のpH依存性活性の検出
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
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Biochemistry

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Summary

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。

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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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Abstract

細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイ使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果得られたことを確認することが不可欠です。

このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびin vivoの方法説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを

Introduction

微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体1に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃(pH範囲1-4)、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件3の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。

ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ10 HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。

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Protocol

ペリプラズムHdeBの1発現および精製

注:HdeBはEに発現していました大腸菌細胞はプラスミドpTrc- hdeB 10、およびポリミキシン溶解時のペリプラズムから精製を保有。

  1. E.の一晩培養物を準備します200 / mlのアンピシリン(LB アンプ)を含有する 30ミリリットルのLB中でプラスミドpTrc- hdeB 10を保有する 大腸菌細胞。 LB アンプ 4つの1リットル培養物を接種し、0.7のOD 600nmまでに達するまで37℃、200rpmでそれらを成長させます。そして、HdeBの発現を誘導し、30℃の成長温度を低下させるために300μMのIPTGを加えます。
  2. 30℃でのタンパク質の発現の5時間後、4℃で5分間、8,000×gでの遠心分離によって細胞を回収。
  3. 100で細胞ペレットを4℃で5分間、8,000×gで再び細胞を(50 mMトリス/塩酸、50mMのNaCl、pH7.5)で遠心バッファmlの洗浄。
  4. その後、再懸濁80で細胞ペレットは、ML 1mg / mlのポリミキシン硫酸塩を含む、緩衝液。外膜の効率的な破壊のために、穏やかに4°Cで1時間サスペンションをかき混ぜます。
  5. 細胞質画分と細胞破片を除去し、4℃で15,000×gで20分間、懸濁液を遠心します。これは、可溶性HdeBを含む〜60ミリリットルの上清になります。
  6. 6 kDaのMWを持つ透析膜を用いて緩衝液B(20mMトリス/塩酸、0.5mMのEDTA、pH8.0)を150倍体積に対して一晩ペリプラズム抽出物を含む上清を透析カットオフ。 3キロダルトンの分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して、15 mlのタンパク質を濃縮します。 0.2μmの細孔フィルターを使用して、タンパク質溶液をフィルタリングします。
  7. 2.5ml /分の流速で5カラム容量の緩衝液Bで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム(カラム体積5ml)中にタンパク質を適用します。タンパク質をカラムにロードされると、10分のための緩衝液Bでカラムを洗浄します2.5ml /分の流速。 2.5ml /分6の流量で50分の期間にわたって緩衝液B中の0.5 M NaClの0からの直線勾配で溶出HdeB。
  8. 15%SDS-PAGEを使用してHdeBを含む画分を特定します。 5μlの5倍還元SDSローディング緩衝液と20μlのサンプルを混ぜます。負荷10μlのゲル上及びトリス - グリシン緩衝液(14.4グラム/ Lグリシン2.9グラム/ LのTris、を1g / Lのドデシル硫酸ナトリウム、pHが8.3)で実行します。ブロモフェノールバンドがゲル(〜45分)の底に近い移動するまで、150Vでゲルを実行します。
  9. プールのすべてのHdeB含有画分、4 L HdeB貯蔵緩衝液に対して4℃で一晩透析(50mMトリス/塩酸、200mMのNaCl、pH8.0)に、および分子量遠心分離フィルターユニットを用いて、約300μMにタンパク質を集中3キロダルトンのカットオフ。吸光係数εの280nmの = 15595 Mを使用して280nmでHdeBの濃度を決定-1 cm -1 。 100μlのアリコートとフラッシュフリーの準備液体窒素でアリコートをZE。
    注:HdeBは、少なくとも6ヶ月間-70℃で保存することができます。

2.シャペロン活性アッセイリンゴ酸脱水素をアンフォールディング熱の使用(MDH)

注:下記のように熱的に異なるpH値でのブタのミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)のアンフォールディングの凝集で精製HdeBの影響をモニターしました。リストされたすべてのタンパク質濃度は、モノマー濃度を参照してください。

  1. 、MDHを準備4 LバッファーC(50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5)に対して4℃で一晩MDHを透析し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約100μMにタンパク質を濃縮しますkDaの。
    注:MDHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されるようMDHの慎重な透析が必要となります。
  2. 凝集物を除去するために、4℃、20,000×gで20分間、タンパク質を遠心します。 ε(280nmでの吸光度によってMDH濃度を決定します<サブ> 280ナノメートル= 7,950 M -1 cm -1で)。 50μlのMDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。
  3. 温度制御サンプルホルダー、撹拌機を備えた蛍光分光光度計に1ミリリットルの石英キュベットを置きます。 350 nmのλEX /全角を設定します
  4. キュベットとセットに:(pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ)は、所望のpH値で予め温めた(43℃)緩衝液D(150 mMリン酸カリウム、150mMのNaCl)の適切なボリュームを追加します。 43℃にキュベットホルダーの温度。総容量1000μlです。
  5. 0.5μMMDHを添加し、バッファ12.5μMHdeB(またはバッファ制御用HdeB記憶バッファの代わりに同量)を加えます。光散乱の監視を開始。 MDHの展開十分可能にするために360秒間の反応をインキュベートします。
  6. 2 MバッファなしのK 2 HPO 4の0.16から0.34容量を追加することによって、pHを7に上げ、再続けます別の440秒間光散乱をコーディング。
  7. 中和後に定義された時点におけるシャペロンの非存在下で記録されたMDH凝集の程度を設定し、100%の(ここではMDHの最大光散乱が観察された500秒後)。各示されたpH値でHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号にHdeBの活動を正常化します。

分析超遠心(AUC)によるHdeB-LDH複合体形成の3検出

注:HdeB単独で又は熱的に乳酸脱水素酵素(LDH)の展開との複合体の沈降速度実験は、分析用超遠心を用いて行きました。

  1. 4 LバッファーC(50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5)に対して4℃で一晩LDHを透析、LDHを調製し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約200μmでタンパク質を濃縮しますkDaの。
    注:LDHの慎重な透析をLDとして必要とされていますHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されます。
  2. 骨材、4℃20,000×gで20分間遠心分離LDHを削除します。 280nmでの吸光度によってLDH濃度を測定(ε280nmで = 43680 M -1 cm -1 )。 50μlのLDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。
  3. 41℃で15分間(それぞれpHは4と7、)バッファーDで30μMHdeBの存在下および非存在下で3μMのLDHをインキュベートします。
    注:その完全な凝集のより高い温度の結果でLDHのインキュベーション、およびHdeBの無シャペロン効果を観察することができます。
  4. サンプルは室温まで冷却してみましょう。次に、標準的なセクターを含む細胞への負荷サンプルを1.2センチ路長と2チャンネルのセンターピースを形。超遠心分離機に細胞をロードし、前の沈降に少なくとも1時間、22℃に平衡化。
  5. 22°Cと12時間それぞれのローター中で167,000×gでスピンサンプル、SEDを監視連続して280 nmでのタンパク質のimentation。以前に実証されているように、各チャネルの透過光強度はなく吸光度より測定した場合、信号対雑音比が改善されます。これはまた、後続のデータフィッティングの品質を向上させます。
  6. 連続C(s)は分布モデル17を使用して、SEDFIT(バージョン15.01b、2015年12月)でのデータ分析を行います。 SEDFITを使用する方法を記述したチュートリアルでは、参照18で見つけることができます。
    1. 0.7 ME(最大エントロピー)正則の信頼レベルを設定します。
  7. SEDNTERP 19を使用して、バッファ密度だけでなく、粘度を計算します。凝集したクライアントタンパク質の量を推定するために、参照としてpH7にpHを4に沈降LDHの積分を比較します。
    注:沈降分布プロットの統合はSEDFITで直接行うことができます。沈降速度データを分析するための代替ソフトウェアは、最近のレビュー20に記載されています。</李>

HdeBの存在下での4モニタリングMDH不活性化と再活性化

注記:pHを展開MDHのリフォールディングで精製HdeBの影響を中和時MDH活性をモニターすることによって決定しました。

  1. 25μMHdeBの存在下または非存在下で37℃で1時間:(pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ)は、所望のpH値でバッファDで1μMMDHをインキュベートします。その後、10分間、20℃まで温度をシフトします。
    注:MDHは37℃より高い温度でインキュベートしたときにMDHのリフォールディングをもHdeBの存在下では観察されませんでした。
  2. 酸変性MDHのリフォールディングを開始するために、0.5 Mリン酸ナトリウム、pH8.0の0.13から0.42の体積の添加によってpH7に試料を中和します。
  3. 20℃で2時間インキュベートした後、340nmの9におけるNADHの減少をモニターすることによってMDH活性を決定します。
    注:MDHはL-リンゴにオキサロ酢酸のNADH依存性還元を触媒します。 アッセイ緩​​衝液950μL(50 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0、1mMのオキサロ酢酸、および150μMNADH)とのインキュベーション反応液50μlを混合します。
    注:アッセイ緩​​衝液中MDHの最終濃度は44 nMであるべきです。
  4. 20℃に設定し、ペルチェ温度制御ブロックを備えた分光光度計を用いて吸光度の変化を監視します。
  5. pHを7.0に維持してきた44 nMのネイティブMDHにMDH活性の相対を報告します。

E.上HdeB過剰発現の5効果酸ストレス下での大腸菌の生存

:E.大腸菌 MG1655のゲノムDNAは、公表されたプロトコル21を用いて単離しました。

  1. E.からhdeBを増幅プライマーhdeBを用いたPCRによるコリ MG1655 - のBamH I-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATTとhdeB - のEcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. 次のように50μl中のPCR反応を設定します:10μlの5×ポリメラーゼバッファー、ゲノムDNA MG1655、0.5μlのDNAポリメラーゼngを、200μMのdNTP、0.5μMのプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、150は、50μlにのddH 2 Oを追加します。
  3. ステップ1:以下のようhdeBの増幅を行い、95℃、1サイクルで5分。ステップ2:95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃、40サイクルで30秒間。ステップ3:72℃で10分間。
  4. 制限部位のクローニングのための標準的な方法を用いてプラスミドpBAD18のをEcoR IとのBamH I部位にPCR断片を得られたクローン。製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを精製します。シークエンス10によって得られたプラスミドを確認します。
  5. 、λ - - 、E14 - 、[araD139] B / R [F:株BB7224(ΔrpoH)(遺伝子型にHdeBまたは空ベクター対照pBAD18を発現するプラスミドをトランスフォーム6;(ARGF-LAC)169 flhD5301Δ(fruK-yeiR)725(fruA25)relA1 rpsL150(SM R)rbsR22Δ(fimB-FIME)632(:: IS1)ptsF25 zhf :: Tnの10(TC S)suhX401 deoC1 araDを + rpoH ::館 +; 16)化学的コンピテント細胞を用いました。
    注:この株は温度感受性です。
  6. 45秒42℃で熱ショック前めっきした後、30℃、200 rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを実行し、30℃で一晩インキュベートします。 50ミリリットルのLB アンプで一晩培養を準備し、200rpmで、30℃で細胞を培養。
  7. 一晩培養物を25 mlのLB アンプに40倍に希釈し、HdeBタンパク質発現を誘導するために30℃、ODを600nmで 200 RPM = 1.0で0.5%アラビノース(ARA)の存在下で細菌を増殖します。
  8. pHシフトの実験のために、LBを使用アンプ+アラ0.5のOD 600nmまでに細胞を希釈し、(ここではpHは2.0、pHが3.0、およびpH 4.0)それぞれのpH値に調整して5 M HClを適切なボリュームを追加することによって。
  9. 示された時点(; pHは3、2.5分; pHは2、1分pHは4、30分)した後、5 M NaOHを適切な容量の添加により培養液を中和します。
  10. OD測定値を用いて30℃で12時間培養液中の中和培養物の増殖を監視します。

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Representative Results

HdeAとHdeBは、E相同であります酸ストレス条件10に対してペリプラズムタンパク質を保護することが知られている大腸菌タンパク質。私たちの仕事は、HdeAと同様に、HdeBはまた、分子シャペロンを活性化酸として機能することを明らかにしました。しかし、まだ潜在的に殺菌が、HdeA 6,9,10,22の最適pHよりも有意に高いpHでHdeA、HdeB機能とは対照的です。 インビトロで HdeBのシャペロン活性の最適pHを調べるために、天然のMDHはHdeBの存在下または非存在下で示されたpH値の予め温めた(43℃)緩衝液中に希釈しました。インキュベーションの360秒後、インキュベーション反応を中和しました。この中和は、43℃で9でMDHの凝集を誘発します。代表的な結果がHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号が原因MDHの凝集に中和時に劇的に増加させることを示している( 図1、BL各pHにおけるACKライ​​ン)。 HdeBの存在下では、光散乱信号が有意HdeBはMDH( 図1、pHが4およびpH 5)の凝集を防止することを示すpHを4またはpH 5から中和の際に減少します。対照的に、しかし、pHが2およびpH 3から中和の際に、MDHは急速HdeBのシャペロン活性のための最適pHであることを示す、HdeB( 図1、pHが2およびPH 3)の存在または非存在とは無関係に同程度に凝集しますpHが4と5との間HdeB記憶バッファは、pH 4でHdeBの存在下で、MDHの低下光散乱信号は、そのシャペロン機能であることを示す、MDH凝集( 図1、バッファ制御)に影響を及ぼしませんでした。 HdeAは、pH 2-3でそのモノマーと折り畳まれていない形態の活性シャペロンが、4〜10のpHで、または上には活性を示していない。これらの結果は、HdeBは、pHが4〜10の周りにその最適シャペロン活性を有することを示唆しています。

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図1:酸性pHでHdeBのシャペロン活性 0.5μMMDHは43℃で360秒間、12.5μMHdeBの存在下または非存在下で指示されたpHで予熱したバッファーD中でインキュベートしました。試料のpHは、次いで0.16から0.34体積2 MバッファなしK 2 HPO 4を加えることによって(アスタリスクで示される)pHを7に上昇させ、MDH凝集は350 nmでの光散乱を監視することによって、追加の440秒間測定しました。中性pH(ブルーバック)。図は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されたダール 10 .Thisの研究から変更されています。ダールJU、コルデバイP、サーモンL、ホロヴィッツS、Bardwell JC、細菌中の酸保護シャペロンとしてヤコブU. HdeB機能。 J BIOL CHEM。 2015年、290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。S / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

HdeBはまた、他のクライアントタンパク質と安定な複合体を形成するかどうかを対処するために、3μMのLDHは、異なるpH条件での30μMHdeBの存在下または非存在下で41℃で熱アンフォールディングしました。分析用超遠心分離によってこれらの試料の沈降挙動の分析は22℃で行いました。 LDHとHdeBをpH 7および41℃で一緒に培養したときに、LDHは、排他的に四量体(120キロダルトンの分子量)のままであり、HdeBは、二量体のままでした。これらの結果は、タンパク質はpH7で安定な錯体を形成しないことを示し、およびLDHは、41°C( 図2、緑色の線)で20分間のインキュベーションの際にオリゴマーの任意の不可逆的な変化を受けません。同様に、HdeBは示して、41℃、pH4.0のインキュベーション時の二量体残った低pHインキュベーションHdeBの均一な熱ショック条件( 図2、赤線)の下で、そのオリゴマー化状態に影響を与えることはありません。急速に最初のスキャンが記録される前にLDHの40%が沈殿するという事実によって示される(右上隅に記載されている図2)として集約HdeBの非存在下でpHが4と41℃でインキュベートしたLDH。残りのLDHは、単量体( 図2、青い線)として主に沈降するように見えました。これとは対照的に、pHが4と41℃でのLDHとHdeBのインキュベーションは、134キロダルトンの分子量を有する新しい種を形成する、二つのタンパク質の共沈殿物(HdeB-LDHのC)の大部分を引き起こしました。この種はおそらくHdeB二量体および熱的に展開LDHとの間の複合体を表します。また、HdeBの存在下で、前の沈降に有意なLDH凝集は、我々のインビトロでの凝集の測定と一致しており、観察されませんでした。これらの結果は、HdeBがでシャペロン活性を示すことを示していますpH4.0で二量体形態。これは、そのモノマー形態の活性シャペロンさHdeA、とは全く対照的です。それはpHを4とpH7の間に構造的な再編成を受けることができますHdeBの非常に動的な性質は、HdeBのシャペロン機能10の活性化のための可能性は十分です。

図2
図2:分析超遠心することによりpHを4にHdeBと折り畳まれていないLDHとの間の複合体形成の検出 3μMのLDHは、15分間のバッファーD(150mMのKHPO 4、150mMのNaCl)の10モル過剰HdeBの存在下でインキュベートしました pHが7(緑線)またはpH 4(黒線)のいずれかで41℃で。比較のために、単独で単独LDH(青色線)またはHdeB(赤線)分析超遠心分離沈降速度をHdeB、LDHの化学量論、およびHdeB間に形成された複合体を決定するために使用されたpHが4で41℃で15分間インキュベートしました。そしてDIFでのLDHferent pH条件。 (右上隅に述べたように)pHが4で、かつHdeBの非存在下でインキュベートしたときに最初のスキャンの前に凝集している〜40%のLDHに注意してください。沈降係数の分布プロットが示されている(C(S))プログラムSEDFITを用いて分析しました。手紙はそれぞれ、LDHまたはHdeBのそれぞれのオリゴマー状態を示しますHdeB D、HdeBダイマー; LDH M、LDHモノマー、LDH T、LDH四量体; HdeB-LDH C、HdeB-LDH複合体。図は、ダール 10から変更されています。この研究は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ダールJU、コルデバイP、サーモンL、ホロヴィッツS、Bardwell JC、細菌中の酸保護シャペロンとしてヤコブU. HdeB機能。 J BIOL CHEM。 2015年、290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。生化学・分子生物学のための著作権アメリカの社会。 より大きな版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のシオン。

HdeBは、中和時にクライアントタンパク質のリフォールディングをサポートしているかどうかをテストするには、pH非変性MDHのリフォールディングにHdeBの影響を分析しました。熱変性MDHはHdeBの存在下または非存在下における異なるpH値でインキュベートしました。低pHのインキュベーション後、pHを(MDHのリフォールディングを開始する)中和し、MDH活性は2時間後に測定しました。 図3に示すよう 、MDHの有意な活性化はHdeBの存在下でpHを4から中和の際に達成されました。 HdeBが低pHインキュベーションから存在しなかったときにMDH活性が決定されませんでした。

図3
図3:HdeBは、酵素的に活性な状態に酸変性MDHのリフォールディングを促進する 1μMMDHが不在またはpで、37℃で1時間、指示されたpHでバッファーD中でインキュベートしました25μMHdeBのresence。サンプルは、0.5MのNa 2 HPO 4の添加によりpH7に中和した前に、温度を10分間20℃にシフトしました。アリコートを、20℃でのインキュベーションの2時間後に採取し、MDH活性についてアッセイしました。不在(白いバー)またはHdeB(黒棒)の存在下での中和の際にMDH活性が示されています。少なくとも3つの独立した測定から得られた標準偏差が示されています。図は、ダール 10から変更されています。この研究は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ダールJU、コルデバイP、サーモンL、ホロヴィッツS、Bardwell JC、細菌中の酸保護シャペロンとしてヤコブU. HdeB機能。 J BIOL CHEM。 2015年、290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。

我々のインビトロデータはHdeBは、pH4の異なるモデルクライアントタンパク質に結合するそれらの凝集を防止し、一度中性pH条件が復元されたリフォールディングクライアントを促進することを明らかにしました。 インビボで HdeBの効果を調査するために、pH依存性生存アッセイは、温度感受性rpoH欠失菌株を用いて行きました。この株は、ほとんどのシャペロンを欠いているため、高温、低pHや酸化ストレス15の影響を受けやすくなります。中性pH条件下でのHdeBの過剰発現は、空のベクターpBAD18( 図4、未処理)を保有する対照株と同等によく成長した株の増殖率には影響を示さなかった対照的に、我々はする能力に明らかな違いを発見しました低pHのトリートメントルームから再現性に改善の回復を示すHdeB過剰発現株でpH 3またはpH 4の治療の際に成長を再開対照株よりもtment。私たちのin vitroのデータとは対照的に、しかし、HdeBの存在は、これがあってもpHで二量体に向かってHdeBのオリゴマー化状態をシフトする可能性があり、細胞内HdeBの高濃度、に問題がある可能性がありpHが3にも大幅に保護効果を持っていました細胞はどこpHが4 9,10,22でインキュベートした場合、有意な殺害は認められなかったpHが2またはpH 3へ移行する細胞は、非常に速く、非常に有毒な効果をもたらしたこと3.注意。

図4
図4:HdeBはE.を保護酸性pH。HdeB(赤丸) に対する大腸菌を 30℃で0.5%アラビノースの存在下でBB7224(ΔrpoH)で過剰発現させました。空のベクターpBAD18を保有BB7224細胞を対照(黒丸)として使用しました。左上のパネルには、両方の目の成長を示しています30℃で雨、pHを7細胞を(右上のパネル)、5MのHClを添加することによって示されるpHにシフトし、pHを2で1分間インキュベートし、pHが3(左下のパネル)、または、30分で2.5分pHが4(右下のパネル)。その後、培養物を、5MのNaOHの適切な量を添加することによって中和し、成長は30℃で液体培地中でモニターしました。図は、ダール 10から変更されています。この研究は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ダールJU、コルデバイP、サーモンL、ホロヴィッツS、Bardwell JC、細菌中の酸保護シャペロンとしてヤコブU. HdeB機能。 J BIOL CHEM。 2015年、290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い上方調節発現を可能にします大腸菌株。この局面は、rpoH欠損株を利用した酸ストレス条件下でHdeBのin vivo過剰発現研究のために特に関連しています。この株は、シャペロンのほとんどを欠いているため、高温、低pHおよび酸化ストレス15を含む様々なストレス要因、に対してより敏感です。代替として、本明細書に提示したものと類似した生存研究は、目的の遺伝子を欠く変異株で行うことができます。

T ">任意のシャペロン活性のための実験設計またはリフォールディングアッセイは、クライアントのタイプ、クライアントタンパク質の濃度およびバッファー条件に関しての両方で、慎重に考慮しなければならない。ような典型的なシャペロンアッセイ、モデルクライアントタンパク質でクエン酸シンターゼ、ルシフェラーゼ、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、尿素またはグアニジン-HClの高濃度で変性させ、そして凝集23,13を誘導するために、変性剤を含まない緩衝液中に希釈する。シャペロンの存在下での測定は、それらがタンパク質凝集を防ぐ程度を明らかにする。あるいは、クライアントは、熱アンフォールディングおよびタンパク質凝集は、どちらの場合も、光散乱測定は、タンパク質凝集の読み出しとして使用される。監視されている。アクティブなシャペロン、それにより、光散乱信号6の減少を引き起こし、クライアントタンパク質のアンフォールディングの凝集を防止する。両これらの実験のセットアップの低pHインキュベーションと組み合わせることができる。また、モルを評価します特定のクライアントタンパク質の凝集を防止する能力を監視することによってecularシャペロン活性は、非ストレス状態に戻る際に、クライアントリフォールディングのシャペロンの影響は、24をテストすることができます。クライアントタンパク質は、それらの不活性化および再活性化のための定量的な読み出しとして使用することができる酵素活性を有する場合、これは特に簡単です。シャペロン介在性のリフォールディングが自然ATP依存性プロセスであるが、このようなHdeA、HdeBやスパイなどのペリプラズムシャペロンがペリプラズム9,25のエネルギーの欠如と一致ATPに依存しない方法でリフォールディングクライアントを促進することが示されています。

このようなHdeBなどの酸保護シャペロンの最適pHを研究することは様々な理由により困難である。このようなクエン酸シンターゼなどであっても十分に確立されたシャペロン - クライアントタンパク質の(I)の凝集挙動は、酸性pHで異なります。および(ii)は、いくつかの緩衝系は、2-5の間のpH範囲内で動作しているスイ関心のシャペロンおよびクライアント蛋白質の両方のためのテーブル。我々は、これは、酸性pH条件下での非理想的な緩衝系であることを認識しているものの、リン酸緩衝液を使用することを決めました。しかし、リン酸緩衝液は、酸活性化シャペロン9,22としてHdeAを特徴付けるために十分に適していることが見出されました。凝集測定は、温度やバッファ内容の変化に対して非常に敏感です。偽陽性の結果を排除するために、我々は、したがって、常にクライアントの凝集に対するシャペロン記憶バッファ( 図1、バッファ制御)の影響をテストすることをお勧めします。時には、クライアントタンパク質の凝集があっても最高のシャペロンは、凝集過程と競合することができるではないかもしれないことを非常に速く起こります。最適なアッセイ条件を見つけるために予備試験を行うことが不可欠です。このような状況のための良い例は、> 42℃の温度でのLDHのインキュベーションが非常に高速であり、当社の超遠心分離実験に与えてもいますHdeBの過剰の存在は、LDHの凝集を防ぐことはできません。また、シャペロン/コシャペロン比またはシャペロン/クライアント比を注意深く23決定されなければなりません。予備実験では1、それはHdeBのシャペロン活性のための最適pHとしてpHが4を識別するで私たちを助け:50のMDH比を:私たちはかなり高いHdeBを使用し始めました。最も効果的な比率であることが1:25を識別し、pHが4で1:1と50:1の間MDH比:私たちは、その後、HdeBを分析し続けました。これとは対照的に、HdeAは10としてMDH凝集を抑制:1シャペロン:クライアント比6,9,10,22を 。クライアント比が完全MDH凝集を抑制するのに十分であった。したがって、我々はHdeAは、HdeBと比較して、より低いシャペロンとしてMDHの凝集を抑制することで、より効果的であると結論します。タンパク質凝集のシャペロン媒介性抑制を調べるための別のアプローチは、クライアント凝集体を遠心分離により除去し、SDS PAGEによって定量化されたスピンダウンアッセイを含みます。このアプローチは、Mに適していますin vivoでのタンパク質凝集に対するシャペロンの影響をonitoring。どちらかが過剰発現または関心のシャペロンを欠く変異株は、タンパク質アンフォールディングストレス条件に暴露されます。その後、細胞を溶解し、可溶性凝集画分を分離し、15,16,26を定量します。

クライアントシャペロン複合体の検出のために、我々は、分析超遠心分離を適用しました。両方のタンパク質は、280nmで吸収するように、直接、この複合体に結合しHdeB及びLDHの単量体の量を定量することは不可能である実験に基づくことに留意しなければなりません。所望であれば、シャペロンクライアント複合体の化学量論は、別々に励起最大可視範囲内にある発色団とシャペロンおよびクライアントタンパク質を標識することによって決定することができます。あるいは、複合体中のシャペロンに対するクライアントの化学量論は、定量的ウェスタンブロットを用いて結合されたネイティブPAGEを用いて決定することができます。 ここで紹介するプロトコルに従うことにより、我々は2分子シャペロン、HdeA、およびHdeB 9,10,22を特徴付けることができました。一般に、これらのアッセイはまた、in vitroおよびin vivoでのタンパク質リフォールディングにおける分子シャペロンの潜在的阻害剤の役割を調べるために使用することができ、酸ストレスクライアント凝集を防止する能力について、合成シャペロンをテストするために適用することができます。また、ここに示されたプロトコルは、それらの活性化のメカニズムに光を当てるために点変異および/または酸活性化シャペロンの切断変異体の分析のために使用することができます。

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Acknowledgements

私たちは、シャペロンアッセイの彼女の有益な助言のために博士クラウディアCremersに感謝します。ケン・ワンはHdeB精製における彼の技術支援のために認められています。この作品は、ドイツ研究財団(DFG)が提供するポスドク研究フェローシップでサポートされている(航空局へ)ハワード・ヒューズ医学研究所と航空局とUJJ-UDへの健康助成金RO1 GM102829の国立研究所によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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