दुनिया भर में कृषि कीट कीट में भ्रूण Microinjection के माध्यम से न्यूक्लिक एसिड की डिलिवरी,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
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Genetics

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Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

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Abstract

भूमध्य फल मक्खी (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) अत्यंत उच्च कृषि प्रासंगिकता के साथ एक कीट प्रजातियों है। यह अपनी प्रजनन व्यवहार की वजह से है: महिलाओं के फलों और सब्जियों की बाहरी सतह को नुकसान पहुंचा है, जब वे अंडे और उनके लुगदी पर रची लार्वा फ़ीड लेट गई। जंगली सी capitata आबादी परंपरागत रूप से छिड़काव और / या पर्यावरण के अनुकूल दृष्टिकोण, सबसे सफल बाँझ कीट तकनीक (एसआईटी) से किया जा रहा कीटनाशक के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं। एसआईटी जन-पालन, विकिरण आधारित नसबंदी और पुरुषों है कि दोस्त के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने, लेकिन उपजाऊ संतान उत्पन्न करने में सक्षम नहीं हैं के क्षेत्र रिलीज पर निर्भर करता है। आगमन और जैव प्रौद्योगिकी के उपकरणों के तेजी से विकास के बाद, एक साथ medfly जीनोम अनुक्रम की उपलब्धता के साथ, बहुत इस प्रजाति के जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया गया है। इस जीनोम हेरफेर, जो कैरियर के लिए नई रणनीति के प्रसार इष्टn जनसंख्या नियंत्रण के लिए लागू किया जा सकता है।

इस संदर्भ में, भ्रूण microinjection medfly नियंत्रण के लिए उपकरण बॉक्स के विस्तार में एक दोहरी भूमिका निभाता है। जीन है कि कुंजी जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के समारोह के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता है, वास्तव में, आणविक मशीनरी medfly invasiveness अंतर्निहित के बारे में हमारी समझ बढ़ती है। इसके अलावा, रोगाणु लाइन परिवर्तन को प्राप्त करने की क्षमता कई ट्रांसजेनिक उपभेदों कि उपन्यास एसआईटी सेटिंग्स में भविष्य क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए परीक्षण किया जा सकता है के उत्पादन की सुविधा। दरअसल, आनुवंशिक हेरफेर वांछनीय लक्षण है कि, उदाहरण के लिए, क्षेत्र में बाँझ नर प्रदर्शन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या कि प्रारंभिक जीवन में मंच मारक हो सकती है। यहाँ हम medfly भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड microinject करने के लिए इन दो मुख्य लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन।

Introduction

भूमध्य फल मक्खी (medfly) Ceratitis capitata एक सर्वदेशीय प्रजाति है कि बड़े पैमाने पर नुकसान फलों और फसलों की खेती है। यह Tephritidae परिवार है, जो इस तरह के पीढ़ी Bactrocera और Anastrepha से संबंधित उन के रूप में कई कीट प्रजातियों में शामिल हैं, के अंतर्गत आता है। Medfly इस परिवार के सबसे अधिक अध्ययन प्रजाति है, और यह एक मॉडल न केवल कीट हमलों 1 के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी कीट प्रबंधन रणनीति 2 के अनुकूलन के लिए बन गया है।

Medfly एक multivoltine प्रजाति है कि जंगली के 300 से अधिक प्रजातियों और पौधों की खेती 3,4 पर हमला कर सकते है। नुकसान दोनों वयस्क और लार्वा चरणों के कारण होता है: mated महिलाओं oviposition के लिए फल की सतह पियर्स, सूक्ष्मजीवों उनके व्यावसायिक गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए अनुमति देता है, जबकि फलों के गूदे पर लार्वा फ़ीड। तीन लार्वा चरणों के बाद, लार्वा मेजबान से उभरने और मिट्टी में पोटा बना जाना। Ceratitiscapitata अफ्रीका, मध्य पूर्व, पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया, मध्य और दक्षिण अमेरिका, यूरोप, और संयुक्त राज्य अमेरिका के 5 क्षेत्रों सहित लगभग एक दुनिया भर में वितरण, प्रदर्शित करता है।

सबसे आम रणनीतियों medfly infestations कीटनाशकों के इस्तेमाल को शामिल सीमित करने (जैसे, मेलाथियान, spinosad) और पर्यावरण के अनुकूल बाँझ कीट तकनीक (एसआईटी) 6। बाद दृष्टिकोण विकिरण ionizing के लिए जोखिम के बाँझ प्रदान की गई पुरुषों के हजारों की सैकड़ों की जंगली में रिलीज करना शामिल है। जंगली महिलाओं के लिए इस तरह निष्फल पुरुषों के संभोग कोई संतान में यह परिणाम है, जनसंख्या के आकार में कमी के कारण, अंततः उन्मूलन के लिए अग्रणी। हालांकि एसआईटी दुनिया भर में कई अभियानों में प्रभावी साबित कर दी है, उसके प्रमुख कमियां पालन और कीड़ों के लाखों लोगों की स्टरलाइज़ रिलीज होने के लिए की उच्च लागत शामिल हैं। जारी किया गया व्यक्तियों का अंकन जंगली कीड़ों के दौरान क्षेत्र में कब्जा से बाँझ भेद करने के लिए आवश्यक हैगतिविधियों की निगरानी और यह वर्तमान में फ्लोरोसेंट पाउडर का उपयोग कर हासिल की है। इन प्रक्रियाओं महंगी हैं और अवांछनीय दुष्प्रभाव 7 लोगों की है।

आदेश का अनुकूलन और / या इस कीट के नियंत्रण के लिए और अधिक प्रभावी तरीकों को विकसित करने के लिए, medfly जीव विज्ञान और आनुवंशिकी व्यापक रूप से दुनिया भर में कई शोधकर्ताओं ने पता लगाया गया है। Medfly जीनोम अनुक्रम 8,9 की उपलब्धता, जीन कार्यों पर उपन्यास जांच की सुविधा होगी। शाही सेना के हस्तक्षेप इस तरह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और यह dsRNA (डबल असहाय आरएनए) या siRNA (छोटे दखल आरएनए) के microinjection के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इस तकनीक उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया गया है, को दिखाना है कि सी में लिंग निर्धारण आणविक झरना capitata केवल आंशिक रूप से ड्रोसोफिला 10 की है कि सम्मान के साथ संरक्षित है।

प्रोटोकॉल के विकास medfly भ्रूण सी अनुमति microinject करने के लिए capitata पहली गैर होना करने के लिए-Drosophilid मक्खी प्रजातियों आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जाना है। अपने अंडे दोनों आकृति विज्ञान और प्रतिरोध के मामले में, ड्रोसोफिला के उन लोगों के लिए समान हैं के रूप में 11 सुखाना करने के लिए, प्रोटोकॉल पूर्व blastoderm भ्रूण पहले डी के लिए विकसित में प्लास्मिड डीएनए वितरित करने के लिए मेलानोगास्टर 12,13 शुरू में सी में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था capitata। ये पहली प्रयोगों medfly रोगाणु लाइन transposable तत्व Minos 11 के आधार पर परिवर्तन की अनुमति दी। बाद में, मूल प्रणाली 14 संशोधित किया गया था अन्य transposon आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर। इस Lepidoptera Trichoplusia नी 15 से piggyBac का मामला है। प्रोटोकॉल के बाद आगे अनुकूलित किया गया है और यह अन्य प्रजातियों tephritid 16-21 के परिवर्तन और कई अन्य Diptera 22-31 की भी अनुमति दी है। इन सभी प्रणालियों एक ठेठ द्विआधारी वेक्टर / सहायक प्लाज्मिड परिवर्तन प्रणाली के उपयोग पर निर्भर: कृत्रिम, दोषपूर्ण परिवहनवांछित जीन युक्त बेटों प्लास्मिड डीएनए में इकट्ठे हुए और Transposase एंजाइम 32 की आपूर्ति से कीट के जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं। ट्रांसजेनिक medfly लाइनों की संख्या, उत्पन्न किया गया है एक सशर्त प्रमुख घातक जीन है कि मारक लाती ले जाने उपभेदों सहित कई सुविधाओं के साथ, पुरुष ही संतान उत्पादन तनाव और इस तरह अतिरिक्त sexing रणनीतियों की आवश्यकता नहीं है, और फ्लोरोसेंट शुक्राणु के साथ तनाव, सटीकता को बढ़ाने सकता है जो एसआईटी की निगरानी चरण 33-37 की। हालांकि ट्रांसजेनिक जीवों के जंगलों में रिलीज मच्छरों केवल 38,39 के खिलाफ पायलट परीक्षण में हुई है, कम से कम एक कंपनी क्षेत्र 40 में उनके उपयोग के लिए ट्रांसजेनिक medfly उपभेदों के एक नंबर का मूल्यांकन है।

भ्रूण microinjection भी इस तरह के प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता के रूप में नए जीनोम संपादन उपकरण के विकास सीआर के पक्ष में जा सकता है (आईएसपीआर) / CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 nuclease (Cas9) और घर वापस आना endonucleases जीन (HEGs) है, जो उपन्यास विकासवादी और विकास अध्ययन सक्षम हो जाएगा, साथ ही उपलब्ध जैव प्रौद्योगिकी उपकरण बॉक्स का विस्तार। जीनोम संपादन दृष्टिकोण पहले ही मच्छरों 41 में जीन-ड्राइव सिस्टम की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है, और medfly को उनके स्थानांतरण आसन्न है। यहाँ हम medfly भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड होता है जो सब से ऊपर उल्लेख किया अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है microinjecting के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल का वर्णन।

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Protocol

1. प्रयोगात्मक सेट अप

  1. insectary आवश्यकताओं
    1. सभी सी बनाए रखें capitata जीवन 25 डिग्री सेल्सियस, 65% नमी और 12/12 घंटा / प्रकाश अंधेरे फोटो पीरियड में चरणों।
    2. एक 6 एल पिंजरे में 1,500-2,000 के बारे में medfly pupae रखें। काफी छोटा oviposition 42 प्रोत्साहित करने के लिए छेद के साथ एक तरफ जाल एक पीतल के साथ एक पिंजरे का प्रयोग करें। केशिका क्रिया के माध्यम से पानी के साथ मक्खियों प्रदान करने के लिए पिंजरे के आधार में एक छोटे से खोलने के माध्यम से एक स्पंज पट्टी डालें। खमीर और चीनी (1:10) वयस्कों (चित्रा 1 ए) के लिए खाद्य स्रोत के रूप का एक मिश्रण का प्रयोग करें। खमीर की मात्रा में वृद्धि (अप करने के लिए 1: 3, खमीर: चीनी) महिलाओं अंडे देना विफल करना चाहिए।
    3. एक प्लेट पिंजरे के नीचे पानी से भर अंडे जाल के माध्यम से जमा इकट्ठा करने के लिए रखें। कुंवारी महिलाओं oviposit सकते हैं, जब तक प्रतीक्षा करें मक्खियों microinjection प्रयोगों के लिए अंडे इकट्ठा करने से पहले कम से कम 6-7 दिन पुराने हैं। इससे यह सुनिश्चित होगा कि महिलाओं mated किया जाएगाऔर अंडे निषेचित किया होगा।
    4. ठीक एक शुद्ध झरनी के साथ पानी को छान कर अंडे ले लीजिए। एक प्लास्टिक के डिब्बे में छलनी से अंडे स्थानांतरण मानक लार्वा भोजन (1.5 एलएच 2 हे, 100 मिलीलीटर एचसीएल 1%, जिसमें 5 ग्राम व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी एजेंट 50 मिलीलीटर इथेनॉल में भंग, 400 ग्राम चीनी, 175 ग्राम के Demineralized शराब बनानेवाला है खमीर, 1 मुलायम गेहूं की भूसी केजी) एक पाश्चर विंदुक का उपयोग।
    5. एक पारदर्शी एक शुद्ध ढक्कन के साथ बंद कंटेनर में प्रत्येक बॉक्स की जगह हवा परिसंचरण अनुमति देने के लिए और चोकर की एक परत युक्त pupation (चित्रा 1 बी) के पक्ष में।
    6. के बारे में 10 दिनों के बाद, 3 instar लार्वा कि लार्वा भोजन से उभरने और pupation के लिए चोकर परत में नीचे कूद के लिए जाँच करें।
    7. 24 घंटा बाद में, एक नरम ब्रश का उपयोग कर एक छोटे कप में pupae को इकट्ठा करने और उन्हें एक नया वयस्क पिंजरे के लिए स्थानांतरण। वयस्क सामान्य रूप से 10 दिनों के बाद पोटा बनना उभरेगा। उभरते मक्खी ptilinum, एक inflatable वें ऊपर अपने सिर पर स्थित जेब का उपयोग करता हैएंटीना के ई का आधार है, puparium के अंत में बंद करने के लिए मजबूर। उद्भव के बाद, ptilinum स्थायी रूप से वापस सिर के अंदर गिर।
  2. Microinjected लार्वा के लिए 1 एल भोजन की तैयारी
    1. 300 मिलीलीटर एच 2 ओ में 2.5 ग्राम अगर भंग
    2. गर्म 500 मिलीलीटर एच 2 ओ एक गर्म सरगर्मी प्लेट पर और 4 ग्राम सोडियम Benzoate भंग, 4.5 मिलीग्राम 37% एचसीएल, 42 ग्राम खमीर निकालने और 115 ग्राम सूखे चूर्ण गाजर पाउडर।
    3. मिश्रण करने के लिए 10 मिलीलीटर पूर्ण इथेनॉल में भंग 2.86 छ व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी एजेंट का एक समाधान जोड़ें।
    4. 15 सेमी पेट्री डिश दौर में मध्यम बांटो और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। यदि आवश्यक हो, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. स्लाइड तैयारी
    1. दो तरफा टेप का एक 2 सेमी पट्टी एक खुर्दबीन स्लाइड (75 x 26 मिमी 2) पर रखें और एक चीन मार्कर के साथ किनारों के निशान, तेल फैल गया और इंजेक्शन भ्रूण के फलस्वरूप सुखाना रोकने के लिए।
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर 34 प्लास्मिड डीएनए अलग। इथेनॉल का उपयोग प्लाज्मिड वेग और वांछित एकाग्रता में इंजेक्शन बफर (0.1 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 7.4, 5 मिमी KCl) में फिर से निलंबित।
  5. लंबे dsRNA synthetized फिनोल के क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर इन विट्रो में शुद्ध, isopropanol का उपयोग कर वेग और इंजेक्शन बफर 43 में फिर से निलंबित।

2. भ्रूण तैयारी

  1. एक ट्रे एक पिंजरे 6-7 दिन पुराने वयस्कों युक्त तहत पानी से भर रखें।
  2. महिलाओं के 30 मिनट के लिए और फिर oviposit एक ठीक छलनी का उपयोग कर पानी को छान कर भ्रूण को इकट्ठा करने की अनुमति दें। हमेशा पानी में झरनी रखने के भ्रूण की सुखाना से बचने के लिए।
  3. एक वाणिज्यिक 50% ब्लीच समाधान में 5 सेकंड के लिए झरनी immerging द्वारा भ्रूण Dechorionate।
  4. बार बार (स्वच्छ ultrapure पानी में झरनी immerging कम से कम द्वारा ध्यान से भ्रूण धो4-5 बार)। अंत में, स्वच्छ ultrapure पानी में झरनी जगह है। अधिकतम 2 घंटा के भीतर भ्रूण का प्रयोग करें।
    नोट: microinjection के समय आवश्यकता cellularization करने से पहले परमाणु डिवीजनों में से एक चरण के दौरान, पूर्व blastoderm भ्रूण में इंजेक्षन करने से संबंधित है। यह इंजेक्शन डीएनए लिया-अप करने के लिए किया जा नाभिक में, विशेष रूप से मौलिक रोगाणु सेल नाभिक कि युग्मक उत्पन्न करेंगे में अनुमति देता है। ड्रोसोफिला में, ध्रुव कोशिकाओं पर cellularization, निषेचन के बाद लगभग 90 मिनट पर शुरू होता है (25 डिग्री सेल्सियस), blastoderm गठन के बारे में 30 मिनट के बाद में 44 से होने वाली साथ medfly cellularization में 9 और 12 घंटा 45,46 के बीच होता है, जबकि।
  5. पंक्तियों में भ्रूण की ओर रुख
    1. ठीक एक तूलिका का उपयोग करना, के बारे में 50 भ्रूण को इकट्ठा करने और काले फिल्टर पेपर पानी से लथपथ की एक डिस्क पर उन्हें जगह है।
    2. एक विदारक stereomicroscope के तहत, पर दो तरफा टेप की ऊपरी सतह पर एक पंक्ति में भ्रूण की व्यवस्थाखुर्दबीन स्लाइड ठीक एक तूलिका (000) का उपयोग (चित्रा 1 सी)।
      नोट: सभी एक ही ओरिएंटेशन में भ्रूण संरेखित के रूप में इंजेक्शन पीछे ध्रुव, जहां रोगाणु लाइन ही शुरू होगा में किया जाता है; पीछे ध्रुव micropyle क्षेत्र के विपरीत है।
    3. chlorotrifluoroethylene तेल की एक परत सुनिश्चित करें कि तेल चीन मार्कर सीमाओं (1.3 देखें) भर में फैल नहीं करता बनाने के साथ भ्रूण को कवर।
      नोट: तेल के साथ भ्रूण कवर करने से पहले, एक कदम और आगे प्रदर्शन किया जा सकता है: भ्रूण उनके तरल सामग्री को कम करने और इस प्रकार इंजेक्शन डीएनए समाधान के प्रवेश की सुविधा के लिए कुछ मिनट के लिए निर्जलीकृत जा सकता है। यह मदद मिल सकती है इंजेक्शन या इंजेक्शन समाधान के अत्यधिक रिसाव के दौरान भ्रूण फोड़ बचने के लिए, उच्च तरल दबाव का एक परिणाम के रूप में।

3. भ्रूण Microinjection

  1. प्लास्मिड डीएनए या dsRNA समाधान (1-2 माइक्रोग्राम / μl) एक micropipette का उपयोग के साथ एक सुई (1-2 μl) भरें।
  2. एक micromanipulator का उपयोग कर सुई (चित्रा -1) की गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए एक stereomicroscope के तहत microinjection प्रदर्शन करना। स्लाइड स्थानांतरित करने के लिए खुर्दबीन मंच का प्रयोग करें।
    1. गुंजाइश के मंच पर स्लाइड रखें।
    2. भ्रूण (चित्रा 1E) के पीछे ध्रुव में सुई की नोक डालें।
    3. पेडल के साथ microinjection प्रणाली को सक्रिय करने से समाधान इंजेक्षन। इंजेक्शन तरल आंतरिक दबाव में वृद्धि लाती है, भ्रूण के एक मामूली आंदोलन में जिसके परिणामस्वरूप।
    4. पेडल और तुरंत जारी है, लेकिन धीरे, भ्रूण से सुई को हटा दें।
    5. इंजेक्शन साइट पर एक छोटे से cytoplasmic रिसाव का निरीक्षण करें।
      नोट: microinjection समर्थक होने के कारण डीएनए / dsRNA / siRNA और मृत्यु दर के संभावित घातक प्रभावों के बीच भेदभाव करनेखुद cedure, नियंत्रण प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। ये रिवर्स आनुवंशिकी प्रयोगों के मामले में केवल बफर के इंजेक्शन शामिल है, या, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के व्युत्पन्न डबल असहाय शाही सेना (dsRNA GFP), या siRNA।
  3. इंजेक्शन 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते के बाद।

4. बाद इंजेक्शन प्रक्रिया

  1. दो दिन इंजेक्शन के बाद, एक stereomicroscope के तहत रची लार्वा (चित्रा 1F) के लिए स्लाइड की जाँच करें। लार्वा तेल में ले जाएँ, लेकिन जितनी जल्दी हो सके लार्वा भोजन करने के लिए स्थानांतरित करने की आवश्यकता कर सकते हैं। इस कारण से, स्लाइड्स कई बार एक दिन की जाँच करें।
  2. ठीक एक तूलिका (000) का प्रयोग, धीरे गाजर-आधारित लार्वा भोजन करने के लिए रची लार्वा हस्तांतरण। प्रत्येक पेट्री डिश प्रति 200 लार्वा की एक अधिकतम करने के लिए स्थानांतरण।
  3. 65% आर्द्रता (25 डिग्री सेल्सियस) पर लार्वा सेते हैं। सुनिश्चित करें कि ढक्कन डिश के लिए छड़ी नहीं है, वायु मुद्रा आई।
  4. ढक्कन के साथ पेट्री डिश रखेंज्यादातर बंद कर दिया तो यह है कि अभी भी वहाँ है लार्वा को हवा का प्रवाह। , अत्यधिक सूखने से बचने दैनिक व्यंजन जाँच करने के लिए और, अगर जरूरत है, वाष्पीकरण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए पानी जोड़ें।
  5. एक स्पष्ट कंटेनर एक शुद्ध ढक्कन द्वारा बंद कर दिया पेट्री डिश में रखें और चोकर की एक परत युक्त pupation के पक्ष में। दिनचर्या insectary पालन के लिए के रूप में, 3 instar लार्वा लार्वा भोजन से बाहर कूद और चोकर में पोटा बना जाना।
  6. pupae लीजिए और उन्हें वयस्क पालन और स्क्रीनिंग के लिए एक छोटे से पिंजरे में जगह (इस पीढ़ी 0, G0 है)। रियर मानक लार्वा खाने पर संतान।
  7. रोगाणु लाइन परिवर्तन प्रयोगों के मामले में, अगली पीढ़ी में संभव तब्दील व्यक्तियों (G1) के लिए जाँच के रूप में इंजेक्शन व्यक्तियों आमतौर पर काइमेरा हैं। स्थानांतरण की घटनाओं, वास्तव में, भ्रूण संकोश के नाभिक है, जो या तो रोगाणु लाइन या सोमा बनेगी में से किसी में हुआ हो सकता है।
    1. जल्द ही सामने आने के बाद, सीओ 2 का उपयोग G1 व्यक्तियों anesthetize और स्ि्न्ंतरर के लिए जाँचएक epifluorescence stereomicroscope के तहत ormation घटनाओं। ; (ईएमएम 605/75।। एक्सटेंशन 546/12) जबकि हरी प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन करने के लिए EYFP फिल्टर का उपयोग (एक्सटेंशन 500/20;।। ईएमएम 535/30) लाल प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के लिए, एक DsRedwide फिल्टर का उपयोग ।
    2. विपरीत सेक्स के जंगली प्रकार वयस्कों के साथ एक छोटे से पिंजरे में तब्दील व्यक्तियों की जगह और एक नया, शुरू में विषमयुग्मजी, तनाव उत्पन्न।

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Representative Results

यहाँ हम (केस 1) भ्रूण microinjection ब्याज की एक जीन के कार्यात्मक विशेषताओं के निर्देश पर की दो आवेदन क्रमश रिपोर्ट, और ट्रांसजेनिक उपभेदों की पीढ़ी (2 प्रकरण) पर।

भ्रूण में dsRNA की डिलिवरी जीन समारोह को जानने के लिए।

Innexin -5 जीन एक अंतर-जंक्शन कि, कीड़ों में, पुरुष और महिला gonads 43,47,48 में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है encodes। जानकारी के निकट से संबंधित प्रजातियों के लिए उपलब्ध के आधार पर, dsRNA प्रेरित जीन मुंह बंद medfly महिला और पुरुष रोगाणु लाइन के पृथक में परिणाम की उम्मीद थी। 2,400 भ्रूण की कुल संख्या एक 2 माइक्रोग्राम / μl dsRNA मिश्रण है, जिसमें से 548 लार्वा रची और 216 वयस्कों से बच (अप्रकाशित डेटा) के साथ इंजेक्शन थे। वयस्कों, वृषण और अंडाशय के बारे में 75% में अंडर विकास तो हो दर्शनped या पूरी तरह से अनुपस्थित (चित्रा 2)। दोनों लिंगों से व्यक्तियों के पेट में innexin -5 प्रतिलेख बहुतायत की मात्रा का ठहराव, जीन की काफी कम अभिव्यक्ति की पुष्टि की नियंत्रण की तुलना में।

फ्लोरोसेंट शुक्राणु के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों की पीढ़ी।

Medfly fluorescently लेबल शुक्राणु के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों प्लास्मिड डीएनए के साथ भ्रूण इंजेक्शन द्वारा स्कोलारी और उनके सहयोगियों ने 34 से उत्पन्न किया गया। मिश्रण दो plasmids तय रिश्तेदार प्रतिशत में मिलाया निहित: एक, "हेल्पर प्लाज्मिड", piggyBac Transposase इनकोडिंग; अन्य, "दाता प्लाज्मिड", कृत्रिम transposon रखी जाती है और दो फ्लोरोसेंट मार्करों किया जाता है, एक विशेष रूप से वृषण में, पुरुषों और महिलाओं की सोमा में व्यक्त अन्य। बीटा 2 ट्यूबिलिन जीन के प्रमोटर, टी के लिए जिम्मेदारEstes विशिष्ट अभिव्यक्ति, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कोडिंग दृश्यों के साथ ATG पर इनकार किया गया था turboGFP (निर्माण # 1260) या DsRedExpress क्रमश: (# 1261 का निर्माण)। 821 भ्रूण की कुल संख्या, इंजेक्शन 205 लार्वा रची जिसमें से और 37 वयस्कों से बच रहे थे। 9 महिला और पुरुष 8 क्रॉसिंग सेट-अप कर रहे थे, 6, जिनमें से फ्लोरोसेंट संतान दे दी 34 (इन आंकड़ों Elsevier से प्राप्त करने के लिए पुन: उपयोग लाइसेंस - लाइसेंस नंबर 3796240759880)। सफल परिवर्तन हरे और लाल फ्लोरोसेंट वृषण, क्रमशः (चित्रा 3) के साथ नस्लों के विकास के लिए नेतृत्व किया।

आकृति 1
चित्रा 1. insectary उपकरण और भ्रूण। (ए) मानक 1,500-2,000 वयस्कों युक्त पिंजरे पालन। महिलाओं पीतल के माध्यम से अंडे पिंजरे के मोर्चे पर जाल रखना। अंडे पानी में एकत्र कर रहे हैं। बाईं तरफपिंजरे की ओर, अंडे फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल किया झरनी दिख रहा है। (बी) के मानक लार्वा युक्त भोजन लार्वा के दो बक्से। बक्से चोकर युक्त pupation की सुविधा के लिए एक बड़ा स्पष्ट प्लास्टिक के डिब्बे में रखा जाता है; नेट बॉक्स को कवर हटा दिया गया है। (सी) भ्रूण पंक्तियों में व्यवस्था की। स्लाइड पर डबल-लेपित टेप के किनारों एक सफेद चीन मार्कर के साथ चिह्नित किया गया है। टेप पर गठबंधन अंडे chlorotrifluoroethylene तेल के साथ कवर किया जाएगा। (डी) microinjection तंत्र (बाएं) एक micromanipulator (दाएं) के साथ सुसज्जित एक stereomicroscope से जुड़ा है। (ई) भ्रूण के खंभे; लाल तीर, पीछे ध्रुव (इंजेक्शन साइट) को इंगित करता है, जबकि काला तीर पूर्वकाल पोल (जहां micropyle स्थित है) इंगित करता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (एफ) रची लार्वा तेल में घूम रहा है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। प्लीएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 पुरुष और कम विकसित gonads के साथ महिला। महिला (बाएं) और पुरुष (दाएं) प्रजनन इलाकों विच्छेदित। ऊपर: जंगली प्रकार सामान्य gonads के साथ व्यक्तियों। नीचे: के तहत विकसित gonads के साथ व्यक्तियों दखल दिया। Mags: नर गौण ग्रंथियों; सपा: spermathecae। स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट वृषण और शुक्राणु। वयस्क पुरुषों का निर्माण # 1260 और # 1261, क्रमशः के साथ बदल के साथ पुरुष थे। तीर Fluo का संकेतrescent वृषण। # 1260 पुरुषों, लाल और हरे रंग शरीर वृषण दिखाने जबकि # 1261 पुरुषों लाल और हरे रंग वृषण शरीर दिखाने के लिए। स्केल बार = 2 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कीट भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की Microinjection एक सार्वभौमिक तकनीक है कि दोनों जीन समारोह और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के विश्लेषण की सुविधा है।

कीट प्रजातियों में से एक बढ़ती हुई संख्या से जीनोम अनुक्रम की हाल ही में प्रकाशन अभी तक अज्ञात समारोह के जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए उपकरण के लिए एक तत्काल आवश्यकता की ओर जाता है। आरएनए हस्तक्षेप की सबसे अधिक मूल्यवान तरीकों में से एक आणविक कार्यों 49 अनुमान करने के लिए साबित हो गया है और भ्रूण microinjection इन अध्ययनों की सुविधा।

प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन Transposase की मध्यस्थता जीन प्रविष्टि का उपयोग कीट जीनोम को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और हाल ही में, जीनोम संपादन उपकरण (जैसे, talen, CRISPR / Cas9, HEGs)। इन तकनीकों में पहले से ही कई कीड़ों की प्रजातियों का दबाव है कि कीट नियंत्रण कार्यक्रमों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास की अनुमति दी है, दोनों उन्मूलन पर या जंगली आबादी के प्रतिस्थापन w पर निशानाith संशोधित जैविक सुविधाओं के साथ कीड़े। इस प्रोटोकॉल में, हम या तो प्लास्मिड डीएनए या dsRNA साथ medfly भ्रूण microinjection के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन है।

की उपलब्धता अच्छी तरह से स्थापित और लागत प्रभावी अर्द्ध शुष्क लार्वा मध्यम medfly पालन, साथ ही व्यापक आणविक जानकारी लिंग निर्धारण और इस प्रजाति में cellularization प्रक्रिया के अध्ययन के शोधकर्ताओं द्वारा वर्षों में हासिल करने के लिए, बहुत एक विश्वसनीय की स्थापना की सुविधा भ्रूण microinjection प्रोटोकॉल। विशेष रूप से, पालन प्रोटोकॉल अधिकतम उर्वरता और भ्रूण के जीवन शक्ति को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यह इंजेक्शन संभव भ्रूण की कम से कम संख्या के साथ व्यवहार्य वयस्कों प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है। अलग प्रोटोकॉल ऐसे गाजर-आधारित लार्वा खाना है कि हम पीछे करने के लिए वर्णन इंजेक्शन लार्वा के रूप में, medfly पालन के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, इस पद्धति अधिक महंगा है और इसकी तैयारी की तुलना में अधिक समय लेने वाली हैअन्य दिनचर्या पालन के लिए इस्तेमाल किया मीडिया।

microinjection का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा गैर विशिष्ट भ्रूण के यांत्रिक हेरफेर की वजह से नुकसान है। इस तरह के भ्रूण, इंजेक्शन की मात्रा, इंजेक्शन साइट और बफर बोध के लिए इस्तेमाल किया तूलिका के साथ भ्रूण झिल्ली के भेदी के रूप में भ्रूण के अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए कई चर शामिल हैं, और सुई के प्रकार 50 का इस्तेमाल किया। इन मानकों में से कुछ इस तरह के इंजेक्शन की मात्रा और बफर के रूप में अनुकूलित किया गया है। सुइयों के मामले में, वे भी एक खींचने का उपयोग घर में उत्पादन किया जा सकता है, और इस आदर्श प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए एक अनुकूलन कदम की आवश्यकता है।

Microinjection प्रक्रिया में प्रमुख कमियां में भी dechorionation है: हालांकि इस कदम अंडे हैंडलर के लिए आसान है (यानी, कम फिसलन) और भ्रूण जीवन शक्ति इंजेक्शन की सुविधा के लिए, ब्लीच करने के लिए लंबे समय तक निवेश भारी प्रभावित कर सकते हैं बनाने के लिए आवश्यक है। एफओआर इस कारण से, प्रोटोकॉल हम यहाँ वर्णन एक बहुत ही कम समय dechorionation (5 सेकंड) है, जो जरायु और जीवित रहने की दर को हटाने के बीच एक अच्छा समझौता के रूप में स्थापित किया गया है के उपयोग की रिपोर्ट।

रियर बाद के जीवन स्तर के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल भी प्रासंगिक हैं। लार्वा इंजेक्शन भ्रूण से रची जितनी जल्दी हो सके तेल से हटाया जाना है। तेल वास्तव में भ्रूण के सुखाना को रोकने के लिए, लेकिन लार्वा को हानिकारक हो सकता है अनिवार्य है। विधि लार्वा, समय तेल में बिताए दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और उपयोग भोजन के प्रकार सभी महत्वपूर्ण चर के बाद से वे अंतिम जीवित रहने की दर समझौता कर सकते हैं पर विचार करने की जरूरत है।

जब वयस्क और लार्वा स्क्रीनिंग, स्थिरीकरण तरीकों में भी महत्वपूर्ण हो सकता है। Medfly वयस्कों या तो बर्फ का उपयोग कर या सीओ 2 स्थिर किया जा सकता है, लेकिन लंबे समय तक निवेश वयस्क अस्तित्व के लिए हानिकारक हो सकता है। भ्रूण microinjection के लिए एक विकल्प के रूप में, मौखिक वितरण साबित हो गया हैआरएनएआई assays प्रदर्शन करने के लिए एक कम आक्रामक और संभवतः उच्च throughput तरीका हो। यह प्रजाति है कि microinjection करने के लिए उत्तरदायी है, साथ ही क्षेत्र की आबादी में आरएनएआई की मध्यस्थता कीट नियंत्रण के लिए नहीं कर रहे हैं विशेष रूप से प्रभावी हो सकता है।

सबसे पहले, सफल परिवर्तन medfly जीनोम, जो फ्लोरोसेंट वृषण के साथ कई उपभेदों की स्थापना हुई की Transposase की मध्यस्थता जीन प्रविष्टि के माध्यम से: इस पत्र में, दो मामलों के रूप में प्रोटोकॉल के संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण में वर्णित सूचना दी गई है। इसी तरह की एक microinjection प्रक्रिया का उपयोग करना है, यह भी dsRNA इंजेक्षन करने के लिए, पछाड़ना के प्रभाव को वयस्क अवस्था तक दिखाई जा रही है साथ संभव है।

medfly भ्रूण के लिए एक विश्वसनीय microinjection प्रोटोकॉल की स्थापना, शास्त्रीय दृष्टिकोण के लिए वैकल्पिक या पूरक रणनीति के रूप में, बाँझ कीट सहित रास्ते में जंगली मक्खियों को नियंत्रित करने के लिए एक उपकरण के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों पर विचार करने के लिए खोलातकनीक। अंत में, जेबरा मछली भ्रूण में स्वचालित microinjection के लिए प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के संभावित medfly और अन्य प्रासंगिक कीटों 51 की ट्रांसजेनिक उपभेदों बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रासंगिकता के साथ उच्च throughput वितरण प्रणाली के विकास में मदद कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

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