CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

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Biology

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Summary

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

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Liang, H., Akladios, B., Canales, C. P., Francis, R., Hardeman, E. H., Beverdam, A. CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations. J. Vis. Exp. (114), e54401, doi:10.3791/54401 (2016).

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Abstract

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Die äußere Schicht der Epidermis besteht aus den interfollikulären Epidermis, die eine geschichtete Plattenepithel ist die meisten unserer Körper abdeckt und epidermalen Anhangs wie die Haarfollikel und Schweißdrüsen. Die Epidermis erfährt Regeneration während des Lebens und in Reaktion auf eine Verletzung. Dies wird ermöglicht durch K14-exprimierenden basal epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen, die von mehreren Regulationsmechanismen streng reguliert werden aktiv in der Epidermis und zwischen Epidermis und Dermis. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, mit voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und K14-Protein-Expressionsmuster visualisieren, Ki67 Zellen markiert wuchernden, Nile Red markierten Sebozyten und DAPI Kern Kennzeichnung auf Einzelzell Auflösung in 3D. Diese Methode ermöglicht eine genaue Bewertung und Quantifizierung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. Das CUBIC-Protokoll ist the beste Methode bisher verfügbaren molekularen und zellulären Wechselwirkungen in Vollhautbiopsien bei einzelnen Zelle Auflösung zu untersuchen.

Introduction

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Es besteht aus drei Hauptschichten die äußeren Epidermis, die Dermis und die Hypodermis. Die Epidermis ist ein hoch regenerative Gewebe. Es ist ein Plattenepithelkarzinom geschichteten Epithels, bestehend hauptsächlich aus Keratinozyten. Keratinozyten sind in der basalen Schicht geboren und nach oben durch die Suprabasalschichten bewegen, während Differenzierung, und schließlich werden sie in der äußeren Hornschicht etwa einen Monat nach ihrer Geburt zu vergießen. Die Epidermis entsteht eine Reihe von Anhängsel einschließlich der Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Haarfollikel regenerieren auch in einer zyklischen Art und Weise während des gesamten Lebens 1. Die regenerative Kapazität der Epidermis wird durch die Anwesenheit von Stamm- und Vorläuferzellen aktiviert , die in der Basalschicht der Epidermis und interfollikulären Haarfollikel 2 befinden.

Viele Signalwege wurden in epidermalen Entwicklung und Regeneration gebracht. Einige davon treten innerhalbdie Epidermis nur, wie das Hedgehog-Weg. Andere Signalereignisse stattfinden zwischen Dermis und Epidermis 3. Zum Beispiel Wnt - Signale von der Dermis sind gedacht für Haarfollikel - Entwicklung wichtig zu sein, und sie werden von der dermalen Papille zu Beginn der anagenen sekretiert Haarfollikel Ausbuchtung Stammzellen / Vorläuferzellproliferation und Haarfollikel Wachstum 4 aktivieren. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die den epidermalen Entwicklung und Regeneration zu steuern, besser zu verstehen, wie sie in der regenerativen Hautkrankheit gestört werden kann, wie Hautkrebs.

Dieser Artikel beschreibt eine C lear, nobstructed U B regen I maging Cocktails und C omputational Analyse (kubisch) Protokoll 5-7 ganze Berg Hautpräparate zu klären und Proteinexpressionsmuster in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Die CUBIC Verfahren beinhaltet das Eintauchen HautGewebe in zwei Aminoalkohol-basierten chemischen Cocktails. Diese Lösungen stellen Sie die Brechungsindizes in der Hautprobe, so dass das Gewebe transparent und die Proteine ​​intakt, so dass Immunnachweis auf Einzelzellauflösung.

Mit diesem CUBIC-Protokoll, die basale und wuchernden Keratinozyten-Populationen in den interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel wurden in Vollhautbiopsien von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von Anti-Keratin14 (K14) und Anti-Ki67-Antikörper abgebildet. Talgdrüsen in Wildtyp- Hautbiopsien wurden auch Färbung mit Nile Red sichtbar gemacht. Schließlich wurden 8 verglichen die basalen Keratinozyten - Populationen in Wildtyp- und hyperplastischem YAP2-5SA-& Delta; C Hautbiopsien.

Dieses CUBIC-Protokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Proteinexpression in Vollhautbiopsien bei Einzelzellauflösung und ist ein wichtiges Instrument epidermalen Anatomie und morphologische Defekte in der Haut von gentechnisch veränderten zu schätzenMäuse und die zellulären und molekularen Mechanismen der epidermalen Entwicklung und Regeneration zu untersuchen.

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Protocol

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) bei UNSW Australien unter ACEC genehmigten Protokoll 13 / 64B.

1. Vorbereitung der Transparent-Maus Hautgewebe

Anmerkung: Alle Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren auf einer C57BL / 6 genetischen Hintergrund

  1. Sammlung der Maushautgewebe.
    1. Human euthanize die Mäuse durch zervikale Dislokation.
    2. Sorgfältig Haare aus dem jeweiligen Hautbereich zu entfernen mit einem Trimmer kümmert sich nicht um die Haut zu verletzen.
    3. Haut mit 70% Ethanol in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zu dekontaminieren.
    4. Heben Sie dorsalen Halshaut mit einer Pinzette und machen Schnitt mit einer Schere.
    5. Sezieren einen großen Bereich der dorsalen Haut von Mäusen (ca. 1,5 x 4 cm).
    6. Flatten Haut Dermis-Seite nach unten auf einem Filterpapier, und notieren Sie sich die anterior-posteriore Ausrichtung der Probe.
    7. Trim Filterpapier um den sezierten Haut und in einem 15 ml Röhrchen mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung in PBS gefüllt.
    8. Fix für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C.
    9. Waschen Sie die Haut 2 x 5 min in PBS in einem 15-ml-Tube.
      Hinweis: Die folgenden (1.1.10 - 1.1.12) sind optionale Schritte zur Langzeitlagerung von Gewebe.
    10. Dehydratisieren seziert Haut in PBS mit einer Konzentration von Ethanol Erhöhung (25%, 50% 70%) in einem 15 ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur.
    11. Lagern Sie dehydrierte Haut in 70% Ethanol in PBS in einem 15-ml-Röhrchen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    12. 4 Stunden vor dem Clearing, das Hautgewebe in PBS rehydriert mit Ethanolkonzentration abnimmt (70%, 50%, 25%, 0%) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur.
  2. Löschen der Maus Hautbiopsien
    1. Bereiten Sie die CUBIC1 Klärlösung durch Auflösen 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N ', N'Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin in 5,38 ml Wasser auf die Heizung auf 60 eingestellt destilliert - 70 ° C. Verwenden Sie einen heißen Rührer.
    2. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und auf Raumtemperatur abgekühlt.
    3. Schneiden Sie die Haut von Mäusen mit einer scharfen Rasierklinge in Biopsien von ungefähren Abmessungen 0,2 x 0,5 cm, und in 5 ml CUBIC1 Clearing-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen versenken. Um die Visualisierung der Haarfollikel zu optimieren, dass die längere Seite der Biopsie entlang der antero-posterioren Richtung der Probe geschnitten wird.
    4. Platzieren auf einer rotierenden Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 ° C.
    5. Ändern Sie den Clearing-Lösung nach 7 Tagen. Bereiten Sie frische CUBIC1 Lösung vor der Verwendung.
    6. Überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes nach 7 Tagen. Bei Bedarf lassen Biopsien in CUBIC1 Clearing-Lösung, bis das Gewebe vollständig transparent ist.
    7. Sobald die Hautbiopsie ist transparent,Entfernen Sie die CUBIC1 Lösung und 4 ml 1 × PBS, das Gewebe 4 mal 6 Stunden bei 37 ° C zu waschen.
    8. Waschen Sie die Hautgewebe in 20% w / v Sucrose in PBS in einem 15 ml Röhrchen für 4 Stunden bei 37 ° C.
    9. Frieren Sie das Gewebe in Eindeckmediums optimale Schnitt Temperatur (OCT) Verbindung in einem 15-ml-Röhrchen über Nacht in einem -80 ° C Gefrierschrank.
      Hinweis: Dieser Schritt der Biopsie der Permeabilität für die Antikörper-Penetration in den nachfolgenden Schritten wird zunehmen.

2. Immunfluoreszenzanfärbung

  1. Auftauen Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 - 3 Stunden.
  2. Wasch Gewebe in der 15-ml-Röhrchen mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur OCT-Verbindung zu entfernen.
  3. Transfer Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, und Inkubieren Gewebe in 1 ml Kaninchen-anti-Keratin14 oder Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper, beide verdünnt 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C heißen Ofen.
  4. Transfer-Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen, einnd waschen Gewebe 4 mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen.
  5. Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml Anti-Kaninchen-Alexa594 sekundären Antikörper 1: 100 verdünnt in PBST und Inkubation 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen.
  6. Transfer Biopsien in ein 15 ml-Röhrchen und wasche 4 Mal Gewebe für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen.
  7. Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Kern counterstain Lösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen.
  8. Entfernen DAPI Gegenfärbelösung und 1 ml PBST auf die 2-ml-Röhrchen Gewebe 4 mal 6 Stunden auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen.
    Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden.

3. Nil-Rot-Färbung

  1. Auflösen Nile Red Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml
  2. 1 & mgr; l Nile Red Lösung auf 1 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 & mgr; g / ml.
  3. Auftau-Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 bis 3 h und wasche mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur.
  4. Übertragen Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen und unterzutauchen Gewebe in 1 ml Nile Red Färbelösung 2,5 h bei Raumtemperatur.
  5. Waschen Sie die Hautbiopsien in der 2-ml-Röhrchen mit 1 ml PBST 4 mal für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Entfernen PBST-Lösung aus dem 2-ml-Röhrchen, 1 ml DAPI Kern Gegenfärbelösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.
  7. Entfernen DAPI Gegenfärbelösung, und fügen Sie 1 ml PBST im 2-ml-Röhrchen das Hautgewebe 4 mal 6 Stunden bei Raumtemperatur zu waschen.
    Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden.

4. Imaging

  1. Bereiten Sie die CUBIC2 Clearing-Lösung, die 50 enthält% (W / v) Saccharose, 25% (w / v) Harnstoff, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100.
  2. Inkubiere das Hautgewebe in 1 ml CUBIC2 Lösung in einem 2-ml-Röhrchen auf einem Schüttler für 24 h in einem 37 ° C-Ofen. Dieser Schritt wird der Brechungsindex des Gewebes gleichmäßig.
  3. Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald es klar ist, positionieren die gesamte Hautbiopsie (0,2 x 0,5 cm) an seiner längeren Seite auf einem Deckglas, so dass die Richtung der Länge der Haarfollikel ist parallel zur Deckfläche (# 1 24 x 60 mm)
    Hinweis: Optional Schritt: Antikörper-gefärbten Biopsien für ungefähr 7 Tage in CUBIC2 Lösung gelagert werden. Nile Red-gefärbten Biopsien können nur für bis zu 1 Tag in CUBIC2 Lösung gelagert werden und sollte so schnell wie möglich abgebildet werden.
  4. Bereiten Abbildungskammer (Abbildung 1)
    Hinweis: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind: blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) (Fild 1A).
    1. Bereiten Sie zwei dünne Streifen blau Tack (Durchmesser ca. 1 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser (1B).
    2. Legen blau tack Streifen auf einem Deckglas, so dass genügend Platz für die Hautbiopsie (1C). 4.4.3)
    3. Platzieren Hautbiopsie in zwischen den Streifen auf dem Deckglas in einem Tropfen CUBIC2 Lösung (1C).
    4. Bedecken Hautbiopsie mit dem zweiten Deckglas (1D).
  5. Setzen Sie die Druckkammer mit der montierten Hautbiopsie auf die Bühne eines konfokalen Mikroskops und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen.
  6. Scannen Sie die Probe unter Verwendung eines Quecksilber oder Halogen - Lichtquelle und Standard - Epifluoreszenz - Filter (zB DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) zu fluoreszierend gefärbten Regionen von Interesse zu identifizieren.
  7. Bildbereiche von Interesse unter Verwendung eines 10X und 20X Objektiv (NA 0,75) und Standard - konfokale Fluoreszenz - Imaging - Techniken (z. B. mit DAPI gefärbten Proben beleuchten mit einem 405-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 425-475 nm und mit Alexa Fluor 594 oder Nile Red-gefärbten Proben beleuchten mit einem 561-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 570-620 nm).
  8. Generieren Bild Z-Stapel jeder Region von Interesse unter Verwendung des Mikroskops Z-Stapel Bildaufnahme - Software (z. B. unter Verwendung von NIS Elemente Imaging Software 4.13 wie unten beschrieben).
    1. Sorgen für eine optimale Laserleistung und PMT HV / Offset-Einstellungen ausgewählt wurden Probenfluoreszenz zu sammeln.
    2. Öffnen Sie die "ND Acquisition" Symbolleiste "Acquisition Controls".
    3. Wählen Sie "Z-Serie Setup" Register (sicherzustellen, dass alle anderen Registerkarten nicht ausgewählten) sind.
    4. Während Live-Scannen, den Fokus auf das obere Ende der Probe und drücken Sie die "Top" Taste.
    5. Fokus auf der Unterseite der Probe und drücken Sie die "Unten" -Taste.
    6. Eingabe erforderlich Schrittgröße (oder drücken Schrittgröße Taste optimiert).
    7. Vorss die "Run now" klicken.
    8. Speichern resultierende Z-Stapel als einzelne Tiff Bildstapel (1 Fluorochrom pro Bild Z-Stack).
  9. Verwenden Bild Z-Stapel 3D - Volumen Regionen von Interesse mit Hilfe von 3D - Analyse - Software zu rekonstruieren (z. B. unter Verwendung von Imaris x64 7.2.3 wie unten beschrieben).
    1. Starten Sie Analyse-Software.
    2. Wählen Sie "Surpass" Button in der Toolbar für 3D-Volumen Generation.
    3. Öffnen erstes Farbbild Z-Stapel (z. B. DAPI).
    4. Verwenden Sie den "Channel hinzufügen" Tool zusätzliche Farbkanäle hinzuzufügen, einen Kanal pro Fluorochrom. So wird eine Probe sowohl DAPI und Alexa Fluor 594 Fluorochrome enthalten, werden zwei Kanäle erfordern.
    5. Verwenden Sie die "Bild-Eigenschaften" Werkzeug richtig Pixel (Voxel) Dimensionen (XYZ) zu setzen, wie in 4.7 oben bestimmt.
    6. Verwenden Sie "Display - Einstellung" Werkzeugkanal Farben nach Bedarf zu ändern (zB Set DAPI Kanal zu blau, Alexa Fluor 594 - Kanal rot).
    7. Um position das 3D-Volumen im Bildfenster, verwenden Sie die Computer-Maus nach Bedarf durch Klicken und Ziehen Volumen.
    8. Verwenden Sie den "Snapshot" Werkzeug in der Werkzeugleiste Screenshots des 3D-Bild zu erzeugen.
    9. Verwenden Sie die "Animation" in der Werkzeugleiste Filme von 3D-Probenrotation zu erzeugen.

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Representative Results

Volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt, gefärbt mit einem Antikörper - Bindung basalen Keratinozyten Marker Keratin14 (K14) und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 2 und Film 1).

DAPI-positiven Kerne sichtbar waren in der gesamten Probe (2A, C) und K14 - Färbung sichtbar war ausschließlich in der Ein-Zelle dick Basalschicht der interfollikulären Epidermis, und umreißt die Talgdrüsen (schwarze Sternchen), die äußeren Wurzelscheiden Haarfollikel und in den sekundären Haar Keime (2B, C), wie zuvor 9 veröffentlicht. K14 Färbeintensität war hoch in den interfollikulären Epidermis, das distale Haarfollikel und die sekundären Haar Keime (weiße Sternchen), und es war in der Ausbuchtung Bereich des Haarfollikels (Bu in 2C) relativ gering. Die dermale Papillen waren auch deutlich Einsehbaree durch DAPI Markierung (Pfeil in Abbildung 2C).

Zur Visualisierung Zellen, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien in Telogen von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt und gefärbt mit einem Anti-Ki67 - Antikörper wuchernden und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Lösung (Abbildung 3, und Movie 2).

Proliferierende Keratinozyten wurden in den basalen interfollikulären Epidermis (IFE in 3C) und in dem Isthmus (ist in 3C) der Haarfollikel, aber nicht in der Wulstregion (Bu in 3C) nachgewiesen.

Um Talgdrüsen, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien in Anagen der erwachsenen Mäuse Wildtyp- visualisieren wurden mit Nile Red geklärt und gefärbt, die den Fettgehalt von Sebozyten Etiketten und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 4 und Movie 3). Nile Red-positive sebaceous Drüsen wurden in den Isthmus Bereich der Haarfollikel (SB in 4C) beobachtet, was zeigt , dass die kubischen Protokoll nicht signifikant die Morphologie dieser fetthaltigen Strukturen beeinflussen. Unerwarteterweise Haarschäfte wurden auch mit Nile Red (HS in 4C) markiert.

Um die morphologischen Veränderungen in der Epidermis von YAP2-5SA-& Delta; C transgenen Mäusen, die eine hyperaktiv YAP mutierte Protein in Basalkeratinocyten 8, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp und YAP2-5SA-& Delta; C transgenen Mäusen littermate sichtbar wurden mit der geklärte und gefärbt Anti-K14 - Antikörper und Kerne wurden mit DAPI - Lösung (Abbildung 5 und Film 4 (Wildtyp) und Film - 5 (YAP2-5SA-& Delta; C)) gegengefärbt .

Im YAP2-5SA-& Delta; C transgenen Haut, die Hyperplasie der interfollikulären Epidermis (obere Doppelpfeile in 4F Figur 5F) angezeigt wird , um die vergrößerte Stammzellpopulationen darstellt, wie zuvor 8 beschrieben.

Abbildung 1
Abbildung 1: Herstellung der Imaging - Kammer. A: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) . B: zwei dünne Streifen blau tack vorbereitet (Durchmesser ca. 2 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser . C: Platz blau tack Streifen auf einem Deckglas, genügend Platz für die Hautbiopsie ermöglicht. Legen Sie die Hautbiopsie in einem Tropfen CUBIC2 Lösung zwischen den beiden Streifen . D: Platz zweites Deckglas auf blauem tack Streifen der Hautbiopsie zur Deckung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: K14 / DAPI Label - ing von Dorsalhaut in Telogen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumenrekonstruktion einer dorsalen Hautbiopsie in Telogen eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit einem K14 - Antikörper (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain. (blau in A, C). K14-Färbung ist stark in den interfollikulären Epidermis (IFE), Isthmus und die Talgdrüsen (schwarze Sternchen), und die sekundären Haar Keime (weiße Stern), und relativ niedrig in der Ausbuchtung Bereich (Bu). Maßstabsbalken 50 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Ki67 Kennzeichnung von Dorsalhaut in Telogen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumen - Rekonstruktionen von einer dorsalen Hautbiopsie eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit einem Ki67 - Antikörper (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain (blau in A, C). Proliferierende Ki67-positive Keratinocyten sind offensichtlich in der basalen Epidermis interfollikulären (IFE), und in dem Isthmus-Bereich (Is), aber nicht in die Ausbuchtung (Bu) des Telogens Haarfollikel. Maßstabsbalken 50 um.rget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Nil - Rot - Färbung der dorsale Haut in Anagen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumenrekonstruktion einer dorsalen Hautbiopsie in Anagen eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit Nile Red (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain (blau in. A, C). Nile Red-Färbung sichtbar in den Sebozyten (SB) und in den Haarschaft (HS). Maßstabsbalken 50 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5

Zahl5: Morphologische Abnormitäten in der YAP2-5SA-& Delta; C Epidermis 3D - Volumen - Rekonstruktionen von dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp (A - C) und YAP2-5SA-& Delta; C transgenen littermate Mäuse (D - F) mit einem K14 - Antikörper (rot markiert in. B, C, E, F) und DAPI Kern counterstain (blau in A, C, D, F). Die epidermale Hyperplasie der Epidermis YAP2-5SA-& Delta; C ist offensichtlich in den interfollikulären Epidermis (top Doppelpfeile in F) und in den Haarfollikeln, die die charakteristischen Stammzellen / Vorläuferzellmassen proximal anzuzeigen (untere Doppelpfeile in F) 8. Maßstabsbalken 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

Film 1
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Film 5

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Discussion

Die regulatorischen Mechanismen steuern Haut Entwicklung und Homöostase werden am häufigsten in 2D untersucht unter Verwendung von Gewebe Schnitte und histologischen Färbung oder die Markierung mit Antikörpern, die nur eine eingeschränkte Anerkennung der Hautmorphologie, Zellpopulationen oder Proteinexpression ermöglicht. Eine Anzahl von Verfahren wurden die Visualisierung der räumlichen Organisation von Zellen und Proteinen an Einzelzellauflösung in 3 Dimensionen in epidermal ganze Halterungen 10-13 zu verbessern entwickelt. Einige davon beinhalten jedoch eine Trennung der Epidermis von der Dermis, die insbesondere unter Verwendung von behaarter Haut technisch anspruchsvoll ist, und führt oft zu Gewebeschäden und Bruch der Haarfollikel. Auch Trennung der Epidermis und Dermis beeinträchtigt die zellulären und molekularen Wechselwirkungen zu studieren, die zwischen ihnen während der embryonalen Entwicklung und Gewebshomöostase auftreten.

Die "flache Halterung Ansatz" ist ein weiteres Verfahren, bei dem die gesamte Dicke der MausHaut wird seziert und immunhistochemisch und dann geklärt Alkohol (BBBA) unter Verwendung von Benzylbenzoat und Benzyl während Immunofluoreszenz Signale zu erhalten 14. Dieses Verfahren erfordert nicht die technisch anspruchsvolle Trennung der Epidermis von der Dermis. Jedoch ist BBBA hoch toxisch, es denaturiert einige fluoreszierende Proteine ​​und es verunreinigen Ziele Mikroskop, nicht für die hochauflösende Abbildung der Proben ermöglicht erforderlichen zellulären und molekularen Wechselwirkungen in dem Gewebe zu untersuchen.

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll 5-7 volle Dicke Maus Hautbiopsien von jedem gewünschten anatomischen Region und Alter zu klären , relativ sicher und kostengünstig unter Verwendung von Reagenzien. Dieses technisch einfaches Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression und Proliferation Muster durch Immunofluoreszenz in Hautbiopsien mit voller Dicke counterstained mit DAPI in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung und ermöglicht noch nie da gewesenen und hochgenaue qualitative Bewertung und Quantifizierung der Proteinexpression, Proliferation, Gewebemorphologie und Haarfollikel Dimensionen. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Darstellung von Sebozyten mittels Nile Red Färbung trotz der Entfernung von Gewebe Lipiden während der Klärungsverfahrens. Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist die Verfügbarkeit von Antikörper effizient Bindung und ermöglicht die Visualisierung der jeweiligen Zielproteine ​​Skin Klärungsverfahren. Darüber hinaus sind die erzeugten Bild und Filme Dateien groß und eine gute IT-Ressourcen wie Computer mit leistungsfähigen Prozessoren und einen großen Datenspeicherplatz sind unerlässlich.

Ein entscheidender Schritt in dem Verfahren ist die Herstellung der Hautbiopsien. An intakte Haarfollikel Anatomie, die Orientierung der Hautbiopsie visualisieren sollte berücksichtigt werden, und die Länge der Biopsien sollten parallel zur Richtung der Länge der Haarfollikel geschnitten werden. Darüber hinaus klein und sehr dünn Skin-Biopsien sind schwer richtig für die Mikroskopie zu montieren. Größere Biopsien mehr Zeit erfordert, zu löschen und Antikörper Eindringen Probleme entstehen können bei der Antigenerkennung Artefakte entstehen. Es ist daher ratsam, zu schneiden, klar und Flecken mehrere Biopsien pro Experiment.

Es ist auch wichtig zu eng die Rohre abzudichten, während die kubische Lösungen bereitet Verdampfung des Inhalts während des Erhitzungsprozesses zu verhindern, die in Reagenzkonzentrationen in Änderungen führt und möglicherweise beeinträchtigte Gewebe Clearing- verursachen. Der nächste wichtige Schritt ist, dass das Gewebe wird bei 37 ° C geklärt werden, um den Löschvorgang zu beschleunigen. Nach 7 Tagen muss die CUBIC1 Lösung, um die alten zu ersetzen frisch hergestellt werden.

In Zukunft werden mehr Antikörper identifiziert, die mit dem CUBIC Hautklärungsverfahren kompatibel sind, und Analysen können zur Visualisierung und Quantifizierung von epidermalen und Melanozyten (Stamm-) Zellmarker erweitert werdens und dermalen Proteinen. Diese Technik wird auch eine grundlegende Rolle bei der 3D-Studien der Haut Pathologie und Anatomie, und Hilfe bei der Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen zugrunde liegenden abnormen und normalen epidermalen Biologie in der Haut von mutierten Mäusen und transgenen Reporter Mausmodellen, einschließlich Signalisierung Wechselwirkungen zwischen Dermis spielen und die Epidermis.

Das CUBIC - Protokoll 5-7 ist wahrscheinlich auf die Haut von anderen Wirbeltiermodellen anwendbar zu sein, und für die menschliche Haut Stanzbiopsien. Lichtbogen-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von epidermalen Anatomie, Proteinexpressionsmuster, und das Fortschreiten der Haarfollikel Zyklusstadien, in größeren Hautproben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Wir danken australischen Bio-Ressourcen (Garvan Institute, Australien), die biologische Ressourcen Centre (UNSW Australien) und der Animal Care & Ethik-Kommission für die Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der National Health and Medical Research Council of Australia (Projektstipendium APP1062720) unterstützt. Dr. Cesar P. Canales ist Empfänger eines CONICYT-Becas Chile Stipendium (# 72101076). Herr Bassem Akladios ist ein Empfänger der Universität International Postgraduate Award von UNSW Australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich  P6418
Ethanol 96% (undenaturated) Chem-supply UN1170
Nile Red Sigma-Aldrich  72485-100MG
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Roche 10236276001
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether Merck Millipore 648462
Triton X-100 Merck Millipore 648462
Sucrose Sigma-Aldrich  S0389
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
anti-Keratin14 antibody Covance PRB-155P
anti-Ki67 antibody  Abcam ab16667
Donkey anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies A21207
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich  D2650
Urea Merck Millipore 66612
2,2′,2′’-nitrilotriethanol Merck Millipore 137002
Confocal Microscope Nikon Instruments Inc Nikon A1 - Confocal Microscope
cruZer6 Face Trimmer Braun Braun cruZer6 Face
Sodium azide Sigma-Aldrich  438456

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, (7130), 834-842 (2007).
  2. Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16, (5), 518-524 (2006).
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Comments

2 Comments

  1. Thanks for show me the protocol. It is an impressive protocol to study hair follicle and wound be useful to me.However I got a problem about placing a shaker in a 37 °C oven and I have to try it in another way.Can I just place the shaker at room temperature of near 20℃ for longer time?I wound appreciate any advice .

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2016 - 3:42 AM
  2. It might be ok to leave the samples at room temperature for a longer time on a shaker. We have not tried that yet, you can test this with some brain tissue which is easier to clarify than skin tissue. If that works, it should work for the skin tissue. Good luck with that.

    Reply
    Posted by: Huazheng L.
    November 23, 2016 - 5:12 PM

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