Détermination de la surface de la cellule relative et d'expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

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Biology

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Summary

les arythmies cardiaques héréditaires sont souvent provoquées par des mutations qui modifient la distribution de surface d'un ou plusieurs canaux ioniques. Ici, on adapte les essais de cytométrie en flux pour fournir une quantification de l'expression de la protéine totale et de la surface cellulaire relative des canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules 201 TSA.

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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Abstract

Introduction

Ce document fournit un test fiable pour signaler l'expression relative de la surface cellulaire des protéines membranaires telles que des canaux ioniques exprimés dans les cellules recombinantes en utilisant la technologie de cytométrie de flux existant. Les canaux ioniques sont des protéines membranaires porogènes qui sont responsables de la commande des signaux électriques par gating le flux d'ions à travers la membrane cellulaire. Ils sont classés par le mécanisme d'activation, la nature et la sélectivité des espèces d'ions qui transitent à travers le pore où ils sont localisés. Au niveau cellulaire et tissulaire, les flux ioniques macroscopiques à travers les canaux ioniques sont le produit de biophysique propriétés 1 (gating et perméation), biochimique (phosphorylation), et la biogenèse (synthèse, glycosylation, le trafic et la dégradation). Chacun de ces processus est unique pour tous les types de canaux ioniques et elle est optimisée pour remplir le rôle physiologique du canal ionique. Par conséquent, des modifications dans l'un de ces processus affiné grâce à unhéréditaire ou une modification génétique, souvent appelée "canalopathie", peut être préjudiciable à l'homéostasie cellulaire. Il est important de souligner que la prestation du «droit» quantité de canaux ioniques à la surface cellulaire est essentielle pour l'homéostasie cellulaire. Même de petites augmentations (gain de fonction) et de petites diminutions (perte de fonction) dans l'activité des canaux ioniques ont le potentiel de provoquer une pathologie grave au cours d'une vie. Défauts dans la livraison de la surface cellulaire des canaux ioniques matures est un déterminant important dans de nombreux channelopathies, comme la fibrose kystique (canal ionique CFTR) 2 et les arythmies cardiaques de la forme longue de syndrome du QT (canaux potassiques cardiaques) 3.

Channelopathies sont associés à la mort subite cardiaque 4. La prévalence mondiale actuelle de tous les channelopathies cardiaques est considéré comme au moins 1: 2,000-1: 3.000 par personne 5 et sont responsables d'environ la moitié d' un coup arythmique cardiaque mort caSES 6. Dysfonction cardiaque en voltage-dépendants de sodium, de potassium et de calcium canaux ioniques sélectifs sont connus pour jouer un rôle clé dans ce processus. Le 1.2 canaux calciques voltage-dépendants de type L Ca V est nécessaire pour engager synchronisé coeur la contraction musculaire. L cardiaque de type Ca 1,2 V de canal est un complexe protéique sous-unités multiples composée de la sous - unité principale Ca porogène V α1 et Ca Vss et Ca V α2δ1 sous - unités auxiliaires 7-12. Notez que la liste complète des sous - unités auxiliaires est nécessaire pour produire fonctionnels Ca V 1.2 canaux à la membrane plasmique et les interactions dynamiques entre ces sous - unités sont essentiels pour soutenir la fonction électrique normale du cœur 13. Ca Vss favorise l'expression de surface cellulaire de Ca 1,2 V canaux à travers une nanomolaire interaction hydrophobe non covalente 14. Co-expression de la Ca V sous - unité α2δ1 wiCa th Ca V ß lié V α1 stimule l' expression du courant de crête (5 à 10 fois) et favorise l' activation du canal à des tensions négatives. Gain de fonction des mutations de la sous - unité de formation de pores Ca V 1.2 ont été associés à une forme d'arythmie ventriculaire appelé le syndrome du QT long 15 tandis qu'une foule de mutations ponctuelles dans les trois principales sous - unités formant le type L Ca V 1.2 canaux ont été identifiés chez des sujets souffrant d'arythmies du QT court formulaire de syndrome 16,17. Les canaux ioniques sont des protéines membranaires qui peuvent être étudiés du point de vue biochimique (chimie des protéines) ou à l'aide d'outils électrophysiologiques (machines génératrices de courant) et souvent l'aide de ces approches complémentaires. Électrophysiologie, notamment la cellule entière patch-serrage, est une approche appropriée pour élucider la fonction des canaux ioniques 15 mais ne peut pas résoudre des modifications dans le trafic de protéines à partir des changements dans leur biophysiquePropriétés. la chimie des protéines a cependant souvent un usage limité en raison de la relativement faible expression de grandes protéines de la membrane par rapport aux protéines solubles plus petits. méthodes à haut débit robustes en utilisant la fluorescence de lecture doivent être développées afin de traiter spécifiquement les défauts de la protéine biogenèse provoquant des changements dans l'expression de la surface cellulaire des canaux ioniques.

La cytométrie en flux est une technologie biophysique employée dans le comptage des cellules, le tri, la détection de biomarqueurs et l' ingénierie des protéines 18. Lorsqu'une solution de cellules vivantes ou des particules de l' échantillon est injecté dans un cytomètre de flux, les cellules sont ordonnées en un flux unique qui peut être sondé par le système de détection de la machine (figure 1). Le premier instrument cytomètre produit en 1956 19 un seul paramètre détecté , mais cytomètres de flux modernes ont de multiples lasers et les détecteurs de fluorescence permettant la détection de plus de 30 paramètres fluorescents 20,21.Filtres et miroirs (optique d'émission) dirigent la diffusion de la lumière ou de la lumière fluorescente de cellules à un réseau électronique (photodiode et détecteurs) qui convertissent la lumière proportionnellement à son intensité. Les données numériques sont analysées à l' aide de logiciels spécialisés et la sortie primaire est affiché comme un complot point 21.

Figure 1
Figure 1:. Principes biophysiques des flux de tri cytométrie Les cellules individuelles sont poussées à travers une buse sous haute pression dans un courant de fluide de gaine qui les déplace à travers un ou plusieurs points d'interrogation laser. Le faisceau lumineux est dévié par les cellules qui passent et la lumière collectée dans le sens avant (Forward Scatter, FCS) est envoyé à une photodiode qui convertit la lumière en un signal proportionnel à la taille de la cellule. La lumière est également recueillie à un angle de la trajectoire du laser 90 ° et envoyé aux détecteurs (également appelés photomultiplicateurs (PMT)).Cette lumière est acheminée à travers des miroirs dichroïques qui permettent la détection du signal de diffusion latérale (SSC), qui reflète la granularité dans les cellules, et les émissions fluorescentes si fluorochromes excités sont présents dans la cellule. Trois détecteurs (vert, jaune et rouge) sont représentés avec différents filtres de longueur d'onde de bande passante, ce qui permet la détection simultanée de différents fluorochromes. Les différents signaux sont numérisés par un ordinateur externe et converties en données qui seront analysées afin de quantifier les caractéristiques des cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La capacité à haut débit de cytomètres de flux a été exploité pour quantifier l'expression membranaire relative de type sauvage recombinant et de type L voltage-dépendants trafic déficient Ca V 1.2 canaux et sous - unités associées à des cellules vivantes. constructions d'ADNc de coding pour les protéines ont été doublement marquées pour transporter simultanément un épitope extracellulaire non fluorescent qui peut être détecté par un anticorps conjugué fluorescent imperméable et un fluorophore intracellulaire qui est constitutivement fluorescente. À la fois l'épitope extracellulaire, inséré dans une boucle extracellulaire de la protéine, et le fluorophore intracellulaire, après avoir inséré l'extrémité C-terminale, sont convertis avec la protéine. Dans cette série d'expériences, la protéine V α2δ1 Ca a été conçu pour exprimer une hémagglutinine extracellulaire (HA) épitope (YPYDVPDYA) détectée par un matériau imperméable au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) conjugué à anti-HA et mCherry comme fluorophore intrinsèque intracellulaire. Pour déterminer le niveau d'expression de surface cellulaire relative du V α2δ1 mCherry-Ca protéine HA étiquetée, des cellules recombinées exprimant la protéine de fusion ont été récoltées après la transfection, et colorées avec l'anticorps monoclonal de souris anti-HA étiquette d' épitope Antibod conjugué au FITCy (Figure 2). FITC est un composé organique fluorescent qui est considérablement plus petite que les journalistes enzymes et donc moins susceptibles d'interférer avec la fonction biologique. mCherry- Ca V α2δ1-HA surexprimé dans Tsa-201cells, produit une augmentation de 3 log significative de la fluorescence FITC et mCherry fluorescence sur des parcelles en deux dimensions 22. Etant donné que l'épitope HA est situé dans la partie extracellulaire de la protéine, l'intensité de fluorescence FITC obtenue en présence de cellules intactes reflètent l'indice relatif de l'expression de surface cellulaire de la protéine HA étiquetée. L'accessibilité de l'épitope HA dans les constructions est systématiquement validée en mesurant le signal FITC après perméabilisation cellulaire. Cette mesure permet aussi de confirmer l'expression de la protéine totale normalisée depuis les intensités de fluorescence relatives pour FITC estimées dans les cellules perméabilisées sont qualitativement comparables aux valeurs de fluorescence relative for mCherry mesurée sous perméabilisées et non perméabilisées conditions 22,23. Il est important de noter que le spectre de fluorescence intrinsèque est déplacée vers des valeurs plus élevées après perméabilisation, mais que la seule valeur étant rapportée est la variation de l'intensité de la fluorescence par comparaison avec la construction témoin. Les changements relatifs à l'intensité de fluorescence pour les constructions d'essai sont estimées en utilisant l'intensité ΔMean Fluorescence (de ΔMFI) des valeurs pour chaque fluorophore (mCherry ou FITC). Les expériences sont conçues pour mesurer l'intensité de la fluorescence du produit d'assemblage de test par rapport à l'intensité de fluorescence du produit d'assemblage de commande exprimée dans les mêmes conditions expérimentales pour limiter les variations de la fluorescence intrinsèque de l'anticorps conjugué à un fluorophore. Deux protéines de la membrane ont été étudiés avec succès en utilisant ce dosage: la sous - unité formant des pores du canal calcium de type L voltage-dépendants Ca 1,2 V 14,22 et dans une autre série d'expériences, l'auxiliaire extracellulaire Ca V α2δ1 sous - unité 22,23. Le protocole suivant a été utilisé pour déterminer l'expression de surface cellulaire de la sous - unité V α2δ1 Ca du type L cardiaque Ca V 1.2 canal dans des conditions de contrôle et d' après des mutations affectant la modification post - traductionnelle du canal ionique. Dans des conditions expérimentales normalisées, la fluorescence à la surface cellulaire de FITC augmente quasi linéairement avec l'expression de l' ADNc codant pour les mCherry-Ca V protéines α2δ1-HA (figure 5 de la référence 22).

Figure 2
Figure 2:. Représentation schématique de l' étiquetage totale et de la membrane dans la cytométrie protocole expérimental Le schéma décrit quelques - unes des principales mesures nécessaires pour quantifier l'expression relative totale et surface cellulaire des canaux ioniques recombinantes par flow cytométrie. Les cellules sont transfectées avec la construction double marquage mCherry-Ca V α2δ1-HA dans Tsa-201 cellules (1) et colorées avant ou après perméabilisation (2). Les données multiparamètres sont acquises dans un cytomètre de flux (3) pour l' analyse multivariée (4). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

1. constructions Doublement ADN Tagged

  1. Insérer l'épitope HA (YPYDVPDYA) dans le segment de liaison extracellulaire du Ca V α2δ1 entre D676 et R677 par mutagénèse dirigée (figure 3B) 20. Utilisez gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Amorce et Reverse acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
  2. Sous - cloner la séquence d'ADNc de HA V Ca α2δ1 étiqueté dans le vecteur d'expression de mammifère pmCherry-N1 conçu pour exprimer la protéine fusionnée à l' extrémité N-terminale de mCherry entre les sites Sacl et Sali (figure 3B) 20.
    REMARQUE: La fonction de canal approprié doit être testé avec la construction de commande en utilisant des méthodes standards électrophysiologiques 24.

2. liposome Transfection transitoire (30 min, toutes les étapes sont réalisées sous Hotte à flux laminaire)

  1. Jour 1: Plaque d'un demi-million de Tsa-201 cellules (ou Hekt) dans35 mm des boîtes de culture avec du milieu essentiel minimum élevé de glucose de 2 ml de Dulbecco (DMEM-HG) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de milieu (PS) culture de la pénicilline-streptomycine. Compter les cellules en utilisant un hématimètre standard. Évaluer la viabilité des cellules à partir d'une fraction de l'échantillon de cellules en utilisant du bleu Trypan. suffisamment de cellules de plaques pour atteindre 90% de confluence au moment de la transfection.
  2. Jour 2: Changement milieu de culture avec 2 ml de pré-chauffé (37 ° C) milieu de culture frais sans PS.
  3. Pour chaque échantillon de transfection, on prépare deux tubes de 1,5 ml. Dans le tube 1, diluer 4 pg d'ADN dans 250 ul de milieu sérique réduit. Dans le tube 2, mélanger 10 ul du réactif de transfection médiée par des liposomes avec 250 ul de milieu de culture sérum réduit. Mélanger délicatement le réactif de transfection avant utilisation.
  4. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  5. Combiner le contenu du tube 1 et le tube 2, mélanger doucement et incuber au moins 20 min à température ambiante.
  6. Ajouter les liposomes / DNA complexes aux cellules en culture et en douceur roche la boîte de culture pour mélanger.
  7. Incuber à 37 ° C sous 5% de CO 2 , l' atmosphère pendant 24 heures.

3. Coloration des cellules pour cytométrie de flux (3 h)

  1. Préparation des échantillons de cellules
    1. Jour 3: Supprimer moyen de la boîte de culture avec soin et laver les cellules avec 400 pi de préchauffé (37 ° C) 0,05% de trypsine-EDTA 1x (acide éthylènediaminetétraacétique).
    2. Ajouter 400 pi de trypsine-EDTA et incuber le plat à 37 ° C sous 5% de CO 2 atmosphère pendant 5 min pour permettre aux cellules de se détacher de l'antenne.
    3. Mettre un terme à la digestion enzymatique par addition de 1 ml de milieu de culture froid sans PS et laver toutes les cellules de la surface par un léger pipetage 4-5 fois. Évitez de trop digestion et over-pipetage pour réduire la mort cellulaire.
    4. Recueillir les cellules dans 1,5 ml tubes et placer immédiatement sur la glace. Utiliser des solutions froides de glace et de maintenir les cellules à 4 ° C pour empêcher l'intériorisationdes antigènes de surface. Diminution de l'éclairage pour limiter photoblanchiment du signal fluorescent.
    5. Tubes à centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant.
    6. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour préparer une suspension cellulaire unique.
    7. vortex brièvement les tubes très doucement et répétez les étapes 3.1.5 et 3.1.6 pour supprimer complètement le milieu de culture.
    8. Remettre en suspension le culot dans 600 pl de PBS 1x et ajuster la concentration cellulaire à un minimum de 3 x 10 6 cellules / ml.
    9. Diviser les cellules dans deux nouveaux tubes de 1,5 ml pour la coloration extracellulaire et intracellulaire. Inclure des contrôles appropriés pour discriminer une coloration spécifique de la coloration non spécifique.
      NOTE: L'anticorps de contrôle d'isotype permet d'évaluer le niveau de coloration de fond et doit correspondre idéalement les espèces hôtes, isotype et fluorophore de chaque anticorps primaire. Utilisez le contrôle isotypique et de l'anticorps conjugué à la mêmeconcentration en protéines.

Tableau 1
Tableau 1: cytométrie de flux d' échantillons de contrôle de test pour la non-perméabilisées et perméabilisées cellules Chaque expérience doit inclure les témoins négatifs suivants:. (1) des cellules non transfectées (sans anticorps, avec l'isotype ou avec l'anticorps conjugué). (2) Les cellules transfectées avec la protéine d'intérêt sous - cloné dans un plasmide constitutif sans fluorochrome intracellulaire fluorescent (V pCMV Ca α2δ1-HA) ou avec la construction doublement étiquetée (V pmCherry-Ca α2δ1 et mis à incuber sans anticorps, avec l'isotype ou l'anticorps conjugué). Simples contrôles de couleur sont utilisés pour la compensation de chevauchement des émissions fluorochrome. Les mêmes contrôles sont exécutés pour les non perméabilisées et perméabilisées conditions dans chaque série d'expériences.

  1. Coloration de surface cellulaire d'Intactcellules vivantes
    1. Aliquote de 1 x 10 6 cellules / 100 ul dans des tubes de 1,5 ml.
    2. Ajouter l'anticorps monoclonal conjugué à FITC anti-HA à 5 pg / ml et, vortex avant l'incubation des cellules sur une plate-forme de bascule (200 tpm) dans l'obscurité à 4 ° C pendant 45 min.
      REMARQUE: La concentration optimale de l' anticorps a été déterminée dans des expériences préliminaires de titrage (Figure 4).
    3. Retirer les cellules de l'obscurité et ajouter 900 ul de 1 x PBS / tube. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 1 ml de PBS 1x, vortex et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    5. Répétez le lavage (étape 3.2.4) deux fois pour éliminer tout anticorps non lié. Si un anticorps primaire non conjugué est utilisée, laisser incuber avec l'anticorps secondaire approprié.
    6. Après le lavage final, la remise en suspension des cellules dans 500 ul de 1 x PBS et transférer la suspension monocellulaire dans 5 ml cytométrie de flux des tubes. Gardez la cellules dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que l'exécution de l'échantillon.
    7. Exécutez les échantillons sur un cytomètre de flux. Pour de meilleurs résultats, analyser les cellules sur la cytométrie de flux le plus tôt possible et au plus tard 24 heures après.
  2. Coloration intracellulaires: Fixation, perméabilisation et Coloration
    1. Aliquoter 1 x 10 6 cellules / 100 ul dans 1,5 ml tubes et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    2. Jeter les cellules surnageant et remettre en suspension dans 100 pi de solution de fixation-perméabilisation directement du stock.
    3. Incuber dans l'obscurité à 4 ° C pendant 20 min.
    4. Ajouter 100 ul de 1 x tampon de perméabilisation-linge fraîchement préparé (diluée 10 x tampon de perméabilisation-lavage à l' eau distillée 2 O). cellules Vortex et de sédiments à l'aide d'une centrifugeuse de table à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    5. Aspirer et jeter le surnageant.
    6. Répétez les étapes 3.3.4 et 3.3.5.
    7. Ajouter anticorps FITC-conjugué monoclonal anti-HA à 5pg / ml dans 100 pi de 1 x tampon de lavage et perméabilisation-vortex, avant l'incubation des cellules dans l'obscurité à 4 ° C pendant 30 min.
      REMARQUE: La coloration intracellulaire est réalisée en suivant la même procédure que celle utilisée pour la coloration de la surface cellulaire. cellule perméabilisation saponine médiation est cependant un processus rapidement réversible, il est donc important de remplacer 1x PBS avec un tampon 1x Perm / Wash pour maintenir les cellules en la présence constante de saponine pendant la coloration intracellulaire.
    8. Retirez les cellules de l'obscurité et d'ajouter un tampon perméabilisation-lavage 100 ul. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre le culot dans 100 ul de tampon perméabilisation-lavage, vortex et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
    10. Répétez le lavage (étape 3.3.9) une fois de plus pour éliminer tout anticorps non lié.
    11. Après le lavage final, remettre en suspension les cellules dans 500 ul de PBS 1x et transférer le péchégle suspension cellulaire à 5 mL flux cytométrie tubes. Maintenir les cellules dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à l'injection de l'échantillon dans le cytomètre de flux.
    12. Exécutez les échantillons sur un cytomètre de flux. Exécutez les échantillons fixés sur le cytomètre dès que possible mais au plus tard 1 semaine après la coloration. Exécuter les cellules non perméabilisées et perméabilisées le même jour.

4. cytométrie de flux

  1. Cytomètre de flux cellulaire Setup Sorter Daily
    1. Allumez le logiciel de cytométrie de flux. Avant d'expérimenter, calibrer et configurer le cytomètre de flux trieur de cellules pour assurer une performance optimale de l' instrument (c. -à- laser et de l' optique sont performants à la spécification, le laser et le débit cellulaire sont correctement alignés) en utilisant des perles de configuration de l' appareil.
    2. Utilisez la buse de 100 um avec la pression de la gaine 20 psi.
      NOTE: La buse ne doit pas être modifiée sur un banc cytomètre de flux.
    3. Réglez le débit du cytomètre selon la fabrispécification er. Très hauts débits diminuent la sensibilité de la détection des variations de fluorescence.
    4. Sélectionnez bleu (488 nm pour exciter la fluorescéine Isothiocayanate ou FITC) et jaune-vert (561 nm pour exciter mCherry) lasers. Collecter les niveaux de fluorescence FITC et mCherry avec un nm 530/30 et avec respectivement un 610/20 nm filtre passe-bande.
    5. Acquérir la diffusion vers l'avant (FCS) par rapport à la diffusion latérale (SSC) tracé de points pour les cellules non colorées à l'aide de l'échelle linéaire. Ajustez l'amplification de chaque détecteur pour visualiser les cellules dans le quadrant inférieur gauche du tracé de points.
  2. Lecture des échantillons de cellules intactes non-perméabilisées
    1. Définir la P1gate pour les cellules vivantes non perméabilisées en définissant une forme libre autour des cellules à analyser l'exclusion des débris cellulaires et des agrégats de cellules, limitant ainsi le signal de fluorescence pour des cellules intactes.
      NOTE: direct / morts colorants d'exclusion peuvent être utilisés pour faciliter le placement de grille sur les cellules vivantes. Définir 10.000 événements pour enregistrerdans le portillon d'arrêt P1. Réglez ce paramètre sur un nombre plus élevé d'événements si besoin est.
    2. Acquérir mCherry contre FITC à deux paramètres tracé de contour pour détecter autofluorescence base de cellules non colorées. Utilisez l' échelle bi-logarithmique pour afficher les valeurs négatives et améliorer la résolution entre les populations 25. Régler la tension de chaque détecteur pour définir les cellules négatives non colorées dans la partie inférieure des dix premières unités des parcelles d'intensité de fluorescence du journal.
    3. Acquérir tous les échantillons intacts non perméabilisées en utilisant les paramètres établis dans 4.1.5 et 4.1.6 et de recueillir FSC, SSC et des signaux dans les détecteurs de fluorescence.
    4. Exporter et enregistrer des fichiers * .fcs à utiliser pour l'analyse à l'aide de cytométrie de flux logiciel d'analyse.
  3. Lecture des échantillons de cellules perméabilisées
    1. Déplacer la porte P1 pour sélectionner des cellules vivantes dans les échantillons perméabilisées et ajuster FSC et de la tension SSC comme indiqué dans 4.1.5 et 4.1.6.
    2. Acquérir tous les échantillons perméabilisées et recueillir FSC, SSC asignaux nd dans les détecteurs de fluorescence.
    3. Exporter et enregistrer des fichiers * .fcs à utiliser pour l'analyse à l'aide de cytométrie de flux logiciel d'analyse.
  4. L'analyse des données
    1. Lancer le flux cytométrie fichiers logiciels d'analyse et de l'importation * .fcs enregistrés dans 4.2.4 et 4.3.3.
    2. Cliquez sur le premier échantillon répertorié dans la fenêtre d'espace de travail. Une nouvelle fenêtre nommée d'après le nombre tube ID ouvre automatiquement. Démarrer le processus de déclenchement dans la parcelle de SSC par rapport FSC. Dessinez une porte (P1) en utilisant l'icône Ellipse autour des cellules vivantes et d'éliminer tous les débris, les cellules mortes, ou des agrégats qui ont différentes diffusion vers l'avant et la diffusion latérale que les cellules vivantes
    3. Pour dessiner le contour tracé à deux paramètres de l'mCherry (y de l'axe) par rapport à FITC (axe-x) l'intensité de fluorescence des cellules vivantes, cliquez d'abord sur l'axe des x et choisissez-A FITC canal, puis cliquez sur le y -axis et choisissez le-mCherry-A PE canal. Cliquez sur l'icône "Quad" pour positionner le marqueur quadrant au bord d'unutofluorescent cellules dans chaque canal de fluorescence.
      NOTE: La porte fixé autour des cellules positives FITC et mCherry est la porte P2. Négative population de cellules à fluorescence est appelée la porte P3. Voir la figure 5 pour la méthode de déclenchement représentatif utilisé dans cet article.
    4. Sélectionnez P2 et P3 portes et cliquez sur l'icône "Ajouter Statistiques" dans la fenêtre de l'espace de travail d'origine. Cliquez sur "Count" (nombre de cellules positives) et cliquez sur "Moyenne" (Mean Fluorescence Intensity de chaque fluorochrome) ou "médian" (médian Fluorescence Intensity de chaque fluorochrome) statistiques parmi la liste des options. Cliquez sur l'icône "Ajouter Statistiques" à nouveau. Toutes ces valeurs sont transférées automatiquement dans la fenêtre de l'espace de travail d'origine.
      NOTE: La «moyenne» est utilisé seulement si l'intensité de fluorescence suit une distribution normale. Dans tous les autres cas, cliquez sur l'onglet "médian". MFI pourrait donc se référer à Mean Fluorescence Intensity ou médian intensité de fluorescence.
      REMARQUE: L'étape suivante consiste à appliquer les paramètres et statistiques des portes à tous les échantillons testés par le cytomètre.
    5. Dans la fenêtre d'espace de travail, utilisez la souris pour faire glisser et déposer les portes et les statistiques des paramètres sur la ligne marquée tous les échantillons.
    6. Générer un rapport de lot de parcelles à deux dimensions contour (mCherry vs FITC) et histogrammes (nombre de cellules par rapport à l' intensité de fluorescence) pour les cellules non perméabilisées et perméabilisées (figures 6A - B).
    7. D'après les statistiques générées à l'étape 4.4.4, calculer l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) pour chaque fluorochrome pour les cellules colorées. A partir de cette valeur, on soustrait la valeur MFI obtenu à partir de cellules non colorées pour quantifier la surface et l'expression totale de la protéine d'intérêt.
    8. Signaler les valeurs ΔMFI pour chaque fluorophore (mCherry et FITC) (Figure 6C - D). Normaliser l'ΔMFI mesurée pour le Ca NOTE: La valeur absolue de l'intensité de fluorescence peut varier fortement en fonction du lot d'anticorps et les capacités techniques de chaque travailleur de laboratoire, d'où la nécessité de normaliser l'intensité de fluorescence de la construction mutant en utilisant la construction de WT.

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Representative Results

Cet article décrit un protocole fiable pour quantifier la surface totale et cellulaire des canaux ioniques recombinantes exprimées dans Tsa-201cells par un flux à deux couleurs cytométrie dosage. A titre d'exemple, la surface de la cellule par rapport et une expression de protéine totale a été quantifiée pour le V Ca α2δ1subunit. Afin d'effectuer le flux en deux couleurs cytométrie test, Ca V α2δ1 a été doublement marqué à exprimer une HA épitope non fluorescent extracellulaire qui peut être détectée par un anticorps anti-HA conjugué à FITC et un mCherry intracellulaire fluorescent fluorophore constitutive. Les spectres d'excitation et d'émission pour les FITC et mCherry montrent que le FITC est excité avec 88% de rendement par le laser à 488 nm, mais l'efficacité diminue jusqu'à 0% avec le laser à 561 nm. Le mCherry représente 63,9% de sa fluorescence maximale quand il est excité par le laser 561 nm , mais seulement 7,6% avec le laser 488 nm (Figure 3). L'excitation et l'émission spectra pour les deux fluorophores présentent la collecte optimale de la lumière et un chevauchement minimal avec les différents lasers et les filtres sélectionnés. Cytométrie de flux des essais pourraient fournir des informations quantitatives sur l'expression relative des protéines membranaires d'une grande population de cellules aussi longtemps que l'IMF pour le fluorochrome donné est directement proportionnelle à l'expression de la protéine de Ca V α2δ1 sur chaque cellule plutôt que le nombre de cellules fluorescentes. Cela implique l'utilisation d'une concentration d'anticorps par fluorescence conjugué au-delà de la saturation. La courbe de titrage de l'anticorps anti-HA conjugué à FITC de liaison à Ca α2δ1 V (figure 4) montre trois phases. Même si aucune fluorescence n'a été détectée dans la première phase, l'intensité de fluorescence augmente exponentiellement avec l'augmentation de la concentration d'anticorps dans la seconde phase. Après que le point de saturation (troisième phase), ce qui augmente la concentration de l'anticorps n'a pas d'effet sur la fluorescence par rapport intensité (RFI) de FITC. Le point de saturation d'anticorps anti-HA conjugué au FITC a été établi à 5 pg / ml, ce qui garantit que la concentration du conjugué anticorps ne limite pas l'IMF au cours des expériences.

Le Ca V marqué α2δ1was exprimé en Tsa-201cells et cytométrie en flux des essais ont été effectués en présence du FITC conjugué anti-HA dans des cellules non perméabilisées (figure 5). Des contrôles appropriés (tableau 1) ont été analysés sur le cytomètre de flux qui attribue des valeurs xy pour chaque cellule passant à travers le faisceau laser. La distribution des cellules est visualisée sur tracés de points (figure 5A). FCS / SSC parcelles de points confirment que la préparation d'échantillons de cellules fournit une suspension cellulaire unique avec une viabilité élevée (Figure 5Ba). La porte sélectionnée pour les cellules vivantes (P1) représente 75% du nombre total de cellules analysées. Le total expression de la protéine of Ca V α2δ1 dans Tsa-201 cellules a été considérée comme proportionnelle à la fluorescence mCherry. Comme on le voit dans les mCherry contre FITC tracés de contours et des histogrammes (Figure 5BB - Bc), 47 2% Tsa-201 cellules transfectées avec pmCherry-Ca V α2δ1-HA ont été trouvés pour exprimer de manière significative mCherry fluorescence ainsi que montrant la fluorescence FITC significative en raison de la liaison à l'étiquette HA externe de Ca V α2δ1 dans des cellules non perméabilisées. des expériences témoins négatifs effectués sans anticorps ou avec l'isotype indiquent que le FITC se lie uniquement ou principalement sur les cellules transfectées de façon positive.

Ce protocole a été utilisé pour caractériser le rôle de N-glycosylation sur l' expression totale et surface cellulaire de Ca V α2δ1 dans Tsa-201cells 23. Des expériences ont été effectuées dans des cellules non perméabilisées pour évaluer l'expression de surface cellulaireet dans les cellules perméabilisées pour évaluer l'expression totale des protéines ainsi que de confirmer l'accessibilité de l'épitope HA. Expression relative de Ca V α2δ1 a été calculé sur la base de l'IMF estimée pour chaque fluorophore (mCherry ou FITC). Les valeurs de ΔMFI pour les mutants ont été normalisés par rapport à la valeur maximale mesurée pour le même jour mCherry-Ca α2δ1 V-HA WT exprimé dans les mêmes conditions. Il est important de tenir compte des variations dans le temps de l'intensité de fluorescence absolue de l'anticorps conjugué au FITC anti-HA. Comme on le voit sur la figure 6A, le ΔMFI FITC dans les cellules non perméabilisées a été forte pour le WT et le 4xNQ construire mais proche du niveau de fluorescence de base pour la construction 16xNQ indiquant que la protéine est pratiquement absente de la membrane plasmique. Des essais effectués après perméabilisation cellulaire, ont montré que l'expression de protéine totale de la construction 16xNQ a également diminué de manière significative si elleon déduit de la fluorescence FITC dans les cellules perméabilisées ou de la fluorescence mesurée dans mCherry constitutive non perméabilisées et dans les cellules perméabilisées (figure 6C - D). Comme on le voit sur la figure 6B, les niveaux d'autofluorescence cellulaire a augmenté après perméabilisation des cellules, ce qui empêche la comparaison des valeurs de fluorescence absolues entre des cellules intactes non-perméabilisées et perméabilisées. La fluorescence de ΔMFI mesurée pour mCherry était similaire pour les deux cellules non perméabilisées et perméabilisées signifiant que la solution de perméabilisation ne modifie pas le signal de fluorescence relative de mCherry. Les mutations des sites de N-glycosylation a été associée à une diminution de l'intensité de fluorescence pour mCherry supporter l'observation que la protéine publiée biogenèse / stabilité a été réduite 23. Dans cette série d'expériences, le signal de fluorescence par rapport à la FITC mesurée dans des cellules perméabilisées avéré be encore plus petit que le signal relatif à mCherry ce qui suggère que l'état de glycosylation de type N de la protéine pourrait influencer l'intensité de fluorescence détectée par l'anticorps anti-HA conjugué au FITC dans le domaine extracellulaire. Au total, les variations de la fluorescence relative de FITC avant après perméabilisation des cellules fournissent une mesure fiable pour quantifier l'expression de la protéine.

Figure 3
Figure 3: FITC et mCherry forment une paire de fluorochromes adapté à deux couleurs des essais de cytométrie Excitation (Courbes vides) et des spectres d'émission (courbes pleines) pour FITC excité avec 488 nm laser bleu (Aa) et mCherry excité avec 561 nm jaune-. laser vert (Ab). mCherry FITC et la fluorescence ont été recueillies avec une 530/30 nm et une 610/20 nm bandpass filtres, respectivement. La longueur d'onde des lasers différents (lignes verticales de couleur) et les filtres (rectangles colorés) sont choisis pour la collecte optimale de la lumière et le chevauchement minimal. (B) Représentation schématique du mCherry-Ca V protéine α2δ1-HA. Ca V α2δ1 a été doublement marqué à exprimer une HA épitope non fluorescent extracellulaire qui peut être détectée par un anticorps anti-HA conjugué à FITC et un mCherry intracellulaire fluorescent fluorochrome constitutive. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Titrage de l' anticorps monoclonal anti-HA conjugué à FITC de liaison à Ca α2δ1 V-201 tsA cellules ont été transfectées transitoirement avec pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA et mis en incubation avec une gamme d'anticorps anti-HA conjugués au FITC ou isotypes. Seul le signal FITC est en cours d'analyse dans ce panneau. (A) Histogrammes un seul paramètre affichent le nombre relatif de cellules sur l'axe des y et l'intensité de fluorescence du FITC sur l'axe x pour la gamme d'anticorps anti-HA conjugué à FITC de concentrations (0,01 à 20 ug / ml). (B) graphique semi-logarithmique pour l'anticorps anti-HA conjugué à FITC en fonction de la MFI FITC. A été équipé La courbe de titrage en utilisant un site de liaison équation avec une valeur de courbe de tendance R 2 = 0,99561. Titration réalisée pour l'anticorps isotype montré aucune fluorescence comme prévu. Les concentrations de 0,001 à 0,01 pg / ml sont indiscernables du bruit de fond. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1 "> Figure 5
Figure 5: flux représentant une analyse de cytométrie de Tsa-201cells non-perméabilisées transfectées avec pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Représentation schématique de la stratégie de déclenchement utilisé en cytométrie en flux échantillon d'analyse.. Les données ont été analysées après acquisition avec le logiciel approprié. La première stratégie de déclenchement exploite une diffusion vers l'avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) de la parcelle de point pour afficher une grille (P1) autour des cellules vivantes et d'éliminer tous les débris, les cellules mortes, ou des agrégats qui ont différentes diffusion vers l'avant et la diffusion latérale que les cellules vivantes . Deux paramètres contour parcelles du mCherry (y de l' axe) par rapport à FITC (axe x) intensité de fluorescence ont été affichées pour la population P1. portes rectangulaires ont été placés au bord de l'autofluorescence des cellules pour sélectionner le P2 positif de la population (FITC et mCherry) et le négatif P3 de la population. Le niveau de fluorescence pour til les cellules dans la région P2 et P3 ont été visualisées en utilisant la cellule suivante compte par rapport intensité de fluorescence unique paramètre histogrammes FITC ou mCherry. Un changement dans l'intensité de fluorescence sur l'axe des x y- et fournit respectivement un indice fiable de l'expression totale et de la membrane de Ca V α2δ1. L'intensité du signal de fluorescence augmente en fonction du nombre de molécules de fluorochrome. (Ba) Représentant FCS / tracés de points SSC pour chaque condition comme indiqué. Un total de 10.000 événements ont été acquis pour l'analyse. La porte de l'ellipse (P1) est tirée par les yeux autour des cellules vivantes hors événements à faible FSC (cellules mortes) ou haute SSC (agrégats). (Bb) représentatifs de deux paramètres contour des parcelles de la (axe y) mCherry contre FITC (axe-x) l' intensité de fluorescence. Gates , ont été placés au bord de l' autofluorescence des cellules pour séparer les populations de cellules positives FITC-mCherry (porte P2 ) et les cellules fluorescentes négatives (P3). (Bc) Single-paramètre histogrammes de comptage relative (ou% du max) cellules par rapport à l' intensité de fluorescence (FITC ou mCherry). La répartition de l'intensité de fluorescence mesurée pour les cellules à l' intérieur de la porte P2 (cellules à fluorescence positive) sont représentés en gris, et la répartition de l' intensité de fluorescence pour des cellules présentes dans la porte P3 (cellules par fluorescence négative) apparaît comme une superposition dans un terrain gris transparent. Comme on le voit, l'intensité de fluorescence a été forte pour les deux mCherry et FITC indiquant que Ca V α2δ1 est bien exprimé et clairement présent à la membrane cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: simultanée des mutations de sites de N -glycosylation perturbé ex surface cellulairepression de Ca V α2δ1. cellules V-201 ß3 tsA Ca stables ont été transfectées transitoirement simultanément avec pCMV-Ca 1,2 V et pmCherry WT-Ca α2δ1 V-HA WT ou mutants. Non perméabilisées (A) et des cellules perméabilisées (B) ont été colorées avec un anticorps anti-HA conjugué à FITC comme décrit ci - dessus. Représentant deux paramètres contour des parcelles de mCherry contre FITC fluorescence (panneaux de gauche) et l' histogramme des parcelles de la distribution de l'intensité de fluorescence pour la coloration d'anticorps conjugué anti-HA FITC (panneaux de droite) sont indiqués pour les mutants de -glycosylation N (NQ) après la perturbation des quatre sites (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) et 16 sites (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) dans des cellules non perméabilisées ou NP intactes (A) et dans des cellules perméabilisées ou P (B). La distribution de l'intensité de fluorescence mesurée pour les cellules à l' intérieur de la porte P2 (cellules à fluorescence positive) sont représentés en gris, et la répartition de l' intensité de fluorescence pour les cellules présentes dans la porte P3 (cellules par fluorescence négative) est affiché sous la forme d' une superposition d'une manière transparente terrain gris. Comme on le voit en (B), les niveaux d'autofluorescence a augmenté après perméabilisation des cellules. L'intensité de fluorescence pour FITC mesurée pour toutes les cellules transfectées perméabilisées a augmenté (considéré comme un déplacement vers la droite sur l'axe des x) indiquant que toutes les protéines V α2δ1 transfectées HA-marqués Ca ont été colorées et détectées par l'anticorps anti-HA FITC. (C) montre le graphique à barres MFI normalisé mesuré en présence de FITC dans (expression de surface) intacte non perméabilisées ou des cellules perméabilisées (expression total). La densité relative de la fluorescence a été mesurée en triple pour chaque condition (30.000 cellules) et en trois lots différents de cellules transfected sur une période de 1 mois où les données sont présentées comme la moyenne ± SEM pour 90.000 cellules pour chaque condition. Le pic d'intensité de fluorescence a été atteint entre 24 et 36 heures après la transfection. Les valeurs de ΔMFI pour FITC mesurées dans des cellules intactes non perméabilisées ont été utilisés comme indice de l'expression de surface cellulaire de Ca V α2δ1-HA, et les valeurs de ΔMFI pour FITC mesurées dans des cellules perméabilisées reflètent l'expression de la protéine totale (surface cellulaire et l' expression intracellulaire des protéines ). ΔMFI FITC a été calculé en soustrayant l'intensité de fluorescence du FITC FITC cellules négatives (P3) à partir de l'intensité de fluorescence des cellules positives au FITC (P2). La même méthode a été utilisée pour calculer le ΔMFI pour mCherry. MFI ont été normalisées à la valeur maximale mesurée le même jour pour mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Bar graphique montre la normalisée ΔMFI mCherry mesurée en non-perméabilisées ou cellules perméabilisées (totexpression al). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Cet essai à base de cytométrie de flux a été appliqué avec succès à la mesure des niveaux relatifs totale et la surface des cellules des sous - unités marquées par fluorescence porogène et associé à des canaux calciques voltage-dépendants 14,22,26. Il est préférable d'utiliser lors d'enquêtes sur l'impact des mutations génétiques et exige donc que l'intensité de fluorescence intrinsèque du type sauvage construction marqué par fluorescence marqué soit au moins 10 à 100 fois plus grande que pour l'intensité de fluorescence de la construction untagged marqué par fluorescence . Dans ce cas particulier, la V α2δ1-HA construction mCherry-Ca décrit ici a donné un plus grand signal à bruit et une plage dynamique plus grande que ce qui a été mesuré pour la Ca V précédemment publié 1,2 HA et Ca V 2.3-HA constructions. Il y a plusieurs raisons imaginables pour cela. On peut imaginer que l'environnement local de l'épitope HA dans le domaine extracellulaire de Ca V &# 945; 2δ1 protéine maximise le rapport signal à bruit de l'anticorps anti-HA conjugué à FITC.

En outre, il est important de garder à l'esprit que cette méthode ne fournit pas une valeur absolue du nombre de protéines à la surface cellulaire. L'expression relative de la construction tagged nécessaire pour obtenir l' expression du canal fonctionnel peut être obtenu en réalisant néanmoins côte à côte patch-clamp et cytométrie de flux des expériences dans les mêmes conditions que représenté sur la figure 7 de la référence 22. A partir de ces données, on peut estimer que la densité de courant de pointe, une mesure globale de l' activité de canal ionique, augmente généralement en fonction de l'expression de surface de la sous - unité Ca V α2δ1 étiquetée. La principale limitation de ce test courant d'expression de surface cellulaire reste qu'il ne peut pas être appliquée à ce moment à l'étude des canaux ioniques endogènes. Ceci est dû au fait que peu d'anticorps disponibles dans le commercesont connus pour se lier spécifiquement à des domaines externes prévus des canaux ioniques. Elle nécessite donc une manipulation génétique de la séquence primaire de la protéine à étudier exprimée dans une lignée cellulaire recombinante non différenciées telles que Tsa-201 cellules.

Les étapes critiques dans l'optimisation de l'essai: L'identification de la paire appropriée de fluorophores, le choix de l'épitope externe, et la localisation du site d'insertion sont cruciales pour le succès de cette méthode parce que l'insertion de l'épitope ne doit pas interférer avec la fonction de la protéine. combinaisons fluorophores différents ont été testés. Deux épitopes externes: l'hémagglutinine (HA) épitope (YPYDVPDYA) et l'épitope bungarotoxine liaison à site (WRYYESSLEPYPD) 27 et trois anticorps conjugués fluorescents imperméables ont été évaluées, à savoir le FITC (isothiocyanate de fluorescéine) -, R-phycoérythrine -, et les PE-Cy7--anticorps conjugués. En outre, plus de 10 insertion différentedes sites pour l'épitope HA externe ont été testés au sein de Ca V α2δ1. En ce qui concerne l'insertion de l'épitope qui nécessite une mutagenèse et des techniques de recombinaison d'ADN dirigée sur un site, il est recommandé de concevoir un minimum de trois ensembles d'amorces dans la même région. Avec 9 résidus, l'épitope HA est un des plus petits épitopes pour lesquels il existe des anticorps fluorescents conjugués disponibles dans le commerce, mais le taux d'insertion de 27 nucléotides de réussite est plus faible que pour une mutation ponctuelle. Motifs tétracystéine (résidus Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) 2 sont des résidus plus petit que l'épitope de HA , mais la fluorescéine en épingle à cheveux liant arsenicale est une membrane de perméation et ne convient pas pour l'analyse des protéines liées à la membrane 28. Des expériences préliminaires ont été menées avec deux fluorophores intracellulaires mCherry et Green Fluorescent Protein (GFP). Trois critères ont été utilisés pour discriminer la paire réussie de fluorophores avec des canaux ioniques: 1) des spectres d'émission des fluorophores besoinsne se chevauchent pas (voir les références 20,21 pour les détails); 2) l'expression de la construction tagged génère un canal ionique fonctionnel dans des cellules recombinantes telles que validées par des procédés électrophysiologiques standards; et 3) l'expression de la construction de commande produit un affichage fluorescent robuste. Si l'un de ces critères est pas remplie, par exemple, si l'insertion de l'étiquette ou le fluorophore interfère avec la fonction de canal, il faut revenir à la case départ et modifier soit le site d'insertion de l'épitope externe et / ou le site d'insertion du fluorophore. Un lieur de résidus 5-glutamine entre le C-terminale de la protéine et le fluorophore pourrait aider à améliorer la fonction des protéines. En outre, il pourrait être utile d'insérer l'épitope externe dans les grandes boucles qui ne sont pas connus pour jouer un rôle crucial dans la fonction des protéines et / glycosylation des protéines. Il faut aussi être conscient des aspects techniques mineurs.

Le taux de transf liposome succèsection dans Tsa-201 cellules pourrait être diminué après l'insertion des deux épitopes au sein de Ca V α2δ1. Par conséquent, il est suggéré de recalibrer l'efficacité de la transfection avec les nouvelles constructions d'ADN. Cela se produit parce que l'insertion d'une protéine de 30 kDa modifie le poids moléculaire de l'ADN. On peut modifier l'ADN au rapport de liposomes à 1: 2 à 1: 3, si nécessaire ou incuber les cellules à 37 ° C pendant une plus longue période de temps (24-72 h). Il est important de choisir la bonne formulation pour perméabiliser les cellules. La plupart des solutions maison expertisés pour ce projet se sont révélés provoquer les cellules d'agréger et de boucher le cytomètre en flux.

Freiner exposition à la lumière pendant que la coloration de la cellule avec l'anticorps fluorophore conjugué est essentiel de limiter photoblanchiment et perte de signal. Pour réduire au minimum fond fluorescent, il est important de centrifuger l'excès d'anticorps conjugué avant l'utilisation. Enfin, il est de la plus haute importance pour analyser til cellules sur la cytométrie de flux, dès que possible et au plus tard 24 heures après. Garder les cellules colorées pendant une nuit à 4 ° C sera probablement réduire le signal et nuire à la survie des cellules. Les variations de la fluorescence intrinsèque de l'anticorps fluorophore conjugué d'un lot à dicter que l'intensité de fluorescence du produit d'assemblage d'essai doit être déclarée comme une fonction de l'intensité de fluorescence du produit d'assemblage de commande exprimé dans des conditions expérimentales identiques.

Pour obtenir un bon signal global par rapport au bruit, il est recommandé de réduire au minimum le pipetage cellulaire pour réduire la mort cellulaire et resuspendre doucement les cellules de telle sorte qu'un 3 x 10 6 cellules / ml sont injectés dans le cytomètre de flux. Attention, une concentration plus élevée de cellules permettra de réduire le flux de cellules et pourrait obstruer l'écoulement cytomètre. D'autre part, une concentration de cellules plus faible, il faudra un temps de traitement plus long. On peut donc avoir à ajuster la concentration en fonction de la type de cellules à analyser.

essais alternatifs: méthodologies supplémentaires déployés pour documenter la présence de canaux ioniques à la surface de la cellule chute de la membrane plasmique dans quatre grandes catégories: 1) les méthodes d'imagerie confocale exploitant l'interaction de haute affinité entre les anticorps fluorophores conjugués et la protéine cible; 2) des techniques de chimie des protéines reposant sur la modification covalente de la protéine cible par des réactifs de biotinylation; 3) mesures électrophysiologiques d'analyse non stationnaire bruit; et 4) l'étiquetage photoaffinité de la protéine cible avec les sondes radioactives. Dans le cas du canal calcique voltage-dépendants, marquage par photoaffinité avec tritiée (±) - [3 H] PN 2-100, un ligand à haute affinité de la famille des dihydropyridines , a été largement utilisé dans les années 1980 31. Il reste un test très sensible , mais implique la manipulation de matières radioactives 31, qui est tombé de mode suivant l'avènementde haute sensibilité de fluorescence et la luminescence des sondes en particulier avec les jeunes chercheurs. En outre, il est impossible de mesurer l'activité du canal ionique en présence de l'antagoniste, de telle sorte que la corrélation entre l'expression et la fonction de surface est au-delà de la portée de cette approche. A l'autre extrémité du continuum expérimental, non stationnaire analyse du bruit des canaux ioniques nécessite des enregistrements gigaseal patch-clamp de haute qualité avec la ligne de base stable pour les enregistrements minute de long. Avec cette approche , on peut extraire le nombre de canaux ioniques ouverts dans une cellule unique à partir de la pente du graphique traçant la variance du bruit en fonction du courant moyen mesuré à un potentiel donné 32-34. Il affiche les mêmes pièges des approches électrophysiologiques standard. Il est une méthode de main-d'œuvre et à faible débit qui nécessite en plus une bonne connaissance de l' analyse spectrale 32-34, pas un aliment de base des biologistes cellulaires. En outre, ce type de analysis identifie le nombre de canaux ioniques actifs (à l'état ouvert) qui pourrait être différent du nombre de protéines totales à la membrane. Marquage des protéines de surface cellulaire avec des réactifs de biotine est un outil relativement efficace pour identifier des protéines présentes sur la membrane du plasma. Cette méthode exploite la modification covalente de protéines membranaires par de la biotine et de plus haute affinité et une haute spécificité de liaison de la biotine à membrane impermeant streptavidine ou avidine molécules non covalente. Cette approche est qualitativement fiable, mais est entravée ou limitée par des problèmes de quantification régulièrement associés à révéler les protéines en utilisant la technique western blot. L' imagerie confocale et ses dérivés sont largement utilisés pour documenter la co-localisation des protéines membranaires à la surface des cellules 35. Qualitative isolement de la membrane plasmatique est encore possible en utilisant des techniques de centrifugation différentielle avec ou sans gradient de saccharose 36. Comme dans le flux de assa cytométrie décrit ci-dessusy, elle repose sur l'interaction très spécifique entre la protéine cible et un anticorps conjugué à un fluorophore. Totale imagerie de fluorescence par réflexion interne , en particulier, est une approche puissante qui pourrait rendre compte de la distribution et le comportement moléculaire des canaux ioniques uniques à la surface de la membrane 37,38. La lecture est certainement accrocheur mais reste une approche de faible volume à faible débit. Tous ces tests ont leur mérite scientifique. Le test basé sur la cytométrie de flux à haut débit est supérieur en termes de lecture et de la reproductibilité des mesures quantifiables, mais nécessite un accès facile aux flux multi-laser cytométrie trieurs de cellules qui font partie des installations de base dans les grandes institutions. lecteurs de plaques à base de fluorescence sont moins chers et plus accessibles, mais le rapport signal sur bruit obtenu, mesurées avec les mêmes constructions dans les mêmes conditions expérimentales était significativement plus faible due en grande partie à un fond de fluorescence plus élevé. Coût de l'un fluorophore conjuguétibodies peuvent également être pris en compte notamment en raison du nombre des expériences de contrôle appropriées qui doivent être transformées avec les constructions d'essai. Variations sur le même thème comprennent la modification de l'anticorps de colorant conjugué fluorescent rentable peroxydase ou la phosphatase alcaline enzyme anticorps rapporteurs de raifort qui l' activité enzymatique peut être dosée par chimiluminescence 29,30.

Conclusion: Les deux couleurs de fluorescence dosages ont été développés pour évaluer l'expression relative de la surface cellulaire des protéines recombinantes exprimées dans des cellules cultivées en utilisant des cytomètres de flux. Bien que seulement deux paramètres fluorescents ont été utilisés dans cet essai en cours, par cytométrie de flux est prête à la détection simultanée de plus de 30 sondes fluorescentes sur une seule cellule, ce qui démontre la grande flexibilité de cette approche. Ce dosage ultrasensible à haut débit peut être adapté pour étudier l'impact des mutations génétiques 22,26 ou MODIFICATI post - traductionnellesons 23, ainsi que l' étude du profil pharmacologique de chaperons pour le trafic de surface de la membrane des protéines techniques 39. L'impulsion de ce protocole est née de la nécessité d'évaluer de manière isolée l'impact des mutations génétiques sur l'expression membranaire des canaux ioniques dans des cellules recombinantes. Il est toutefois important de noter que la gravité du dysfonctionnement du canal mutant dans le modèle des lignées cellulaires ne pas toujours en corrélation avec la gravité des symptômes cliniques chez les porteurs de la mutation 5 en partie à cause d' une combinaison de mutations dans différents allèles pourrait être nécessaire pour déclencher la mort subite cardiaque 40 , 41. Dans ce contexte, cet essai peut être considéré comme fournissant une approximation rapide première étape d'étude des mutations uniques ou multiples dans un seul gène associé à une perte de fonction des mutations 22. Il est cependant plausible d'envisager à l'avenir l'expression du virus médiée par les mêmes constructions dans les cellules différenciées de cardiomyocyte lignée. Dans l'ensemble, par rapport aux autres techniques d'imagerie ou luminescents, cytomètre de flux trieurs manipuler des cellules vivantes en suspension et le rapport d'intensité de fluorescence d'une population de cellules homogène. Ce processus se fait sans la nécessité d' une fixation avec du paraformaldehyde, un processus qui induit une perméabilisation de la membrane plasmique local, même dans des conditions douces 42. L'essai est rapide, spécifique et commode à l'analyse allant jusqu'à plusieurs centaines d'échantillons par jour ouvrable. En plus de l'analyse, les cellules peuvent éventuellement être triés par cytométrie de flux pour évaluer le potentiel fonctionnel des cellules exprimant des taux de la même protéine de membrane supérieurs ou inférieurs.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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References

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