Metodo di consegna diretta segmentale intra-epatico utilizzando un modello di fegato di ratto Hilar morsetto

Medicine
 

Summary

Un modello di morsetto ilare unico fegato di ratto è stato sviluppato per studiare l'impatto di molecole farmacologiche nel migliorare danno da ischemia-riperfusione. Questo modello include incannulazione diretta della fornitura portale per il segmento epatico ischemico tramite un ramo della vena porta, consentendo la consegna epatica diretta.

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Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

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Abstract

chirurgia epatica maggiore afflusso di occlusione, e il trapianto di fegato, necessitano di un periodo di ischemia calda, e un periodo di riperfusione conseguente ischemia / riperfusione (I / R) lesioni con conseguenze negative miriade. Potenziali lesioni I / R di organi marginali destinati al trapianto di fegato contribuisce alla carenza donatore corrente secondaria ad un tasso di utilizzo organo diminuito. Un forte bisogno esiste per esplorare I epatica infortunio / R al fine di mediare il suo impatto sulla funzionalità del trapianto nel trapianto. fegato di ratto modelli morsetto ilari sono usati per studiare l'impatto di molecole diverse su epatica lesioni di I / R. A seconda del modello, queste molecole sono state consegnate con l'inalazione, l'infusione epidurale, un'iniezione intraperitoneale, somministrazione per via endovenosa o iniezione nella periferica vena mesenterica superiore. Un modello morsetto hilar fegato di ratto è stato sviluppato per l'utilizzo in studio dell'impatto di molecole farmacologiche nel migliorare pregiudizio I / R. il describmodello ed clamp hilar fegato di ratto comprende incannulazione diretta della fornitura portale per il segmento epatico ischemico tramite un ramo laterale della vena porta, consentendo la consegna epatica segmentale diretta. Il nostro approccio è quello di indurre ischemia nei lobi laterali e mediano di sinistra per 60 minuti, durante i quali è infuso la sostanza in fase di studio. In questo caso, peghilato-superossido dismutasi (SOD-PEG), uno scavenger di radicali liberi, è infuso direttamente nel segmento ischemico. Questa serie di esperimenti dimostrano che l'infusione di PEG-SOD è protettivo contro epatica lesioni I / R. I vantaggi di questo approccio includono iniezione diretta della molecola nel segmento ischemico con conseguente diminuzione del volume di distribuzione e la riduzione degli effetti collaterali sistemici.

Introduction

Chirurgia epatica maggiore afflusso di occlusione, e il trapianto di fegato, necessitano di un periodo di ischemia calda, e un periodo di riperfusione conseguente ischemia / riperfusione (I / R) pregiudizio 1. Le conseguenze di lesioni I / R nel fegato sono stati ampiamente dettagliata 1, 2, 3. Conseguenze di I / lesioni R descritto in letteratura sono: generazione di specie reattive dell'ossigeno, apertura della cascata infiammatoria inclusa l'attivazione dei neutrofili, cellule di Kupffer e le cellule endoteliali, attivazione del sistema eme ossigenasi e l'attivazione dei recettori toll-like, un squilibrio tra endotelina e ossido nitrico, l'attivazione del fattore nucleare-kB, e la promozione di citochine proinfiammatorie e sintesi 1, 2, 3 molecola di adesione. Questi eventi proinfiammatorie may lead all'apoptosi, necrosi, disfunzione organica ed eventuale insufficienza d'organo 3.

I / R lesioni in organi destinati al trapianto di fegato può portare alla perdita del trapianto precoce e contribuisce alla carenza di donatori corrente come organi marginali sono più suscettibili al danno 3. Attualmente ci sono 15.226 potenziali destinatari in lista d'attesa per il trapianto di fegato negli Stati Uniti 4 e solo 5.950 trapianti di fegato sono stati effettuati nel 2015 5. A causa di questa estrema limitazione disponibilità di organi, la ricerca esplorando epatica lesioni I / R è necessaria al fine di ottimizzare la funzione dell'innesto e l'utilizzo di organi.

modelli animali utilizzati per studiare epatica lesioni I / R comprendono modelli clamp hilar ratto e modelli di trapianto di fegato di ratto. Ci sono una varietà di modelli di serraggio ratto ilari attualmente in uso. Il più comune è quello in cui la vena porta, arteria epatica e biliare duct fornire i lobi laterali e mediano sinistro sono fissati con le clip microchirurgia 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 da 30 a 60 min 6, 7, 10, 13, 14, e quindi un periodo di riperfusione da 60 min per 24 h 7, 9, 10, 13, 14 è consentito. I lobi laterali e mediano sinistro del fegato di ratto comprendono circa il 70% del parenchima epatico 9. Alcuni protocolli progettati per studiare precondizionamento ischemico comprendono bloccaggio intermittente dei vasi ilario l'arto posteriore prima di un lungo periodo di ischemia indotta dal serraggio dei vasi ilari 9, 13. Ci sono anche diverse modifiche descritte in letteratura. Il primo è quello di bloccare la vena porta e l'arteria epatica fornendo i lobi laterali e mediano sinistro, ma escludere il dotto biliare 15. Una seconda modifica è di indurre ischemia epatica totale fissando il condotto vena, arteria epatica e bile prima della loro divisione 16, 17, 18, 19, 20. Una terza modifica comprende bloccaggio dei vasi ilari al lobo destro da 30 a 60 min 8. Un ulteriore modifica comporta la chiusura del fascio vascolare in un arto posteriore per indurre lesioni nel fegato 13, 21 Figura 1A-D.

fegato di ratto modelli clamp ilari sono stati utilizzati per studiare l'impatto di differenti molecole e composti su epatica I / R. A seconda del modello utilizzato queste molecole sono state consegnate mediante inalazione 11, epidurale infusione 12, iniezione intraperitoneale 17, 18, 21, 22, la somministrazione endovenosa 10, 14, 15, 19, 23, 24 o iniezione nel periferico mesenterica superiore vena 8 .

Il modello per fegato di ratto morsetto hilar descritto in questa relazione inclusa,es incannulamento diretto della fornitura portale per il segmento ischemico tramite un ramo laterale della vena porta (figura 2), che permette segmentale diretta consegna epatico della sostanza farmacologica in esame. Il nostro approccio è di indurre ischemia nei lobi laterali e mediano sinistro per 60 minuti, durante i quali un'infusione della sostanza in esame, in questo caso, superossido peghilato-superossido, uno scavenger di radicali liberi 25, è infuso direttamente nel segmento ischemico . I campioni di sangue sono presi prima dell'induzione dell'ischemia ea 120 min post-riperfusione. A questo punto, il ratto è sacrificato e vengono prelevati campioni dai lobi sinistro e mediano. Inoltre, i campioni vengono prelevati dal lobo diritto di servire come controllo interno.

Ci sono numerosi vantaggi di questo approccio. Innanzitutto, quando la sostanza farmacologica in esame può essere iniettato direttamente nel segmento ischemico volume odistribuzione f è piuttosto basso rispetto al volume di distribuzione di iniezione nella circolazione sistemica o cavità peritoneale. Inoltre, questo approccio riduce, anche se non eliminare, la possibilità di effetti collaterali sistemici.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite secondo le linee guida della Animal Care istituzionali e Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura umana ed uso di animali da laboratorio (IACUC) e ha subito l'approvazione da parte del comitato Ohio State University IACUC.

1. Set-up iniziale

  1. Set-up del microscopio chirurgico e la sala operatoria (Figura 3, Figura 4). Accendere tutte le apparecchiature comprese quelle per il mantenimento di anestesia e monitoraggio dei parametri vitali. Accendere il pad unità e il riscaldamento elettrobisturi. Posizionare la pompa di infusione vicino al tavolo operatorio.
    1. Elaborare 10 ml di isoflurano liquido per inalazione (peso molecolare 184,5) nella siringa anestesia e posizionarlo nella unità anestesia.
    2. Set-up un contenitore 200 mL di azoto liquido vicino al tavolo operatorio e un altro vicino alla centrifuga dove verranno elaborati campioni di sangue.
    3. Position gli strumenti chirurgici, 4-0 e 7-0 intrecciato sutura di seta, tamponi di cotone sterile, spugne 4x4 non tessuti, 5 siringhe ml e 27 gauge insulina siringhe vicino al tavolo operatorio.
  2. Preparare la camera isoflurano e garantire che isoflurano sufficiente instillato nel sistema anestesia erogazione dell'induzione.

2. induzione dell'anestesia

  1. Prima di maneggiare il ratto messo sul seguente dispositivi di protezione individuale (DPI): mascherina chirurgica, guanti chirurgici, e camice monouso.
  2. Pesare il ratto e registrare il peso.
    NOTA: ratti Sprague Dawley devono essere utilizzati.
  3. Posizionare il topo nella camera di anestesia e accendere l'isoflurano e l'ossigeno. Indurre l'anestesia con isoflurano camera.
  4. Clip di capelli addominale dell'animale utilizzando un tagliacapelli elettrico per consentire l'esposizione pulitore (Figura 5).
  5. Posizionare la parte posteriore degli animali nella camera di isoflurano per un additional minuto. Eseguire una presa punta per verificare profondità dell'anestesia.

3. procedura

  1. Posizionare il ratto con naso dell'animale nel cono naso e quattro estremità immobilizzati con restrizioni o nastro sul pad riscaldamento.
  2. Continuare anestesia utilizzando il sistema di erogazione di anestesia, cono e isoflurano in anestesia al 3,6% per gli animali di peso compreso tra 200 e 250 g e 4% per gli animali di peso superiore a 250 g. Confermare profondità dell'anestesia eseguendo una presa punta e una presa pelle.
  3. Effettuare un'incisione addominale mediana da pube xifoide attraverso la pelle usando forbici affilate (Figura 6).
  4. Fare un'incisione nel peritoneo lungo la linea alba dal pube al xifoide e inserire la cura presa addome non danneggiare la vescica o l'intestino. Come il fegato attacca anche al peritoneo anteriormente vicino al processo xifoideo, assicurarsi che rilascia prima incisione della parete addominale in questo arEA.
  5. Effettuare un'incisione trasversale attraverso la pelle ed il peritoneo a livello del bordo inferiore del lobo destro del fegato.
  6. Ruotare l'anestesia fino al 1,6% per gli animali di peso compreso tra 200 e 250 ge 2% per gli animali di peso superiore a 250 g.
  7. Retrarre il processo xifoideo mezzo di una fascetta di zanzara curvo.
  8. Divaricatori posto nervatura tirando le costole più lontano possibile dalla linea mediana (Figura 7). Tagliare il falciforme, frenico e legamenti gastrici. Capovolgere il fegato utilizzando tamponi di cotone sterili inumiditi.
  9. Tagliare legamenti supplementari se necessario per ottenere l'accesso alla porta. Eseguire rotazione viscerale con soluzione salina inumidito garza (Figura 7).
  10. Rimuovere il tessuto connettivo lasso sovrastante l'ilo portale utilizzando dissezione tagliente o smussato. Rimuovere il tessuto connettivo lasso sovrastante la lunghezza della vena porta.
  11. Utilizzare pinze per spingere attraverso il allentata t connettivoquestione posteriormente al portale sinistra vena, arteria e del dotto biliare facendo una finestra e posizionare 4-0 Potts sutura ma non cinch basso (Figura 8).
  12. Cancellare fuori il tessuto connettivo lasso sovrastante il ramo posteriore alla vena portale che entra a circa il livello del rene destro. Questa vena verrà utilizzato per incannulazione.
  13. Disegnare 0,5 ml di sangue dalla vena cava inferiore (IVC) con una siringa da insulina (Figura 9). Posizionare i 0,5 ml di sangue in una piccola fiala, centrifugare a 135 g per 12 min. Tentativo di erogare il siero.
    1. Se una linea distinta non può essere apprezzato tra globuli rossi e siero, cercare di centrifugare per altri 2 - 3 min a 135 x g. Aspirare il siero e posto in una fiala per alanina-aminotransferasi (ALT). Snap congelare questo esemplare mettendo direttamente in azoto liquido.
  14. Tagliare due pezzi di 7-0 sutura e posto in prossimità della vena che verranno utilizzati per cannulazione. Posizionare il primo 7-0 cappio intorno a questa vena per quanto mediale possibile. Legare questo ciclo e utilizzarlo per ritirare utilizzando un morsetto zanzara ricurva (Figura 10). Posizionare un secondo 7-0 ciclo sulla vena che verrà utilizzato per incannulazione vicino alla sua intersezione con la vena porta e posizionare una cravatta, ma non cinch giù.
  15. Preparare la pompa di infusione con una siringa da 5 ml con 3 ml di reagente. Primo il tubo.
  16. Morsetto distale vena porta con un morsetto microchirurgico.
    NOTA: Ciò consentirà di ridurre il sanguinamento quando la vena è incisa per incannulazione.
  17. Tagliare un foro di 0,5 mm vena tra la sutura 7-0 soggiorno e sua intersezione con la vena portale utilizzando piccole forbici microchirurgia. Utilizzare 27-0 catetere per incannulare sistema venoso portale sinistro (Figura 11, Figura 12). Inserire il catetere oltre la biforcazione delle vene del portale sinistro e destro.
  18. Controllare il posizionamento della cannula da infusing 1 ml di soluzione fisiologica e guardare per i lobi laterali e mediano sinistro del fegato sbiancare. confermare manualmente che catetere è oltre il decollo del diritto vena porta, ma non oltre il decollo della vena porta alimenta il lobo mediano.
  19. Cinch giù la sutura Potts e iniziare a tempo di ischemia. Stringere 7-0 sutura intorno vena e 27-0 catetere per tenerlo in posizione e rimuovere il morsetto dalla vena porta distale.
  20. Iniziare l'infusione di polietilene glicole-dismutasi superossido (PEG-SOD, 0,00,067 mila g / mL) utilizzando la pompa di infusione. Avviare l'infusione il più vicino possibile al punto di partenza del tempo di ischemia.

4. Monitoraggio

  1. Continuare a monitorare i segni vitali degli animali in tutta l'infusione. Fornire 2 mL di 0,9% soluzione fisiologica o 2 ml di PEG-SOD (0,00,067 mila g / ml) sciolto in 0,9% di soluzione salina normale durante un periodo di 15 min.

5. riperfusione

  1. Lasciare un'ora per passare dall'inizio del Itempo schemic. Questo è 1-h di tempo di ischemia calda.
  2. Rimuovere la sutura Potts. Rimuovere il 27-0 del catetere. Cinch giù il 7-0 sutura intorno alla vena. Si noti il ​​tempo. Questo segna il tempo di riperfusione.

6. Campionamento Continua

  1. Disegnare 0,5 ml di sangue fuori dal IVC a 120 min post-riperfusione. Disegnare il sangue lentamente per evitare lisi dei globuli rossi. Lentamente gocciolare il sangue in una fiala. Assicurarsi che il sanguinamento dal IVC è controllato dopo ogni prelievo di sangue.
    1. Se v'è un continuo sanguinamento applicare una leggera pressione con un tampone di cotone sterile o un piccolo 1 cm di 1 cm sezione di taglio da una garza.
  2. Centrifugare a 135 g per 12 min. Se la separazione sufficiente non viene raggiunto, provare un ulteriore 2 - 3 min a 135 x g.
  3. Posizionare la metà del siero in una fiala per successive elaborazioni per ALT. Snap congelare questi esemplari.

7. L'eutanasia

  1. Mentre il ratto è ancora sotto anestesia intercettato IVC e superior vena cava (SVC) e monitorare il flusso di sangue fino a quando, la respirazione e battito cardiaco cessate.
  2. Incidere la membrana ed eseguire una breve un'epatectomia incidendo la membrana in un cerchio e incidendo tessuto connettivo aggiuntivo che rimane collega il fegato alla cavità peritoneale. Rimuovere il fegato dalla cavità peritoneale.
  3. Prendere quattro campioni dai lobi sinistro e mediano del fegato e quattro campioni dal lobo destro del fegato. I campioni devono essere il più ampio possibile e la loro dimensione sarà limitato solo dalla quantità di tessuto epatico disponibili. Mettere questi in piccole fiale etichettate, e far scattare congelare in azoto liquido. Utilizzarli per successive elaborazioni per il tessuto adenosina trifosfato (ADP), malondialdeide (MDA) e glutatione (GSH).

8. Post-esperimento Analysis

  1. Determinare il glutatione (GSH), malondialdeide (MDA) e alanina aminotransferasi (ALT) attività nel tessuto epatico e campioni di siero utilizzando kit diagnosticisecondo le istruzioni del produttore.
  2. Omogeneizzare il tessuto epatico con tampone di lisi e quantificare usando un saggio Bradford. Analizzare lisato tissutale sodio dodecilsolfato-poliacrilammide gel e immunoblot utilizzando anticorpi contro scisso capase-3 e actina. Quantificare le macchie occidentali eseguiti con il software a disposizione del pubblico.

Representative Results

Questo esperimento è stato eseguito con 2 gruppi di n = 3 ratti ciascuno. Tre fegati di ratto sono stati iniettati con 2 ml di soluzione salina normale (NS) con la pompa di infusione in un periodo di 15 min. Tre fegati di ratto sono stati iniettati con 2 ml di soluzione salina normale (NS) miscelato con peghilato-superossido dismutasi (SOD-PEG, 0,00,067 mila g / mL) con la pompa di infusione in un periodo di 15 min. Come descritto nel protocollo di cui sopra, i campioni di sangue sono stati prelevati morsetto pre-ilare ed a 120 min post-riperfusione. Inoltre, dopo il completamento di 120 min di riperfusione quattro campioni di tessuto di fegato sono stati prelevati da sinistra e lobi mediani e quattro campioni di fegato sono stati prelevati dal lobo destro del fegato di ratto.

Alanina transaminasi (ALT) è stata misurata morsetto pre-ilare ed a 120 min post-riperfusione nel controllo (NS) e sperimentale (PEG-SOD) animali. C'è stata una differenza significativa tra il livello di ALT di controllo (NS)animali morsetto pre-ilare e a 120-min post-riperfusione. Vi era una differenza significativa tra i livelli di ALT di controllo (NS) e animali da esperimento (PEG-SOD) a 120-min (Figura 13A). Tissue malonaldeide (MDA) è stato misurato per il controllo (NS) e sperimentale (PEG-SOD) animali in entrambi i lobi destro e sinistro del fegato. Tissue MDA nel lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) e iniezione sperimentale (PEG-SOD) dimostrano alcuna differenza significativa. lobo sinistro (post-ilare morsetto e riperfusione) tessuto MDA con iniezione di comando (NS) è significativamente diverso lobo destro (morsetto non ilare) p <0.001. Lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) ha significativamente differenti livelli di tessuto MDA con iniezione controllo (NS) rispetto iniezione sperimentale (PEG-SOD) p <0,005 (Figura 13B). Tissue glutatione (GSH) è stato misurato e glutatione tessuto nel lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) unnd iniezione sperimentale (PEG-SOD) dimostrano alcuna differenza significativa. lobo sinistro (post-ilare morsetto e riperfusione) tessuto GSH con iniezione di comando (NS) è significativamente diverso lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) p <0,05. Lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) ha significativamente differenti livelli di glutatione tessuto con iniezione di comando (NS) rispetto iniezione sperimentale (PEG-SOD) p <0,005 (Figura 13C). Western blot è stata eseguita confrontando lobo destro e sinistro di animali di controllo e dimostra maggiore spaccati caspasi-3 nel lobo sinistro dopo morsetto ilo e riperfusione (Figura 13D). Un secondo western blot è stata eseguita confrontando i lobi sinistro di animali trattati con il controllo e con PEG-SOD (Figura 13E). Ciò dimostra diminuita spaccati caspasi-3 nel tessuto epatico di animali trattati con PEG-SOD. Densitometria è stata effettuata anche dimoting che il livello di spaccati caspasi-3 in tessuto epatico è significativamente aumentato nel rispetto lobo destro animali di controllo (Figura 13F) a sinistra. Nel confrontare il tessuto sinistra lobo epatico di animali da esperimento, infuso con PEG-SOD e sinistro tessuti lobo epatico di animali di controllo, infuso con soluzione fisiologica normale, densitometria dimostra significativamente diminuita spaccati caspasi-3 in animali trattati con PEG-SOD in confronto agli animali trattati con controllo (Figura 13G).

Figura 1
Figura 1: anatomiche illustrazioni. A. illustrazione anatomica del fegato di ratto. Illustrazione B. anatomica del fegato di ratto. Il peduncolo portale lobi sinistro e mediano del fegato è bloccato. I lobi sinistro e mediano sono ischemica. C. anatomicoillustrazione di fegato di ratto. Il peduncolo portale al lobo sinistro è bloccato. Il lobo sinistro è ischemica. Illustrazione D. anatomica del fegato di ratto. Il peduncolo portale al lobo destro è serrato e il lobo destro è ischemica.

figura 2
Figura 2: anatomiche illustrazioni. Illustrazione anatomica del fegato di ratto con vena cannulata con un ramo laterale. Il peduncolo portale lobi sinistro e mediano del fegato è circondato da una sutura e un morsetto microvasi è stato usato per stringere attorno al fascio vascolare. I lobi sinistro e mediano sono ischemica.

Figura 3
Figura 3: configurazione dello strumento. La figura dimostra ° e strumento di set-up.

Figura 4
Figura 4: Sala operatoria Set-up. Questa cifra dimostra la sala operatoria di set-up. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Taglio di capelli addominale. La figura dimostra il taglio dei capelli addominale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Immobilizzazione e incisione cutanea. La figura dimostra l'immobilizzazione del ratto e l'incisione cutanea. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: nervatura Retrattore posizionamento e l'eviscerazione. La figura dimostra il posizionamento divaricatore costola e l'eviscerazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8: Luogo zione di sutura. La figura dimostra il posizionamento della sutura. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9: prelevare il sangue dalla vena cava inferiore. La figura dimostra prelievo di sangue dalla vena cava inferiore. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10
Figura 10: Vein Branch legato fuori e retratta. La figura dimostra vena ramo legato fuori e retratto. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 11
Figura 11: Processo di incannulamento. La figura dimostra il processo di incannulamento. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 12
Figura 12: Cannulazione. Questa cifra dimostra la cannulazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

contenuto" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 13
Figura 13: Rappresentante dei risultati: Direct segmentale intraepatica consegna di pegilata-superossido dismutasi Utilizzando un morsetto modello di ratto Hilar. NS = normale soluzione fisiologica. PEG-SOD = peghilato-superossido dismutasi, ALT = alanina aminotransferasi, MDA = malondialdeide. A. alanina aminotransferasi (ALT, mU / mL) rispetto tra morsetto pre-ilare e 120-min post-riperfusione. V'è una differenza significativa tra il controllo (NS) di serraggio pre-ilare e controllo (NS) a 120-min post-riperfusione (p <0.001). C'è anche una differenza significativa tra il controllo (NS) e gruppi sperimentali (PEG-SOD) a 120-min post-riperfusione (p <0.05). T-test di uno studente è stato utilizzato. barre di errore rappresentano la deviazione standard. B. malondialdeide Tissue nel lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) uniniezione sperimentale d (PEG-SOD) dimostrano alcuna differenza significativa. lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) malondialdeide tessuto con iniezione di comando (NS) è significativamente diverso lobo destro (morsetto non ilare) p <0.001. lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) ha significativamente differenti livelli di malonaldeide tessuto con iniezione di comando (NS) rispetto iniezione sperimentale (PEG-SOD) p <0.005. T-test di uno studente è stato utilizzato. barre di errore rappresentano la deviazione standard. C. Tissue glutatione nel lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) e iniezione sperimentale (PEG-SOD) dimostrano alcuna differenza significativa. lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) glutatione tessuto con iniezione di comando (NS) è significativamente diverso lobo destro (morsetto non ilare) con iniezione di comando (NS) p <0,05. lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) ha significativamente differenti livelli di glutatione tessuto con iniectio controllon (NS) rispetto iniezione sperimentale (PEG-SOD) p <0.005. T-test di uno studente è stato utilizzato. barre di errore rappresentano la deviazione standard. D. Western blot dimostrando aumentato spaccati caspasi-3 in tessuto epatico del lobo sinistro (clamp post-ilare e riperfusione) rispetto al lobo destro (morsetto non ilare) di animali di controllo (soluzione fisiologica normale). E. Western blot dimostrando diminuita spaccati caspasi-3 in tessuto epatico di animali trattati con PEG-SOD rispetto agli animali trattati con il controllo (soluzione fisiologica normale). F. Livello di spaccati caspasi-3 nel tessuto epatico è significativamente aumentata in post-ilari morsetto e riperfusione animali (p <0,05). T-test di uno studente è stato utilizzato. barre di errore rappresentano la deviazione standard. G. Nel confrontare fianco tessuto lobo epatico di animali da esperimento (infuso con PEG-SOD) e sinistro tessuti lobo epatico di animali di controllo (infuso con soluzione fisiologica normale), viene significativamente diminuita spaccati caspasi-3 in unimals trattati con PEG-SOD rispetto agli animali trattati con il controllo (soluzione fisiologica normale). T-test di uno studente è stato utilizzato. barre di errore rappresentano la deviazione standard.

Discussion

Questa serie di esperimenti ha dimostrato che l'iniezione di PEG-SOD nel fianco e lobi mediani portato ad una diminuzione significativa nel rilascio di ALT, perossidazione lipidica delle membrane cellulari (MDA), e la manutenzione di glutatione (GSH) rispetto ai controlli (soluzione fisiologica ). transaminasi tessuto epatico tra cui alanina aminotransferasi (ALT) sono stabilite marcatori di danno epatocellulare. La diminuzione ALT quando il lobo sinistro viene iniettato con PEG-SOD suggerisce un effetto protettivo di PEG-SOD. Aumento del tessuto MDA indica aumentato la perossidazione lipidica ed è considerato un marker di stress ossidativo e lesioni dei tessuti. Sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno provoca un aumento della produzione di MDA 26. La significativa riduzione del tessuto MDA lobi sinistra e mediana dell'animale quando iniettato con PEG-SOD dimostra un effetto protettivo di PEG-SOD. Questo è coerente con l'attuale comprensione che il PEG-SOD protegge le cellule dai dannicausata da parzialmente ridotto specie reattive dell'ossigeno 27. Inoltre, in presenza di specie reattive dell'ossigeno, glutatione disolfuro è ridotto a glutatione (GSH) 28. Il mantenimento in GSH nei lobi sinistro e mediano del fegato iniettato con PEG-SOD rafforza ulteriormente l'effetto protettivo di PEG-SOD. Inoltre si è dimostrato che v'è una maggiore spaccati caspasi-3, un prodotto di apoptosi, in tessuti esposti al danno da ischemia-riperfusione. La diminuzione spaccati caspasi-3 nel lobo sinistro quando trattati con PEG-SOD suggerisce che il PEG-SOD porta ad una diminuzione della apoptosi.

superossido dismutasi (SOD) è un enzima critico nella detossificazione di specie reattive dell'ossigeno. L'enzima catalizza la conversione di due anioni superossido in perossido di idrogeno e acqua. L'enzima catalasi quindi converte il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno, completando il processo 25. L'emivita diSOD nativo limitato il suo uso in modelli sperimentali fino allo sviluppo di polietilene glicole-dismutasi superossido coniugato (PEG-SOD). Coniugazione di SOD polietilenglicole aumenta la sua emivita da 6 min a 14 h. Nguyen et al. dimostrato la capacità di ridurre la perossidazione lipidica in ischemia epatica in un modello di ratto, usando rilascio sistemico 29.

Ci sono una varietà di possibili modificazioni della tecnica dettagliato qui e alcuni sono stati precedentemente descritti in letteratura. A seconda del modello utilizzato molecole sono state consegnate mediante inalazione 11, epidurale infusione 12, iniezione intraperitoneale 17, 18, 21, 22, la somministrazione endovenosa 10, 14, 15 19, 23, 24 o iniezione nel periferico vena mesenterica superiore 8.

Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. La più importante è l'incannulamento della vena porta. Bisogna fare attenzione che il foro tagliato in vena non è troppo grande. Il tessuto è molto elastico e il foro si ingrandire propria. Si consiglia di iniziare tagliando un foro che è di 0,5 mm con le forbici microchirurgia. La cannula può essere alimentato attraverso il foro con uno strumento, che permette una maggiore flessibilità che se il tentativo di eseguire questa parte della procedura a mano. Inoltre, mentre inizialmente alimentando la cannula, si dovrebbe mirare direttamente verso la biforcazione delle vene portali sinistra e destra per evitare colpendo un foro attraverso la parete posteriore della vena. Quando la punta della cannula raggiunge la biforcazione, è possibile far avanzare nella vena sinistra specificaalleato. Una volta che la cannula viene alimentato nella vena porta sinistra, che fornisce sia la sinistra e lobi mediani, la sua posizione può essere confermata manualmente sentendo dentro la vena. La sua posizione può anche essere confermata iniettando una piccola quantità di soluzione salina fredda e di vedere l'effetto scottatura sui segmenti forniti del fegato.

Il modello morsetto hilar fegato nel ratto fornisce una piattaforma riproducibile e stabile per dimostrare epatica danno ischemico-riperfusione. Variabili modelli morsetto ilari sono stati utilizzati dai ricercatori per studiare gli effetti protettivi di antiossidanti e altre piccole molecole 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Punti di variazione comprendono quale le navi sono clamp ed, quale segmento sono fatti ischemica, se il dotto biliare è incluso e la lunghezza del periodo di riperfusione 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Inoltre, quando questo modello è usato per studiare l'impatto della somministrazione di una molecola la via di somministrazione è anche eterogenea 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Ci sono diversi vantaggi per l'approccio descritto. In primo luogo, la cannulazione diretta della fornitura portale al segmento ischemico consente una segmentale consegna epatica diretta di la sostanza farmacologica in esame. Ciò permette l'utilizzazione degli altri lobi di fegato come controllo interno. in secondo luogo, la cannulazione epatica segmentale consente un ridotto volume di distribuzione per la molecola in fase di studio. Questo approccio riduce così il rischio di effetti collaterali sistemici la sostanza viene iniettata direttamente nel segmento fegato di interesse. incannulazione diretta del segmento epatico consente la sostanza da erogare pre-ischemia, Intra-ischemia o post-ischemia. Questo permette per lo studio degli effetti della molecola in qualsiasi punto del ciclo di danno da ischemia-riperfusione. Con l'aumento della lunghezza del tempo ischemico e aumento del livello di danno ulteriore opportunità di studiare la rigenerazione del fegato sarebbe disponibile.

Ci sono anche alcuni limiti di questo approccio. Il primo è il costo di start-up. L'acquisto di un microscopio operatorio potrebbe essere un significativo costo di avviamento per un laboratorio che non dispone già possiede uno. Questa tecnica può essere difficile o impossibile senza un microscopio. La seconda volta è l'apprendimento della curva. Anche se questa procedura è relativamente semplice ma richiede una certa pratica ed è probabile che un novizio richiederà un numero significativo di procedure per diventare un esperto.

In sintesi, questo modello consente una piattaforma riproducibili, semplice e conveniente per studiare epatica danno da ischemia-riperfusione. Anche se nel protocollo qui descritto polietilene glycol-superossido dismutasi, uno scavenger di radicali liberi 25, è stata infusa, questo modello potrebbe essere utilizzato per infondere una varietà di diverse sostanze farmacologiche al fine di valutare il loro impatto sulla lesione di I / R nel fegato.

Disclosures

Tutti gli autori segnalare non hanno informativa.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere Dennis Mathias per il suo lavoro illustrativo. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH T32AI 106704-01A1 e il Fondo T. Flesch per trapianto di organi, di perfusione, Ingegneria e rigenerazione presso l'Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

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References

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