एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर बेमिसिया टैबची के अंडे निषेचन दर का निर्धारण

Liz ने जो प्रोटोकॉल विकसित किया है, वह हमें व्हाइटफ्लाई निषेचन दर निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस तकनीक को लागू करने से व्हाइटफ्लियों के व्यवहार और पारिस्थितिकी के बारे में हमारी समझ में सुधार होगा। व्हाइटफ्लियां हैपोडिप्लॉयड हैं, इसलिए निषेचन दर ओविपोजिशन पर लिंगानुपात के बराबर है।

यह प्रोटोकॉल सबसे पहले व्हाइटफ्लियों के लिए वर्णित है, हमारी जानकारी के लिए, और तीन घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, पेट्री डिश कवर में एक कवर करने योग्य छेद डालने के लिए और वयस्क whiteflies को दूर करने के लिए । एक आर्द्रता कक्ष की स्थापना और एक पतली जांच करने के लिए एक पिघला पिपेट टिप में एक आरामदायक काम कोण पर एक पतली पिन डालने के द्वारा एक जांच फैशन ।

वैकल्पिक रूप से, व्हाइटफ्लाई अंडे की आसान हैंडलिंग के लिए गर्मी के साथ ग्लास पिपेट टिप्स को बढ़ाएं। फिर, मादा व्हाइटफ्लियों को एक साफ पत्ते पर ओविपोसिट करने की अनुमति दें, पेट्री डिश में एगर पर फिट होने के लिए काटें। व्हाइटफ्लाई ओविपोजिशन के दौरान, साबुन और पानी के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड को साफ करें।

इसे अच्छी तरह से सुखाएं और एक छोर पर पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा खिंचाव के लिए तरल पदार्थ बूंदें और अंडे बनाने के लिए और अधिक आसानी से देखा जा करने के लिए अनुमति देते हैं । अंडे को डिकोरिओनेट करने के लिए, वयस्क हटाने और अंडे के संग्रह से ठीक पहले पैराफिन फिल्म में 83% सोडियम हाइपोक्लोराइट ब्लीच समाधान की बूंदों को जोड़ने के लिए ग्लास पेस्टर पिपेट का उपयोग करें। ब्लीच और हिमनदों एसिटिक एसिड दोनों संक्षारक होते हैं।

उन्हें हुड या अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए। DAPI भी एक अड़चन है और दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए। इसके बाद पत्ती से वयस्क सफेदी निकाल कर पत्ती को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।

प्रत्येक अंडे को उसके आधार से तब तक सावधानी से उठाएं जब तक कि पत्ते से पेडीकेल निकल न जाए। इस प्रोटोकॉल को करने से पहले कई अंडों पर अभ्यास करें। अंडे को धीरे-धीरे आधार से उठाएं और एक बार जब आप देख सकते हैं कि अंडे पेडीकेल पत्ते से हटा दिया जाता है तो इसे पूरी तरह से पत्ते से उठाएं।

ब्लीच की प्रत्येक बूंद के लिए दो से तीन अंडे स्थानांतरित करें और उन्हें 10 मिनट के लिए छोड़ दें। अंडों को ठीक करने के लिए ब्लीच को त्यागने के लिए ग्लास पिपेट का इस्तेमाल करें। फिर, हिमनदों एसिटिक एसिड की बूंदें जोड़ें और तीन मिनट इंतजार करें।

इसके बाद, हिमनदों एसिटिक एसिड को हटा दें और क्लार्क के समाधान की बूंदें जोड़ें। फिर, जब तक अधिकांश समाधान सुखाया नहीं गया है तब तक 10 मिनट प्रतीक्षा करें। 70% इथेनॉल की बूंदें जोड़ें और 10 मिनट के लिए फिर से प्रतीक्षा करें।

अंडे को दाग देने के लिए, सबसे पहले किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। फिर, अंडे के लिए 1xPBS की बूंदें जोड़ें पीएच सात के करीब मिलता है । डेसीफिकेशन को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में रखें।

30 मिनट के बाद, 1xPBS को हटा दें और 1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर डीएपीआई की बूंदें जोड़ें। एक अंधेरे आर्द्रता कक्ष में माइक्रोस्कोप स्लाइड रखो और कम से कम 15 मिनट रुको। अंडे धोने के लिए सबसे पहले दापी सॉल्यूशन निकालें।

फिर अंडे में 1xTBST की बूंदें जोड़ें। पांच मिनट के बाद 1xTBST निकालें। कुल तीन वॉश के लिए इस वॉश को दो बार और दोहराएं।

अंतिम धोने के बाद, माइक्रोस्कोप स्लाइड के एक साफ हिस्से पर पैराफिल्म से सभी अंडों को ध्यान से पिपेट करें। अतिरिक्त टीबीस्ट निकालें और बढ़ते मीडिया के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंत में, अंडे के शीर्ष पर एक साफ कवर स्लाइड रखें, लंबे समय तक भंडारण के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर स्लाइड को सील करें, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।

डीएपीआई परमाणु धुंधला के बाद अंडे के डिकोरियान ने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ मनाए जाने पर निषेचन और भ्रूण लिंग के असाइनमेंट की अनुमति दी। मादा प्रोन्यूक्लिस निषेचित मादा अंडे और निषेचित पुरुष अंडे दोनों के केंद्र के पास है, और शुक्राणु केवल मादा अंडे के शीर्ष के पास एक उज्ज्वल लकीर के रूप में दिखाई देता है। इस तकनीक का एक आवेदन यह निर्धारित करना है कि बैक्टीरियल एंडोसिम्बियन व्हाइटफ्लियों के प्राथमिक लिंग अनुपात को प्रभावित करते हैं या नहीं।

उदाहरण के लिए, रिकेटसिया-संक्रमित और असंक्रमित बी टैबी व्हाइटफ्लियों द्वारा रखे गए अंडों के प्राथमिक लिंग अनुपात में दो उपचारों में लिंग अनुपात के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा । वयस्कता के लिए पाला अंडे के लिए के रूप में, इसी तरह के परिणाम रिकेटसिया संक्रमित और असंक्रमित वयस्कों के लिए देखा गया, कोई सबूत प्रदान करने, कम से कम इस अध्ययन में, रिकेटसिया संक्रमित महिलाओं द्वारा अधिक निषेचन दरों के लिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई यह निर्धारित कर सकता है कि अंतरविशिष्ट शुक्राणु अंडे को निषेचित कर सकते हैं या नहीं।

यदि कोई निषेचन नहीं देखा जाता है, तो कोई भी यह देखने के लिए देख सकता है कि क्या शुक्राणु को मादा के शुक्राणुओं में देखकर संभोग के दौरान स्थानांतरित किया जाता है। यदि निषेचन होता है, तो कोई भी वयस्कों के लिंग अनुपात की तुलना निषेचन दर से कर सकता है ताकि हाइब्रिड संतान विकास की व्यवहार्यता निर्धारित की जा सके।