질 (추적)을 소량 투여하는 것을 특징 분자 이미징 법을한다. 6 PET 높은 허용 동적 방법 않고도 시공간 이미지 해상도뿐만 아니라 결과를 정량화MRI 조영제의 부작용 다룬다. 얻어진 메타 정보의 정보 값이 상기와 같은 가장 일반적으로 PET / CT 스캐너의 전산화 단층 촬영 (CT)과 하이브리드 이미징 달성 추가 촬상 수단으로부터 수신 된 데이터와 해부학 적 조합에 의해 증가 될 수있다.

PET 적합한 트레이서의 화학 구조는 양전자 방출로서 방사성 동위 원소를 포함한다. 양전자는 즉시 주변 조직의 원자 껍질의 전자를 몰살하기 때문에 짧은 수명을 가지고있다. 소멸함으로써 움직임 반대 방향으로 두 511 keV의 감마 광자는 PET 스캐너에 의해 기록되는, 방출된다. 7,8, PET 핵종은 분자에 공유 결합 될 수있는 탐침을 형성하는 2- 데 옥시의 경우처럼 2- [F 18] fluoroglucose (FDG)는 가장 널리 사용되는 PET 추적자. 7 그러나 핵종는 하나 이상의 리간드에 배위 결합을 형성 할 수있다 (예를 들면[68 조지아] -DOTATOC 9,10) 나)는 (용해 된 무기 염으로 예컨대, [F 18] (11), 불화 나트륨을 적용. 그것의 생체 내 분포, 대사 및 배설 동작을 결정으로서 전체적으로 트레이서의 구조가 중요하다.

적합한 애완 동물 핵종 편리 양전자 에너지 및 가용성뿐만 아니라 의도 된 조사에 적합한 반감기 같은 유리한 특성을 결합해야합니다. 68 조지아 핵종은 지난 20 년간 PET 분야에서 필수적인 힘이되었다. 12,13이 때문에 사이클로트론 부근으로부터 독립적 현장 라벨링 할 수있는 발전기 시스템으로의 가용성을 주로한다. 발전기에서 어머니 (68) 창은 딸 핵종 (68) 가인이 적당한 킬레이트로 용출하고 이후에 표시되는 열을 흡수 핵종. 6,14 68 조지아의 핵종은 trival로 존재하기 때문에gadoxetic 산 같은 전반적인 음전하와 복합체를 얻을 것 대신에 68 조지아와 EOB-DTPA를 킬레이트 단지 하나님 (III) 10, 13와 같은 엔트 양이온. 따라서, 그 68 조지아의 추적은 PET 영상에 대한 적합성과 유사한 특성 간 특이성을 결합 할 수 있습니다. gadoxetic 산 다음과 같은 맥락에서 구입하고, 나트륨 염으로 관리하고 있지만 우리는 하나님 [EOB-DTPA]과 같이 참조됩니다 조지아 [EOB-DTPA, 또는 68 조지아 [같은 비 방사성 조지아 (III) 복잡한 편의상 방사성 표지 된 성분의 경우 EOB-DTPA].

PET에 대한 추적자는, 방사성 금속 착물 먼저 생체 내 또는 생체 외 실험에서, 체외에서 광범위하게 조사 할 필요가 그들의 적용 가능성을 알아보고자 하였다. 각각의 의료 문제에 대한 적합성을 확인하려면, 생체 분포 행동과 통관 프로필, 안정성, 장기 특이 세포 또는 tissu 같은 다양한 추적 특성전자 흡수를 조사 할 필요가있다. 그들의 비 침습적 문자, 체외 결정은 종종 생체 실험 이전에 수행된다. 일반적으로 생체 내에서 투여시 DTPA 및 그 유도체가 비교적 빨리 분해의 결과로 운동 불활성 결여로 인해이 단지 68 조지아에 대한 킬레이트, 제한된 적합성의 것으로 인정된다. 14-20 이것은 주로 역할을 apo- 트랜스페린에 의해 발생 플라즈마에서 68 조지아에 대한 경쟁. 그럼에도 불구하고, 우리는 진단 정보함으로써 반드시 장기 추적 안정성을 필요로하지 않는, 분 이내에 포스트 분사 3,4,21-23를 제공 할 수있다 특징으로 간담 영상에서의 가능한 적용에 관한 새로운 추적을 조사 하였다. 이를 위해 우리는 gadoxetic 산에서 EOB-DTPA를 분리하고 처음 두 개의 안정 동위 원소, 69 Ga 및 (71)의 혼합물로서 존재하는 자연 조지아 (III)와 착물을 수행 68 조지아의 다음 킬레이트 비 방사성 표준을 역임 얻을. 우리는 방법을 확립 함과 동시에 EOB-DTPA의 68 Galabeling 효율을 결정하고 새로운 68 조지아 트레이서의 친 유성 및 다른 매체에서의 안정성을 조사하기 위해 자신의 적합성을 평가 사용했다.

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Protocol

EOB-DTPA와 조지아 1. 준비 [EOB-DTPA]

주의 : 사용하기 전에 사용되는 유기 용매, 산 및 알카라인의 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 흄 후드에서 모든 단계를 수행하고 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트)를 사용합니다.

  1. gadoxetic 산에서 EOB-DTPA의 분리
    1. 플라스크에 0.25 M gadoxetic 산 주사 용액 3 ㎖를 넣습니다. 교반 된 용액에 옥살산 500 밀리그램 (5.6 밀리몰)를 추가합니다.
    2. 1 시간 동안 교반 한 후, 감압을 사용하여 프릿을 통해 현탁액을 필터. 각각 물 3 ㎖로 잔류 물을 세 번 씻으십시오.
    3. 수성 여액을 결합하고 pH 전극과 솔루션을 장비. pH가 약 -0.1가 될 때까지 여액에 12 M 염산.
    4. 무색의 잔류 물을 수득하는 용매를 진공하에 제거한다. 불활성 기체에서 보관하십시오.
    5. 충분히 잔류 워시 (적어도 세에틸 아세테이트 시간) 옥살산의 과잉을 제거한다. 진공 잔류 물을 건조.
    6. 실온에서 물 2 ㎖에 재용 해 잔류하고 얼음 용기에 용액을 냉각. 빙욕을 제거하지 않고 형성 될 때까지 0.5 M 수산화 나트륨 수용액을 적가하여 무색 고체를 관찰 끈끈한.
    7. 경사에 의해 물을 제거합니다. 차가운 물 1 mL로 고체 두 번 더 씻는다. 제 생성물 분획을 수득 진공하에 고체를 건조.
    8. 칼럼 크로마토 그래피 (실리카, 메탄올 / 물 4/1)를 통해 경사 물의 결합 분획 제 생성물 분획을 분리. 24, 진공에서 용매를 제거한다.
    9. 얻어진 고체는 순수한 흰색이 아닌 경우, 물 1 ㎖에 재용 해하여 생성물을 침전 10 ml의 에탄올 및이어서 10 ㎖의 디 에틸 에테르를 추가한다. 감압하고, 진공에서 건조하여 프릿을 통해 필터.
    10. 콤바인고체 EOB-DTPA의 분수 및 NMR 분광, 25 질량 분석 (26)와 원소 (27) 분석을 수행 둘.
  2. 가인의 합성 EOB-DTPA]
    주의 : 건조한 불활성 분위기 하에서 스토어 고체 조지아 (III) 클로라이드, 이후 공기, 수분이나 기름 분해와 접촉시 부식성 가스 및 노란색, 갈색 또는 검은 색 불순물의 형성의 결과로 발생한다.
    1. 물 100 ㎖에서의 Ga (III) 클로라이드 1.94 g (11.0 밀리몰)을 용해하여 0.11 M 스톡 용액을 제조 하였다. 물 4 ml의 25 % 암모니아 수용액 1 mL로 희석.
    2. 물 10 ㎖의 플라스크에 EOB-DTPA 80 밀리그램 (0.15 밀리몰)을 녹인다. 필요한 경우, 완전한 용해를 달성하기 위해, 용매를 가열한다.
    3. 조지아 (III) 클로라이드 원액 1.4 ㎖ (0.15 밀리몰)를 추가합니다. 교반하여 pH 전극과 플라스크를 착용. 용액의 pH가 약 4.1이 될 때까지 묽은 암모니아수 용액을 적하하여 추가한다. RO에서 교반30 분 톰 온도.
    4. 진공에서 용매를 제거한다. 중앙 및 병렬 측 경부와 stillhead가 장착 된 플라스크의 잔류 물을 넣습니다. 진공 펌프 출구와 냉각 손가락 측면 목 중심 목에 착용
    5. 감압 (125 ° C, 0.6 밀리바)에서 잔류 물을 가열한다. 주기적 냉각 핑거 여전히 헤드로부터 (유리 표면의 백색 코팅과 같은 표시) 승화 염화 암모늄을 제거 할뿐만 아니라, 약간 젖은 천으로 플라스크의 상부 부분에서. 새로운 승 화성의 가시적 형성이 없을 때까지 프로세스를 계속한다.
    6. 각각 뜨거운 메탄올 0.5 ㎖로 잔류 물을 세 번 씻어 염화 암모늄의 마지막 흔적을 제거합니다. 진공에서 무색 잔류 물을 건조. NMR 분광, 25 질량 분석 (26)와 원소 (27) 분석을 수행합니다.

2. 일반 라벨 절차

주의 : 모든 전방사성 물질에 직접 또는 간접 접촉을 포함위한 실험은 숙련 된 기술자가 수행해야합니다. 적절한 차폐 장치를 사용하십시오. 개별적으로 방사성 폐기물을 수집하고 저장하고 유효한 규정에 따라 폐기 할 것.

  1. 발전기 용출
    참고 : 도데 실-3,4,5-trihydroxybenzoate 실리카 산화물 결합 된 어머니 핵종과 40 mCi의 68 창 / 68 조지아 발생하는 사용되었다. 이 절차의 경우이었던 것에 용출 및 정제는 연동 펌프 및 디스펜서 장치를 사용하여 결합 된 자동화 된 프로세스로, 수동으로 수행하거나 할 수있다.
    1. 5.5 M의 1.0 M 및 0.05 M 염산 용액을 준비합니다. mL의 5.5 M 염산 25 μl를 함유하는 5.0 M 염화나트륨의 용액을 제조 하였다. 4.1 g의 나트륨 아세테이트, 1 mL의 염산 (30 %) 및 ​​2.5 ml의 빙초산과 함께, 50 ml의 물을 혼합물을 희석하여 pH가 4.6의 완충 용액을 제조 하였다.
    2. PREC1 1.0 M 염산 mL 및 이후 5 ml의 물과 함께 천천히 세척하여 PS-H + 카트리지 ondition.
    3. 4 ml의 0.05 M HCl로 발전기의 실리카 컬럼을 용출. (12)로드 PS-H + 카트리지 상에 68 조지아의 용출액.
    4. 물 5ml와 카트리지를 세척하고이어서 공기 5 ㎖로 건조. 1 ㎖의 5.0 M로 산성화 식염수로 카트리지로부터 용리 68 조지아. 28
  2. 68 조지아와 EOB-DTPA의 라벨링
    1. 물 1 ㎖에 EOB-DTPA 1 밀리그램 (1.9 μmol)을 녹인다. 이 솔루션에서 100 μL (0.19 μmol)를 타고 19 μM (10 μg의 / ㎖) EOB-DTPA의 원액을 준비하기 위해 물 9.9 ml의로 희석.
    2. 68 조지아를 포함하는 용액 (22 ~ 29 MBq의 같게) 50 μl를 제거하고 유리 병에 넣어. EOB-DTPA의 19 mM의 주식 솔루션의 50 μL (0.5 μg의) 300 ㎕를 O를 추가F 4.0으로 pH를 높이기 위해 버퍼. 간단히 흔들어 5 분 동안 실온에서 용액을 배양한다. 1-5 μL의 분취 량을 제거하고 HPLC 또는 TLC 분석했습니다.
    3. . 물 / 트리 플루오로 아세트산 (99.9 % / 0.1 %), B - - 트리 플루오 / 아세토 니트릴로 아세트산 (99.9 % / 0.1 %), 그라데이션 A : 역상 (RP) C18 컬럼 (29)를 사용하여 다음 이동상에 무선 HPLC 분석을 수행 06 분 80 % A를 0 % → A (0.5 ㎖ / 분), 610 분 0 % A (0.5 ㎖ / 분).
    4. 곡선 아래의 영역으로서 무선 HPLC 신호의 피크 강도를 결정한다. 다음과 같이 추적의 방사 화학적 순도 (RCP)와 라벨 수율을 계산한다 :
      RCP = A 조지아-EOB-DTPA / (A 조지아 + A 조지아-EOB-DTPA)은 100 % ∙
      조지아-EOB-DTPA : 68 조지아 [EOB-DTPA]의 곡선 아래 영역
      조지아 : 무료 68 조지아의 곡선 아래 영역

3. 라벨 효율성

  1. 설명으로 라벨링 절차를 수행섹션 2.에 D (용출액의 신선도에 따라 40-140 μL) 68 조지아의 용출액의 활동을 시작하는 일관된 범위, 예를 들어, 22 ~ 29 MBq의.
  2. (68 조지아 용출액의 부피에 따라 40-190 μL) 3.8-4.0로 pH를 조정하기 위해 완충액의 요구량을 추가한다. 리간드 모액의 요구량 (19 mM의 용액을 10 내지 70 μL)을 추가한다.
  3. 1.75 mL의 각 라벨 프로브의 전체 볼륨을 조정하는 물을 필요한 양의 추가. 잘 혼합하고, 샘플을 실온에서 5 분간 방치하자. 라벨 수율을 결정하기 위해 2 절에 설명 된대로 HPLC 분석을 수행합니다.
  4. 0.1 μg의 단계에서 리간드의 양 μg의 μg의 0.1 내지 0.7와 라벨링 절차를 수행합니다. 각 리간드 농도 3 회 반복 실험을 수행합니다. 평균 수익률과 표준 편차를 계산합니다.

4. 체외 안정성

  1. 일반 페이지rocedure 및 준비
    1. 10 mm의 포스페이트 농도와 PBS 원액을 제조 탈 이온수 200 ml의 인산염 완충 염수 정제 (PBS)를 녹인다.
    2. 섹션 3. 샘플 인출에 기재된 바와 같이, 제 2 항에 기재된 바와 같이, 68 조지아 용출액의 부피에 따라 EOB-DTPA 원액 0.5 μL와 22 ~ 29 MBq 내지 68의 Ga의 표시를 수행 버퍼의 양을 조절 안정성 측정을 수행하는 추적의 6 ~ 12 MBq의를 포함하는 라벨 솔루션입니다.
    3. 용리액으로서 0.1 M 수성 시트르산 나트륨을 사용하여 80mm 실리카겔 피복 알루미늄 판에 무선 TLC 분석을 수행하고 TLC 방사능 스캐너 판을 분석한다. (30)은 곡선 아래의 영역으로서 TLC 신호의 강도를 결정한다. 다음과 같이 추적의 RCP 계산 :
      RCP = A 조지아-EOB-DTPA / (A 조지아 무료 + A 조지아-EOB-DTPA + A 조지아 콜로이드) ∙ 100 %
      조지아-EOB-DTPA : 68 조지아 [EOB-DTPA]의 곡선 아래 영역
      조지아 무료 : 무료 68 조지아의 곡선 아래 영역
      콜로이드 (68) 조지아의 곡선 하 면적 : 조지아 콜로이드
    4. 때마다 포인트 RCP의 t / RCP 0을 계산합니다. 기점 t = 0 분부터 시간차 따라서 표준화 RCP 플롯.
      시점 t에서 68 조지아 [EOB-DTPA]의 RCP의 t는 = RCP.
      t에서 68 조지아 [EOB-DTPA] = 0 분의 RCP 0 = RCP.
  2. 인산염 완충 염수 중 안정성 (A)
    1. 라벨 용액 65 ㎕를 7.4로 pH가 상승하는 PBS 스톡 용액 150 μL 및 수산화 나트륨 용액 (0.1 M)의 60 μL를 추가한다. 철저하게 섞는다.
    2. ( '출발점') TLC 분석을 수행 1-5 μL의 분취 량을 제거합니다. 즉시 37 ℃에서 항온 용액을 저장하고, 대표에서 TLC 분석을 수행 분취 삭제3 시간에 걸쳐 시점을 극상.
  3. PBS에서 아포 -transferrin의 과잉으로 안정성 (B)
    1. 라벨 용액 120 ㎕를 7.4로 pH가 상승하는 PBS 스톡 용액 50 μL 및 수산화 나트륨 용액 (0.1 M) 430 μL를 추가한다. 아포 -transferrin (25 ㎎ / ㎖)의 용액 40 μl를 추가합니다. 철저하게 섞는다.
    2. ( '출발점') TLC 분석을 수행 1-5 μL의 분취 량을 제거합니다. 즉시 37 ℃에서 항온 용액을 저장하고, 3 시간에 걸쳐 대표적인 시점에서 TLC 분석을 수행 분취 량을 제거한다.
  4. 인간 혈청의 안정성 (C)
    1. 인간 혈청 500 ㎕를 7.4로 pH를 높이기 위해 라벨링 용액 25 μL 및 수산화 나트륨 용액 (0.1 M)의 45 μL를 추가한다. 철저하게 섞는다.
    2. ( '출발점') TLC 분석을 수행 1-5 μL의 분취 량을 제거합니다. 즉시 인큐에서 솔루션을 저장37 ° C에서 울란바토르 분취 량을 제거는 3 시간에 걸쳐 대표적인 시점에서 TLC 분석을 수행한다.

분배 계수 5. 결​​정 (L) 접속자

  1. 7.4 pH를 올리는 PBS 스톡 용액 20 μL 및 수산화 나트륨 용액 (0.1 M) 170 ㎕를 추가 라벨 용액 50 μL에 제 2 항에 기재된 표시 절차를 수행한다.
  2. 해당 솔루션에서 200 μl를 철회 및 플라스틱 V-유리 병에 넣어. n 옥탄 올의 200 μl를 추가합니다. 2 분 동안 유리 병 및 소용돌이를 닫습니다. 그런 다음 5 분 동안 1,600 XG에서 샘플을 원심 분리기.
  3. n 개의 -octanol 상과 각 성상에서 40 μL의 삼중를 제거하고 별도의 V-유리 병에 넣어. 레이어를 혼합하지 않도록주의하십시오.
  4. 30 초 동안 잘 감마 카운터로 각 시료의 활성을 측정한다. 각 시료는 즉시 회 측정을 반복하고, 그 평균 활동 Ᾱ의 t를 계산 들어 t을 나열, 각과 함께 W1, Ᾱ의 t, W2 및 Ᾱ의 t, W3 (수성 샘플 활동) 및 Ᾱ의 t, O1, Ᾱ의 t, O2, Ᾱ의 t, O3 (n 옥탄 올 활동) 그 판정 시점 t.
  5. t를 0으로 마지막 샘플의 측정 시점을 정의한다. 결정의 Δt = TT 0을 계산하여 분에서의 Δt를 나열합니다. 다음 식을 사용 Ᾱ (T)의 감쇠 보정을 수행
    0 = Ᾱ의 t · 2 (의 Δt / 68 분).
  6. 의 평균으로 W0을 계산 Ᾱ 0, W1,0, W2 및 Ᾱ 0, W3뿐만 아니라 Ᾱ 0, O의 평균으로 Ᾱ 0, O1,0, O2 및 Ᾱ 0, O3. 다음 식을 사용하여 계산 (L) 접속자 :
    (L) 접속자 = 로그 [(Ᾱ 0, W · 33 μg의)].
  7. 삼중의 전체 실험을 수행하고 그 표준 편차와 함께 평균 (L) 접속자을 계산합니다.

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Representative Results

리간드 EOB-DTPA와 비 방사성의 Ga (III) 1 H, 13 C} {1 H NMR 스펙트럼, 질량 분석 및 원소 분석을 통해 분석 하였다 복합체. 도 1-6에 표 1에 도시하고 그 결과는 물질의 순도를 확인.

68 창 / 68 조지아 발생기의 용출은 400-600 MBq의 68 조지아의 솔루션을 얻었다. 원하는 트레이서 68 가인 [EOB-DTPA]의 형성에 기재된 라벨 절차 결과, 2.8 분 (도 7)의 체류 시간을 나타내는 전파 HPLC 피크로서 나타났다. 220 나노 미터 (2.7 분,도 8)의 UV-힘 검출기 조지아 [EOB-DTPA] 표준의 유지 시간과의 비교는 성공 표시를 확인한다. 배위 68의 Ga 2.1 분에서 단일 피크로서 검출된다 (도7). EO-BDTPA의 68의 Ga 표지 효율을 HPLC를 통해 리간드 농도의 함수로서 표시 수율 (도 9)를 결정하여 조사 하였다. 수율은 세중 결정하고, 표준 편차를 계산 하였다.

pH를하고, 용액에 존재하는 비 배위 음이온의 농도에 따라 68 가인 다양한 종, 예를 들면 갈 레이트 또는 불용성 하이드 록 사이드로 존재할 수있는 비 - 표지. (31)은 일반화 된 용어 "자유 68 가인 '(32)는 모든 비 - 표지에 사용 일반적으로 "콜로이드 (68) 조지아"라고 수산화물 제외 솔루션 종. 설명 된 분석 조건 하에서, 프리 68 조지아는 TLC 플레이트에서 용매 전방 (R의 F = 1.0)로 이동한다. TLC 판에 활동으로 나타납니다 동안 콜로이드 (68) 조지아는 HPLC를 통해 검출 할 수 없다원점에서 (R f를 = 0). TLC 방사능 스캐너로 분석 TLC 판의 대표적인 크로마토 그램.도 10에 도시되어 추적기에 따라 다른 보존 동작을 나타낸다 여부 라벨링 용액 시료 (pH가 3.8-4.0, R의 F = 0.3) 또는 생체 샘플 산도 (R의 F = 0.5)을 분석 하였다.

희석 PBS에서 갓 생리적 산도의 샘플에 추가 된 68 조지아 [EOB-DTPA] 표시된 추적의 안정성, 희석 함유 PBS (인산 농도 5.5 mM의, A), apo- 트랜스페린 초과 (1.6 ㎎ / ㎖를 조사하려면 각각 0.8 mM의 포스페이트 농도, B) 및 인간 혈청 (C)와. 시간이 지남에 따라 샘플 추적의 방사 화학적 순도 (RCP의 t)는 TLC를 통해 결정되었다. 그대로 트레이서의 비율이 RCP (T)의 비율로서 계산 하였다시작점에서의 각 시점 및 RCP 0 (표 2). 이는 RCP 0 (93~96%)를 상이한 트레이서를 함유하는 라벨 솔루션 필요가 있었다. 그대로 추적자 이렇게 표준화 된 비율은도 11에서 시간의 함수로서 도시되어있다.

희석 된 PBS 용액에서 추적자 (L) 접속자 수성 샘플의 결정을 위해 준비 하였다. 샘플은, n 옥탄 올과 혼합하여 원심 분리하고이어서 분취 모두 상에 활성 농도를 결정 하였다 제거 하였다. 활동 값 (L) 접속자의 후속 계산을 표 3에 나타내었다. (L) 접속자의 평균 값은 3.54 ± 0.08이다.

그림 1
도 1 1 EOB-DTPA의 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. < / strong>을 스펙트럼은 400.1 MHz에서 D 2 O에 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 13 C {1} H EOB-DTPA의-NMR 스펙트럼. 스펙트럼은 100.6 MHz에서 D 2 O에 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
EOB-DTPA 그림 3. MS (전기 이온화 (ESI), 메탄올, 부정적인 모드).54334fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
조지아 [EOB-DTPA] 그림 4. 1 H-NMR 스펙트럼. 스펙트럼은 400.1 MHz에서 D 2 O에 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 13 C {1} H 조지아 [EOB-DTPA]의-NMR 스펙트럼. 스펙트럼은 100.6 MHz에서 D 2 O에 기록되었다. 그녀를 클릭하세요 전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 6
조지아 [EOB-DTPA (ESI, 메탄올, 부정적인 모드) 그림 6. MS, 분자 피크의 동위 원소 패턴의 상세한 묘사와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
가가 [EOB-DTPA]가 부에 함유 배위 68 조지아는 방사능 검출기에 의해 기록 된대로. 조화롭지 68의 Ga 2.1 분의 체류 시간을 나타낸다 (68)의 시료도 7 대표적인 HPLC 크로마토 그램, 트레이서 2.8 분에서 감지되고있는 채로 .대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
표준 물질 조지아 [EOB-DTPA] 그림 8. 대표 HPLC 크로마토 그램, 220 nm에서 UV - 마주 채널에서 검출있다. 추위 표준의 체류 시간은 2.7 분이다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.

그림 9
EOB-DTPA의 68 조지아 - 라벨 효율의 그림 9. 묘사. HPLC를 통해 결정되는 라벨 수율은 EOB-DTPA의 농도의 함수 (22 ~ 29 MBq의 시작 활동의 pH 3.8-4로 그려집니다0.0, 5 분간 RT). 표준 편차가 오차 막대로 묘사되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
다른 68 조지아 종을 공개 그림 10. 대표 TLC 크로마토 그램. 희석 PBS에서 68 조지아 [EOB-DTPA (인산 농도 5.5 mM의, 산도 = 7.4)의 샘플을 배양 110 분 분석 하였다. 콜로이드 (68) 조지아의 예시 분포 (R f를 = 0), (68) 조지아 [EOB-DTPA (R f를 = 0.5) 및 (68)는 조지아 TLC 방사능 스캐너에 의해 검출로 70mm TLC 판에 (R f를 = 1.0) 무료 발표했다. 카운트가 붕괴 수정합니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

그림 11
다른 매체에서 68 조지아 [EOB-DTPA] 그림 11. 안정성 결정. 감쇠 보정, TLC를 통해 결정된 그대로 추적의 표준화 된 비율은 시간의 함수로 묘사되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

1 번 테이블
피크 NMR 분광, MS와 EOB-DTPA와 조지아 [EOB-DTPA]에 대해 수행 원소 분석. 상대 MS의 피크 강도가 %에 제시되어, 할당 표 1. 결과는 대괄호로 제공됩니다. CHN 원소 값 calcu 있었다C 23 lated H 33 N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) 및 (NH 4) 0.75 H 1.25 [C (23) H (28)의 GaN (3) O (11)] · 2H 2 O (GA [EOB-DTPA).

표 2
다른 매체에서 68 조지아 [EOB-DTPA] 표 2. 안정성 결정. 미디어 A, BC에서 68 조지아 [EOB-DTPA]의 RCP는 주어진 시점에서 TLC를 통해 결정되었다. 샘플의 조성물은 추적 / 무료 68 조지아 /의 %의 비율 콜로이드 (68) 조지아로 제공됩니다. 그대로 추적의 비율은 RCP의 t / RCP 0의 비율로 표준화된다. RCP 0 t = 0 분에서 추적의 각 RCP이다.


. 시료 (L) 접속자 붕괴 3. 결정은, 값이 0 α 세 분취 량 (X = 1, 2, 3) 각 단계에서 제거 (: 수성, O, N -octanol W)의 X 수정. 모든 활동은 노출 당 비용 (CPM)에 제시되어있다. 프로토콜의 섹션 5에 기술 된 바와 같이 (L) 접속자가 계산된다. 실험은 두번 반복되었다.

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Discussion

EOB-DTPA 다단계 합성 (33)를 통해 액세스 할 수 있지만 단지 또 gadoxetic 아세트산 함유 사용할 조영제로부터 분리 될 수있다. 이를 위해, 중앙 하나님 (III) 이온은 옥살산의 과잉으로 석출 할 수있다. 하나님 (III), 옥살산 및 옥살산을 제거한 후 리간드을 pH 1.5에서 냉수 침전에 의해 단리 될 수있다. 그러나, 여액 수율 칼럼 크로마토 향상시키기 위해서 대신에 또는 후속 절차로 수행 될 수있다. 두 방법은 70 %의 총 수익률에서 분석적으로 순수한 리간드 (그림 1-3, 표 1)를 산출한다.

우리의 Ga를 분리하기 위해 [EOB-DTPA]가 부산물 염화 암모늄의 승화를 통해 매우 친수성 잔기로부터 제거 될 수 있기 때문에, 수산화 나트륨의 사용에 유리한 비교 암모니아수로 pH를 조절하는 것으로 나타났다. 상기 조건이 과정은 천천히 일어난다LY. 염화 무시할 수없는 양이 5 일 후에도 검출 된 이후, 나머지 염은, 메탄올로 세척 하였다. 조지아 [EOB-DTPA]의 부분적인 손실이 작업 업 절차의 결과는, 제품은 46 %의 전체 수율 분석 순도를 얻었다 (4-6, 1도).하지만 EOB-DTPA 및 조지아 양자의 분리를위한 (III) 착체는 역상 크로마토 그래피는 극성이 높은 용매를 사용할 경우 실리카 겔 분해 가능성 특히 이후 정제의 대안으로 이용 될 수있다.

EOB-DTPA의 라벨링 처리는 175 mL의 샘플 (68)의 Ga 2 MBq의 (나노 몰의 양으로 존재로 인해 68 조지아에 경쟁 금속 이온의 존재를 피하기 위해 용매 화학 무 금속 장비 고순도의 사용을 필요 ) 0.14 nm의 핵종의 농도와 동일. 68 조지아에 EOB-DTPA의 라벨은 다섯 분 이내의 pH 3.8-4.0에서 발생실온에서 백인 군대. 반응 조건의 pH, 온도 및 반응 시간을 유지뿐만 아니라 68 조지아 상수 또는 정당한 범위 내에서 활동을 시작하면서 68 조지아 - 라벨 효율에 조사가 표시 수율의 결정을 필요로한다. 각 데이터 포인트에 대한 (즉, 리간드 농도) 실험은 리간드와 68의 Ga 모두의 농도 때문에, 합리적인 신뢰도를 제공하기 위해 매우 낮은 적어도 세 번되어 수행되어야 심지어 약간의 편차 표지 수율 따라서 민감한 반응 조건. 예를 들어, 68의 Ga 용출 연령으로, 볼륨 증가 분취하여 버퍼 증가량 필요한 일정한 시작 활동을 제공하기 위해 회수 할 필요가있다. 또한, 음 따라서, 그 자체가 68 가인위한 경쟁자로서 작용할 수있는 붕괴 생성물 68 아연의 농도 증가에 영향을 미치는 labelin 용출액 결과 노화22 ~ 29 MBq의 68 조지아의 g 효율성. 13,34,35 실제로 양적 라벨은 무료 (68)의 내용 조지아 ≤ 2 %와 약 5, EOB-DTPA의 양 ≥ 0.7 μg의 (그림 9)와, 상기 조건 하에서 달성 샘플 콜로이드 (68) 조지아 존재 %.

HPLC 무료 68 Ga 및 68 조지아 [EOB-DTPA]의 뛰어난베이스 라인 분리를 제공하지만,이 콜로이드 (68) 조지아를 검출하기 위해 적합하지 않습니다. 따라서 우리는 트랜스페린 또는 단백질 바인딩의 정량화가 68 가인이 요구 한 것을 특징으로 안정성을 측정하는 동안 RCP를 결정하기 위해 TLC를 선택했다. 우리는이 목적 (그림 10)에 대한 허용 기준 분리를 발견; 그러나, 크기 배제 크로마토 그래피 또는 여과 방법 15,36의 사용은 HPLC 분석 하였다 콜로이드 분획, 대안으로 고려 될 수있는 제거한다. 68 가인 단지는 강한 RET 전시TLC 플레이트상에서 ention 생리적 pH를 (R의 F = 0.5)에서 시료와 달리 시료 라벨링 용액으로부터 직접 인출되는 경우 (R의 F = 0.3). 우리는 이러한 관찰은 복잡한 다른 양성자 상태에 의해 설명 될 수 있습니다 제안합니다.

68 조지아 추적기의 생체 안정성 결정은 일반적으로뿐만 아니라 혈액의 68 조지아의 주요 경쟁자, 또는에있는 apo- 트랜스페린 (37)를 포함하는 솔루션 PBS 15,17 또는 생리 학적 pH가 37을 흉내 낸 다른 버퍼 시스템에서 수행에 인간 혈청 15,17. 실험에서 PBS에 0.​​1 M 수산화 나트륨 용액의 첨가는 7.4 샘플의 pH를 조정하기 위해 필요 하였다. 포스페이트 농도가 저하 속도에 영향을 미치는 것을 우리는 포스페이트 농도 (0.8 mM 내지 5.5 mM의이 (A))을 수득 비 reprodu 다양한 용액 안정성 실험 이후 주장 없었다cible 결과. 그러나 용액 B가 함유가 APO -transferrin 0.8 mM의 인산 (통상 플라즈마 콘텐츠 (38)의 범위 내에서 1.6 ㎎ / ㎖가) (인간의 혈액은 보통 0.8 ~ 1.5의 인산염 수준 밀리미터 (39, 40)을 나타내는 것을 발견 ), 인간 혈청 (C)에서 해당 관측에 필적하는 속도로 분해됩니다. 무료 68 조지아의 함유량이 용액 A에서 11 %로 증가 하였다 동안 솔루션 AC는 185 분 콜로이드 (68)의 콘텐츠 이후의 Ga, 약 24 % 용액 C의 용액 B 17 % 및 27 % (표 2 증가했다 ). 콜로이드 반대 또는 B 단백질 바인딩 68 Ga 및 C 인해 트랜스페린 포화도 또는 비교적 느린 트랜스페린 결합 요금에있을 68 가인이 추적 분해에 의해 형성된다는 사실은 무료 68 조지아로 주로 존재한다. (68) 조지아 [EOB-DTPA]의 (그림 11)과 유사한 DTPA 파생 킬레이트을 갖춘 추적자 비교입니다. 15, 16, 18 일반적으로 간의 초기 동맥과 정맥 관류 단계에 대한 자세한 내용은 투여 후 처음 삼분 4,21 내에 MRI 스캔을 수행하여 얻은 하나님 [EOB-DTPA, 간세포 존재하에 20 분간 3,4,23까지 몇 시간이 주사 후 21, 22에 지연된 위상 검출된다. 인간 혈청 20 분 후 68 조지아 [EOB-DTPA]의 93 %는 그대로 유지됩니다. 예상대로, 즉 시간에 따라 신호 대 잡음비로 인해 플라즈마 및 조직 발현 트랜스페린 수용체에 존재할뿐만 아니라, 68 조지아 몰식자산 무료 68의 Ga 트랜스페린의 양이 증가 악화 것이다. (41, 42)

계수 로그 추적자의 조직 분포 n 옥탄 올 / 물 분배를 예측P 또는 분배 계수는 두 단계로 방사능 농도의 비로서 결정될 수 (L) 접속자. 정의에 의해, (L) 접속자 파라미터 인해 다른 양성자 트레이서의 상태뿐만 아니라, 성상에서의 분해의 가능성을 실험에 적합하게하는 매체로서, 복수 종 존재를 구별하지 않는다. 추출 (L) 접속자를 결정하는 수성 매질은 일반적으로 0.8 mM 내지 생리 학적 pH를 인산 농도를 나타내는, 혈액 조건. 우리는 PBS로 희석 사용될 상기 이유로 17,43-45을 모방하는 PBS로 버퍼링된다. N 개의 -octanol 원심 추출에 이어, 동일한 위상에서 여러 분취의 제거 피펫으로 인한 부정확성을 가능하게 감소된다. 때문에 n 옥탄 올의 매우 낮은 방사능 농도 하나는 수상과 교차 오염되지 않도록주의해야하며, 별도의 유리 병에 양적 전송을 보장하기 위해. DISTRIB이 절차에 의해 결정의 ution 계수 재현이었고, 그들은 지용성의 대략적인 추정을 허용하면서 하나님의적인 log P [EOB-DTPA]에 직접적인 비교는 불가능하다. 때문에 하나님 [EOB-DTPA]를 친 유성에서 오히려 살아있는 주제 또는 세포에서의 간담 흡수 추가 실험은 68 조지아 [EOB의 생체 내에서보다 광범위한 생체 분포에 대한 정보뿐만 아니라 안정성을 제공해야 할 것하지 주로 결과의 특이성에 -DTPA]. 전부, 영상 관류에 대한 에이전트와 초기 간담 위상 응용 프로그램이 상상할 수있는 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
primovist Bayer - 0.25 M
gallium(III) chloride Sigma-Aldrich Co. 450898
water (deionized) - - tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH
hydrochloric acid 12 M VWR 20252.29
sodium hydroxide Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. 810925429
oxalic acid Sigma-Aldrich Co. 75688
ethyl acetate Brenntag GmbH 10010447
silica gel Merck KGaA 1.10832.9025 Geduran Si 60 0.063-0.2 mm
TLC silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.16834.0001
methanol VWR 20903.55
ethanol Brenntag GmbH 10018366
eiethylether VWR 23807.468 stored over KOH plates
ammonia solution (25%) VWR 1133.1
pH electrode VWR 662-1657
stirring and heating unit Heidolph 505-20000-00
pump Ilmvac GmbH 322002
frit - custom design
NMR spectrometer Bruker Coorporation - Ultra Shield 400
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific Inc. -
elemental analyser Hekatech GmbH Analysentechnik - EuroVector EA 3000 CHNS
deuterated water D2O euriso-top D214 99.90% D
Material/Equipment required for labeling procedures
68Ge/68Ga generator ITG Isotope Technologies Garching GmbH A150
pump and dispenser system Scintomics GmbH - Variosystem
hydrochloric acid 30% (suprapur) Merck KGaA 1.00318.1000
water (ultrapur) Merck KGaA 1.01262.1000
sodium chloride (suprapur) Merck KGaA 1.06406.0500
sodium acetate (suprapur) Merck KGaA 1.06264.0050
glacial acetic acid (suprapur) Merck KGaA 1.00066.0250
sodium citrate dihydrate VEB Laborchemie Apolda 10782 >98.5%
PS-H+ Cartridge (S) Macherey-Nagel 731867 Chromafix
apo-Transferrin Sigma-Aldrich Co. T2036
PBS buffer (tablets) Sigma-Aldrich Co. 79382
human serum Sigma-Aldrich Co. H4522 from human male AB plasma
flasks, columns, etc. custom design
pH electrode Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG 765-Set
binary pump (HPLC) Hewlett-Packard G1312A (HP 1100)
UV Vis detector (HPLC) Hewlett-Packard G1315A (HP 1100)
radioactive detector (HPLC) EGRC Berthold
HPLC C-18-PFP column Advanced Chromatography Technologies Ltd. ACE-1110-1503/A100528
HPLC glass vials GTG Glastechnik Graefenroda GmbH 8004-HP-H/i3µ
pipette Eppendorf -
plastic vials Sarstedt AG & Co. 6542.007
plastic vials Greiner Bio-One International GmbH 717201
activimeter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2010
tweezers custom design
incubator Heraeus Instruments GmbH 51008815
vortex mixer Fisons - Whirlimixer
centrifuge Heraeus Instruments GmbH 75003360
gamma well counter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2100
water for chromatography Merck KGaA 1.15333.2500
acetonitrile for chromatography Merck KGaA 1.00030.2500
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
TLC radioactivity scanner raytest Isotopenmessgeräte GmbH B00003875 equipped with beta plastic detector

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