तीन आयामी सुपर Interferometric Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा एफ actin फिलामेंट्स के संकल्प माइक्रोस्कोपी (iPALM)

Biology

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Summary

हम इंटरफेरोमेट्रिक Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (iPALM), एक 3-आयामी एकल अणु स्थानीयकरण सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी विधि के आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में actin cytoskeleton की इमेजिंग के लिए। यह दृष्टिकोण nanoscale ढांचागत सुविधाओं है कि अन्यथा पारंपरिक विवर्तन सीमित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अनसुलझे रहेगा की प्रकाश आधारित दृश्य की अनुमति देता।

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

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Abstract

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट biomolecules के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि, पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, स्थानिक संकल्प विवर्तन से ~ 200 एनएम के लिए छवि विमान और ऑप्टिकल अक्ष के साथ> 500 एनएम के भीतर ही सीमित है। नतीजतन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे गंभीर रूप से कोशिकाओं के भीतर ultrastructural सुविधाओं के अवलोकन में सीमित कर दिया गया है। सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तरीकों का हाल ही में विकास इस सीमा को पार किया है। विशेष रूप से, photoswitchable fluorophores के आगमन स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, जो शक्ति को हल आणविक-लंबाई पैमाने के करीब पहुंच प्रदान करता है सक्षम बनाता है। यहाँ, हम एक तीन आयामी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और अवस्थायाँ इंटरफेरोमेट्री पर आधारित पद्धति, इंटरफेरोमेट्रिक Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (iPALM) कहा जाता है के आवेदन का वर्णन है। इस विधि पर लगभग isotropic संकल्प प्रदान करता हैसभी तीन आयामों में 20 एनएम का आदेश। filamentous actin cytoskeleton visualizing, नमूना तैयार करने और iPALM साधन के आपरेशन के लिए प्रोटोकॉल सहित, यहाँ वर्णित हैं। इन प्रोटोकॉल भी आसानी से निभा सकते हैं और कोशिकाओं में अन्य ultrastructural सुविधाओं के अध्ययन के लिए शिक्षाप्रद हैं।

Introduction

जटिल सेलुलर संरचनाओं के दृश्य लंबे जैविक अंतर्दृष्टि और डिस्कवरी का अभिन्न अंग रहा है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उच्च आणविक विशिष्टता के साथ छवि कोशिकाओं, अपनी शक्ति को हल छवि विमान में ~ 200 एनएम (एक्स, वाई, या पार्श्व आयाम) और> 500 एनएम ऑप्टिकल अक्ष के साथ (जेड, या अक्षीय आयाम) को विवर्तन द्वारा सीमित है सकते हैं, यद्यपि 1,2। इसलिए, ultrastructural सुविधाओं का अवलोकन ऐतिहासिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तक सीमित कर दिया गया है। सौभाग्य से, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का हाल ही में विकास इस सीमा धोखा दिया गया है, 10 में स्थानिक संकल्प को सक्षम करने - 100 एनएम रेंज 1-6। विशेष रूप से, सुपर संकल्प एक अणु स्थानीयकरण, इस तरह के पाम (Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) 4, FPALM (प्रतिदीप्ति Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) 5 (घ) तूफान (प्रत्यक्ष Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी) 6.7, पेंट (के रूप परिवर्णी शब्द से जाना जाता है पर आधारित दृष्टिकोण पोइमेजिंग नेनो स्थलाकृति) 8 के लिए int संचय, GSDIM (जमीन राज्य कमी माइक्रोस्कोपी व्यक्ति आणविक वापसी के बाद) 9, या SMACM (एकल अणु सक्रिय नियंत्रण माइक्रोस्कोपी) 10, साथ ही उनके 3-आयामी (3 डी) जैसे कार्यान्वयन, इंटरफेरोमेट्रिक पाम (iPALM) 11 या 3 डी तूफान 12, कई जैविक संरचनाओं के nanoscale संगठन में उपन्यास अंतर्दृष्टि का खुलासा, न्यूरोनल एक्सोन सहित मूल्यवान किया गया है और 13 synapses, फोकल adhesions 14,15, सेल सेल जंक्शनों 16, परमाणु pores 17 है और centrosomes 18-20, एक ही नाम है।

जो कोशिकाओं के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी संभावित रूप से उपयोगी है में एक और ultrastructural सुविधा actin cytoskeleton है। सेल कोर्टेक्स में filamentous (च) -actin के जटिल meshwork सेलुलर आकार और यांत्रिक गुणों 21 के नियंत्रण में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। संगठन ओएफ एफ actin सक्रिय रूप से और गतिशील हालांकि कई नियामक प्रोटीन है कि दृढ़ता से polymerization, तिर्यक, कारोबार, स्थिरता, और नेटवर्क टोपोलॉजी 22 को प्रभावित विनियमित है। हालांकि, हालांकि एफ actin meshwork वास्तुकला के लक्षण वर्णन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज, छोटे आकार (~ 8 एनएम) एफ actin तंतु की पारंपरिक विवर्तन सीमित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने प्रेक्षण बाधित में यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, actin ठीक संरचना के दृश्य अब तक विशेष रूप से ईएम द्वारा प्रदर्शन किया गया है। यहाँ, हम, पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में एफ actin cytoskeleton visualizing iPALM सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर 3 डी 11,23 में इसकी बहुत उच्च परिशुद्धता क्षमता का लाभ लेने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन। हालांकि iPALM साधन अत्यधिक विशिष्ट है, इस तरह के एक साधन की स्थापना पर अनुदेश हाल ही में 23 में वर्णित किया गया है, जबकि iPALM माइक्रोस्कोप Ho से मेजबानी के लिए उपयोगवार्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट भी कम से कम लागत के साथ अनुसंधान समुदाय के लिए उपलब्ध कराया गया है। इसके अतिरिक्त, नमूना तैयार करने के साथ साथ वर्णित विधि सीधे ऐसी बात फैल समारोह (पीएसएफ) की अविन्दुक defocusing के आधार पर उन के रूप में वैकल्पिक 3 डी सुपर संकल्प दृष्टिकोण, 12 या द्वि-विमान का पता लगाने के 24 है, जो अधिक मोटे तौर पर उपलब्ध हैं के लिए लागू कर रहे हैं।

हम ध्यान दें कि सामान्य तौर पर एकल अणु स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए एक आवश्यक घटक photoswitchable fluorophore 25 है, जो एकल अणु स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए तीन महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा करने की अनुमति देता है: i) उच्च एकल अणु चमक और पृष्ठभूमि संकेतों के विपरीत रिश्तेदार; ii) एक दिया छवि फ्रेम में एकल अणुओं की विरल वितरण; और iii) लेबलिंग आधारभूत संरचना (भी Nyquist शा के रूप में जाना की प्रोफाइल पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त के उच्च स्थानिक घनत्वगैर- नमूने कसौटी), 26। इस प्रकार, संतोषजनक परिणाम के लिए, जोर समान रूप से दोनों नमूनों की समुचित तैयारी पर fluorophore photoswitching अनुकूलन करने के लिए और अंतर्निहित फैटी संरक्षित करने के लिए, साथ ही प्रयोगों के उपकरण और अधिग्रहण पहलुओं पर रखा जाना चाहिए।

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Protocol

1. इमेजिंग नमूना तैयार

  1. चूंकि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेतों fluorophore लेबल से प्रतिदीप्ति के साथ हस्तक्षेप, पहले (DDH 2 हे) de-ionized पानी में उन्हें rinsing और फिर उन्हें संपीड़ित हवा का उपयोग एयर सुखाने के द्वारा coverglasses साफ। इसके बाद 15 सेकंड के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर में प्लाज्मा नक़्क़ाशी प्रदर्शन करते हैं, या उससे अधिक समय यदि आवश्यक है।
  2. बहाव सुधार और iPALM अंशांकन सक्षम करने के लिए, # 1.5 दौर (22 मिमी व्यास) पूर्व साफ coverglasses असंदिग्ध के निशान है, जो विश्वसनीय अंशांकन और बहाव सुधार के लिए के रूप में अत्यधिक photostable fiducials की सेवा के रूप में फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ एम्बेडेड का उपयोग करें। लंबे समय पर्याप्त अधिग्रहण fluorophore घनत्व जमा करने के लिए आवश्यकता के कारण (> 15 - 30 मिनट), नमूना बहाव अनिवार्य है।
  3. प्रत्येक fiducialed coverglass 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में रखें। 15 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में पराबैंगनी (यूवी) विकिरण से उन्हें जीवाणुरहित।
  4. एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में, fibro तैयार10 माइक्रोग्राम / एमएल - एक अंतिम एकाग्रता से 2 बाँझ Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में 1 मिलीग्राम / एमएल fibronectin शेयर समाधान गिराए द्वारा coverglass कोटिंग के लिए nectin समाधान। प्रत्येक DPBS के साथ तीन बार कुल्ला coverglass और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ सेते हैं। बाद में, fibronectin समाधान बाहर निकालना और DPBS के साथ एक बार कुल्ला।
  5. DPBS के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं कुल्ला। 37 डिग्री सेल्सियस पर कुछ मिनट के लिए trypsin के 2 मिलीलीटर तक कोशिकाओं को अलग और ताजा सीरम युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से ~ 10 मिलीलीटर के साथ बुझाने - 1 के साथ सेते हैं। उदाहरण के लिए, मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के लिए, बड़े पोत endothelial संस्कृति बड़े पोत endothelial कारकों और पेनिसिलिन या स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक माध्यम का उपयोग।
    1. एक मशीन 95% आर्द्रता, 5% सीओ 2 पर सेट में fibronectin लेपित coverglass पर कोशिकाओं (विरल घनत्व, थाली <coverglass प्रति 50,000 कोशिकाओं के लिए) replate और बनाए रखने के संस्कृति, और 37 & #176, सी।
  6. एफ actin cytoskeleton के ठीक संरचनाओं के उचित संरक्षण के लिए अच्छा है, बफर अभिकर्मकों 27 के आधार पर बफर समाधान का उपयोग करें।
    1. उदाहरण के लिए, एक 2x शेयर समाधान के रूप PHEM बफर तैयार (120 मिमी पाइप, 50 मिमी HEPES, 20 मिमी EGTA, 4 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.0 KOH के साथ) HEPES का 6.5 जी, EGTA के 3.8 ग्राम, और 190 मिलीग्राम भंग द्वारा पीएच केंद्रित KOH समाधान की dropwise अलावा द्वारा 7.0 करने के लिए समायोजित साथ DDH 2 हे की ~ 300 मिलीलीटर में 2 MgCl; तो, 500 मिलीलीटर मात्रा लाने के लिए DDH 2 हे जोड़ें। , एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग बफर जीवाणुरहित 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान है, और यह 1 पतला: 1 DDH 2 हे के साथ उपयोग करने से पहले।
  7. एफ actin के उच्च घनत्व लेबलिंग के साथ सबसे अच्छा परिणाम के लिए, उपयोग phalloidin ऐसे एलेक्सा स्त्राव 647 सेल replating के बाद वांछित समय बिंदु पर के रूप में जैविक fluorophores, साथ संयुग्मित, इस प्रकार की कोशिकाओं को ठीक:
    1. प्रत्येक संस्कृति से मीडिया को अच्छी तरह से सीई युक्त Aspirateडालूँगा नमूना। धीरे लेकिन जल्दी गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) निष्कर्षण 0.25% ट्राइटन X-100 के साथ PHEM बफर में 0.25% glutaraldehyde युक्त fixatives के 2 मिलीलीटर बांटना। 2 मिनट - 1 के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं। बाद के चरणों के लिए, लगानेवाला के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें या coverglass प्रति बफर शमन, जब तक अन्यथा इंगित।
    2. PHEM बफर में 2.5% glutaraldehyde लगानेवाला के साथ निकासी लगानेवाला बदलें और नमूने 10 के लिए सेते हैं - 12 मिनट। यह और निम्न चरणों सभी कमरे के तापमान पर किया जाता है।
    3. बाहर fixatives महाप्राण और धीरे से उन्हें PHEM बफर के साथ बदलें। झुकाएँ और चक्कर आने धीरे, और फिर PHEM के साथ फिर से धो लें। दो बार दोहराएँ।
    4. Glutaraldehyde से autofluorescence, जो वांछित fluorophores से संकेत डूब कर सकते हैं, एक नया तैयार शमन PHEM में 0.1% की एक जन एकाग्रता में NaBH 4 युक्त बफर के साथ नमूनों सेते बुझा लेते हैं। विपुल बुलबुले मनाया जाएगा। कभी कभी disl धीरे नमूना पकवान नलबुलबुले odge। 10 मिनट - यह 5 के लिए सेते हैं।
    5. बाहर शमन बफर महाप्राण और धीरे PHEM बफर के साथ बदलें। बुलबुले दूर स्पष्ट करने के लिए एक बार कुछ कुल्ला। PHEM के 2 मिलीलीटर में पिपेट बफर और इसे 5 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं। दो बार दोहराएँ और जब किया PHEM बफर में नमूना आराम करते हैं।
    6. DDH 2 ओ के 10 मिलीलीटर - एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश कागज तौलिया का एक टुकड़ा उदारता से 5 से सिक्त साथ गद्देदार का उपयोग कर ऊष्मायन phalloidin के लिए एक नमी कक्ष तैयार स्वच्छ Parafilm की एक बड़ी चादर गीला कागज तौलिया के शीर्ष पर रखें।
    7. लेबल phalloidin के अपेक्षाकृत उच्च लागत के कारण, प्रत्येक लेबलिंग के लिए एक छोटी मात्रा का उपयोग करें। उच्च घनत्व लेबलिंग के लिए, 0.3 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ शुरू करते हैं। PHEM बफर में phalloidin-एलेक्सा स्त्राव 647 का उपयोग कर coverglass प्रति ~ 60 μl तैयार करें।
    8. पिपेट 55 - आर्द्रता चैम्बर में Parafilm शीट पर phalloidin समाधान के 60 μl। ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे नमूना coverg को दूरलड़की। सही सेल युक्त चेहरे नोट करने के लिए सावधान रहें।
    9. जल्दी और धीरे नाजुक शोषक कागज के एक टुकड़े के साथ जोड़ रहा coverglass के किनारे को छूकर अतिरिक्त बफर दूर नल, और फिर Parafilm पर phalloidin समाधान के ड्रॉप पर नीचे का सामना करना पड़ coverglass सेल की ओर जगह है। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले coverglass द्वारा फँस देखते हैं कि सुनिश्चित करें।
    10. आर्द्रता चैम्बर पर कवर रखें। एल्यूमीनियम पन्नी में चैम्बर लपेटें परिवेश प्रकाश से बचाने के लिए, और नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते करते हैं। नमूना कई दिनों के लिए इस हालत में रखा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि नमी कक्ष नम रहता है, तो लंबे समय तक भंडारण की योजना बनाई गई है।
  8. इमेजिंग के लिए पहले, धीरे से एक नया 6 अच्छी तरह से थाली PHEM बफर के 2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से युक्त पर ऊपर coverglass सेल की ओर जगह है।
  9. निम्नलिखित स्टॉक समाधान का उपयोग ऑक्सीजन खा thiol आधारित इमेजिंग बफ़र्स तैयार: 1 एम ग्लूकोज, 1 एम cysteamine, और 100x ग्लूकोज oxidase / catalase एंजाइम mixtUre (catalase की 4 मिलीग्राम और PHEM बफर के 100 μl, vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित में ग्लूकोज oxidase के 10 मिलीग्राम), 28। इमेजिंग से पहले ही सही, 1 एम ग्लूकोज समाधान के 75 μl, 1 एम cysteamine समाधान के 30 μl, और 100x शेयर एंजाइम मिश्रण के 3 μl मिश्रण। PHEM बफर के साथ 300 μl के लिए मात्रा समायोजित करें और नमूना माउंट करने के लिए मिश्रण के बाद तुरंत उपयोग करें।
  10. iPALM के लिए, एक पूर्व साफ # 1.5 coverglass (22 मिमी व्यास) का उपयोग इमेजिंग नमूना तैयार करते हैं।
    1. वैकल्पिक रूप से, विधानसभा में सहायता करने के लिए अगर दृष्टिवैषम्य आधारित 3 डी तूफान 12 के बजाय इस्तेमाल किया जा रहा है एक दो तरफा चिपकने वाला स्पेसर के साथ एक गिलास स्लाइड (3 "एक्स 1") का उपयोग करें।
    2. इमेजिंग नमूना इकट्ठा करने के लिए, ठीक संदंश का उपयोग धीरे अच्छी तरह से बफर से नमूना coverglass हटा दें। फिर, जल्दी से और धीरे से मुड़ा हुआ शोषक कागज के साथ coverglass के किनारे को छूकर अतिरिक्त बफर दूर नल।
    3. स्वच्छ लेंस कागज के एक टुकड़े पर सामना करना पड़ रहा coverglass सेल की ओर रखें। नमूना कुल्ला30 रखकर - नमूना पर इमेजिंग बफर के 50 μl, और झुकने और मुड़ा शोषक कागज के साथ दोहन से अतिरिक्त बफर हटा दें।
    4. rinsing कदम एक बार कुछ दोहराएँ, और फिर 30 जगह - नमूना पर इमेजिंग बफर के 50 μl। ब्लाट coverglass के किनारे सूखी और सूखे क्षेत्र पर तेजी से इलाज epoxy के कई बहुत छोटे डॉट्स जगह है।
    5. धीरे-धीरे एक और पूर्व साफ # 1.5 coverglass (सादे, गोल coverglass, 18 मिमी व्यास) सेल युक्त 22 मिमी coverglass के केंद्र पर कम है। इमेजिंग बफर केशिका क्रिया द्वारा दोनों coverglasses गीला करते हैं। तेजी से इलाज epoxy के छोटे डॉट्स दोनों coverglasses का पालन करना चाहिए।
    6. धीरे इकट्ठे नमूना मुड़ा हुआ कागज का उपयोग शोषक समान रूप से दबाव का प्रसार करने पर दबाएँ। नमूना सेल-पतली और यहां तक ​​कि (<15 माइक्रोन) बनाने के लिए पर्याप्त दबाव का प्रयोग करें, लेकिन के रूप में कोशिकाओं को कुचलने के लिए इतना नहीं है। न्यूटन के छल्ले पैटर्न को देख कर उचित मोटाई नापने का यंत्र। इसके अलावा, इस सेंट प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करेंईपी धीरे हवा के बुलबुले कम से कम। यदि आवश्यक हो, खाली coverglasses कई बार पहले से साथ अभ्यास।
  11. पिघल वैसलीन-लानौलिन-तेल के साथ नमूना सील (VALAP, शेयर 100 से छ पेट्रोलियम जेली, लानौलिन, और आयल के प्रत्येक तैयार है, साथ में पिघल), 29, DDH 2 हे के साथ बंद नमूना कुल्ला, और संपीड़ित हवा के साथ सूखी झटका। नमूना अब इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप पर बढ़ते के लिए तैयार है।

2. नमूना प्लेसमेंट और iPALM संरेखण

  1. नमूना धारक को हटाने के लिए अनुमति देने के लिए ऊपर की ओर वसंत लोड शीर्ष उद्देश्य लेंस ले जाएँ। कदम 1.10 में तैयार सील नमूना नमूना धारक पर जगह और कई छोटे दुर्लभ पृथ्वी मैग्नेट के साथ सुरक्षित है। इमेजिंग नमूना के दोनों किनारों पर विसर्जन के तेल लागू करें। नमूना धारक वापस ऑप्टिकल पथ में रखें और धीरे से ऊपर उद्देश्य लेंस कम है।
  2. उत्तेजना लेज़रों चालू करें। इलेक्ट्रॉन गुणा आरोप युग्मित डिवाइस पर बारी (ईएमसीसीडी) फ्रेम स्थानान्तरण मोड में कैमरा।
    1. उचित उत्सर्जन फिल्टर में बारी बारी से। शीर्ष किरण पथ (चित्रा 1 ए) ब्लॉक और नीचे किरण पथ को खोलने के लिए एक यांत्रिक शटर को सक्रिय करें। पीजो actuator का उपयोग कर छोटे वेतन वृद्धि में अनुवाद करके ध्यान में नीचे उद्देश्य लेंस लाओ।
    2. एक बार जब असंदिग्ध ध्यान में है, जबकि नीचे बीम मार्ग अवरुद्ध शीर्ष किरण पथ को खोलने और एक समान तरीके से ध्यान में शीर्ष उद्देश्य लेंस लाने के लिए। इष्टतम ध्यान देने के लिए कंप्यूटर प्रदर्शन पर असंदिग्ध की चौड़ाई मॉनिटर।
  3. उचित centration, खुले में दोनों ऊपर और नीचे किरण पथ के लिए। मैन्युअल, जबकि नीचे उद्देश्य सूक्ष्म ठीक सेट शिकंजा की एक जोड़ी का उपयोग लगातार आयोजित किया जाता शीर्ष उद्देश्य लेंस समायोजित जब तक असंदिग्ध छवियों आदर्श रूप से एक पिक्सेल के भीतर, के रूप में बारीकी से संभव के रूप में छा रहे हैं।
    1. बाद में, ठीक समायोजन प्रदर्शन इतना है कि कदम में असंदिग्ध छवियों एक EMCCD पिक्सेल का दसवां भीतर 2.3 ओवरलैप। शीर्ष समायोजित करेंनियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से 2-अक्ष पीजो घुड़सवार दर्पण दोनों उद्देश्य लेंस पकड़े और नीचे प्रतिबिंब निरंतर दर्पण है। कंप्यूटर प्रदर्शन के माध्यम से शीर्ष की fiducials और नीचे उद्देश्य विचारों के केन्द्रों की तुलना प्रक्रिया मार्गदर्शन करने के लिए।

3. iPALM सेटअप की कैलिब्रेशन

नोट: चूंकि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बेतुका है, हस्तक्षेप iPALM में मनाया जा करने के लिए, पथ शीर्ष के माध्यम से लंबाई और नीचे उद्देश्यों को एक दूसरे के करीब, कुछ माइक्रोन के भीतर होना चाहिए। इस प्रकार के रूप में प्राप्त किया जा सकता है:

  1. पर, कैमरा लगातार स्ट्रीमिंग, और दोनों के ऊपर और नीचे बीम रास्ते खोल लेज़रों के साथ, 400 एनएम के परिमाण पर एक निरंतर जेड अक्ष दोलन के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न एक sinusoidal वोल्टेज तरंग का उपयोग नमूना धारक जेड पीजो हिलाना ।
  2. इस तथ्य का लाभ उठाते हुए कि, जब इष्टतम संरेखण से बाहर, असंदिग्ध तीव्रता टी के साथ थोड़ा भिन्न होता हैवह दोलन, मैन्युअल मोटर चालित बीम फाड़नेवाला विधानसभा ऊपर या नीचे असंदिग्ध oscillates की तीव्रता जब तक वांछित एकल फोटान हस्तक्षेप के प्रभाव के कारण अनुवाद करते हैं। इस ऑप्टिकल पथ लंबाई के करीब मिलान का प्रतीक है। > 10 की एक चोटी से घाटी अनुपात इष्टतम मामलों (चित्रा -1) में प्राप्त किया जा सकता है।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक सतह पर दोनों आयाम और चरण मैदान में संभव के रूप में समान रूप में कर रहे हैं, ठीक धुन की खाई और झुकाव कोण छोटे चरणों में बीम फाड़नेवाला विधानसभा के नीचे दर्पण समायोजित करें। 800 एनएम पर 8 एनएम जेड चरणों में नमूना अनुवाद करके बीम फाड़नेवाला ठीक संरेखण प्रदर्शन करना।
    1. बीच कैमरों # 1 असंदिग्ध तीव्रता मॉनिटर - 3. छोटे चरणों में बीम फाड़नेवाला विधानसभा के भीतर ऊंचाई, स्थिति, और नीचे दर्पण का झुकाव है, जैसे कि कैमरे के दोलन # चरण 1 कैमरा के सापेक्ष # 2 अधिकतम है, आदर्श समायोजित करें 120 डिग्री (चित्रा 1 बी-डी) पर।
    2. एक बार प्रारंभिकसंरेखण पूरा हो गया है, पास छवि और कई fiducials करने के लिए दोनों सेल शामिल है कि देखने के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र के लिए स्कैन करने के लिए नमूना अनुवाद करते हैं। आवारा प्रकाश और परिवेश perturbations ब्लॉक करने के लिए प्रणाली के चारों ओर एक बाड़े रखें। एक बार इमेजिंग क्षेत्र में पाया जाता है, फिर 3.4 कदम में प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए, और आदेश का उपयोग "कैलिब्रेशन स्कैन बनाम नमूना Piezo स्थिति प्राप्त" मुख्य अंतरफलक में बाद में जेड समन्वय एक्सट्रेक्शन में उपयोग के लिए अंशांकन वक्र रिकॉर्ड है।

4. डाटा अधिग्रहण

  1. एक बार एक वांछित क्षेत्र में पाया जाता है और अंशांकन वक्र प्राप्त की है, सॉफ्टवेयर में उचित फ़ाइल नाम दर्ज करें। दोनों ऊपर और नीचे बीम रास्तों खोलें। अधिकतम करने के लिए 642 एनएम लेजर की उत्तेजना शक्ति बढ़ाएँ। एलेक्सा स्त्राव 647 के लिए, बंद की fluorophore एक प्रारंभिक अवधि के लिए आवश्यक हो सकता है (2A चित्रा)।
    1. 5 मिनट, या अब यदि आवश्यक हो तो के लिए एक निरंतर 642 एनएम उत्तेजना के साथ बेनकाब, Si तकngle निमिष अणु मनाया जाता है (चित्रा 2 बी)। सॉफ्टवेयर अधिग्रहण के दौरान 405 एनएम तस्वीर सक्रियण के एक स्वत: वृद्धि की अनुमति देता है। अधिग्रहण के फ्रेम के बड़ी संख्या में आम तौर पर filamentous सुविधाओं स्पष्ट रूप से दिखाई करने के लिए के लिए आवश्यक हैं (> 50,000 फ्रेम)। जब तैयार है, मुख्य अंतरफलक में कमांड "शुरू iPALM अधिग्रहण" का उपयोग कच्चे छवि सेट के अधिग्रहण शुरू।
  2. अधिग्रहण के दौरान, धुन 405 एनएम लेजर की तीव्रता का समायोजन करके photoactivation स्तर उचित निमिष घनत्व (चित्रा 2 बी में उदाहरण देखें) जरूरत के रूप में बनाए रखने के लिए।
    नोट: एक बार अधिग्रहण पूरा हो गया है, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से उचित बाइनरी फार्मेट में छवि फ़ाइलों को परिवर्तित कर देंगे। अभिकलन सर्वर में डेटा भंडार एक नेटवर्क ड्राइव के रूप में मुहिम शुरू की है, की अनुमति डेटा सीधे आगे की प्रक्रिया के लिए वहाँ से कॉपी किया जा सके।

5. डाटा प्रोसेसिंगऔर विश्लेषण

  1. एक कस्टम विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सभी एकल अणुओं के लिए के रूप में अच्छी तरह से fiducials 11,15,23 के लिए सबसे फिट मापदंडों निकालने के लिए स्थानीयकरण विश्लेषण करते हैं। यह न केवल एक्स, वाई-समन्वय, लेकिन यह भी तीव्रता कि अंशांकन वक्र विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है अर्जित करता है।
    1. 3.5 चरण में अधिग्रहण आदेश का उपयोग कच्चे अंशांकन डेटा आयात "फाइल" मेनू के तहत "चोटियों एकाधिक लेबल निकालें" एकल अणु स्थानीयकरण प्रदर्शन करने के लिए। प्रारंभिक स्थानीयकरण विश्लेषण के बाद, कैमरे # से प्राप्त निर्देशांक 1 - 3, लाल, हरे और नीले चैनल, क्रमशः में मौजूद हैं, और के तहत आदेश का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है "(.sav) को बचाने आईडीएल के रूप में प्रसंस्कृत" " फ़ाइल मेनू।
  2. कैमरों # 1 से डेटा लाने के लिए - फ्लोरोसेंट fiducials coverslips पर एम्बेडेड का उपयोग कर पंजीकरण में 3, कई उज्ज्वल fiducials का चयन केंद्रीय छवि के कवरेज प्रदान करने के लिए (जैसे,चित्रा 1 बी) कमांड "एंकर Fiducial अंक" "छवि परिवर्तनों" मेनू के तहत इस्तेमाल करते हैं। ट्रिपल सेट प्रयोग के स्थानीयकरण कैमरों # 1 से निर्देशांक - रोटेशन और स्केलिंग मैट्रिक्स है कि कैमरा # 2 के साथ रजिस्टर में कैमरों # # 1 और 3 लाएगा गणना करने के लिए 3 कदम 5.1 में उज्ज्वल fiducials से प्राप्त की। fiducials की एक पर्याप्त बड़ी संख्या के साथ उच्च आदेश बहुपद warping बेहतर फिट बैठता है के लिए किया जा सकता है।
  3. 3 एक साथ अभिव्यक्त किया कच्चे डेटा प्राप्त करने के लिए - एक बार परिवर्तन मैट्रिक्स गणना की जाती है, कैमरों # 1 के कच्चे डेटा बदलना। एक और अधिक सटीक एक्स उपज स्थानीयकरण विश्लेषण के दूसरे दौर के प्रदर्शन करना, वाई-समन्वय और अभिव्यक्त कच्चे डेटा के लिए प्रत्येक कैमरे चैनल के रिश्तेदार योगदान का निर्धारण करने के लिए; कमांड "छवि परिवर्तनों" मेनू के तहत "रॉ, सहेजें और सहेजें योग (.dat) परिणत" का उपयोग करें। इस तीव्रता अनुपात जेड के समन्वय में जानकारी शामिल है।
  4. एक उज्ज्वल असंदिग्ध का चयन करें और Z-प्रदर्शनअंशांकन क्लिक "Z समन्वय संचालन" "विशेष कार्य" मेनू के तहत द्वारा समारोह "टेस्ट पवन प्वाइंट 3 डी" पॉप-अप संवाद में उपयोग कर फिटिंग। यह 3 कैमरा चैनलों की तीव्रता को 3-sinusoidal कार्यों फिट अंशांकन वक्र निर्धारित करने के लिए होगा। अंशांकन फाइल तो मुख्य डेटासेट पर आगे उपयोग के लिए सहेजा जाता है।
  5. अंशांकन वक्र की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए, प्रदर्शन Z समन्वय निकासी के रूप में पहले 23 में वर्णित है। एक अच्छी तरह से calibrated प्रणाली में अच्छी तरह से व्यवहार fiducials के लिए, जेड समन्वय, रैखिक पैमाने पर कर के बाद अंशांकन डेटासेट जेड स्थिति में एक रेखीय झाड़ू के साथ लिया जाता है चाहिए। इसके अलावा, सभी fiducials की जेड पदों पर एक समान ढलान के साथ पैमाने चाहिए।
  6. एक बार एक संतोषजनक अंशांकन प्राप्त की है, उसी प्रक्रिया कदम 5.1-5.3 में उल्लिखित निम्नलिखित चरण 4 में अधिग्रहण कच्चे छवि डेटासेट के लिए स्थानीयकरण और परिवर्तन विश्लेषण करते हैं। जब किया, चरण 5 से अंशांकन फ़ाइल लोड।4 और प्रदर्शन कार्यों का उपयोग कर "WND फ़ाइल लेने" और पॉप-अप संवाद में क्लिक "Z समन्वय संचालन" "विशेष कार्य" मेनू के तहत द्वारा "Z समन्वय निकालें" Z समन्वय निष्कर्षण।
    नोट: चूंकि अधिग्रहण समय> 15 मिनट है, यांत्रिक बहाव उम्मीद की जा रही है।
  7. एक्स में बहाव सुधार करने के लिए, वाई, स्थानीयकरण निर्देशांक से एक उज्ज्वल असंदिग्ध का चयन करें। यह असंदिग्ध सभी फ्रेम में मौजूद होना चाहिए। फिर, एक्स का उपयोग, वाई-समन्वय स्थापित असंदिग्ध का बहाव पंजीकरण में वापस उसी सीमा के भीतर सभी अन्य निर्देशांक के लिए पंक्ति में (चित्रा 3 ए-बी) समारोह का उपयोग "टेस्ट / गाइड स्टार लिखें" "छवि परिवर्तनों" मेनू के तहत। जेड समन्वय के पंजीकरण पर क्लिक "Z समन्वय संचालन" "विशेष कार्य" मेनू के तहत द्वारा "टेस्ट गाइड स्टार 'और' गाइड स्टार लिखें" पॉप-अप संवाद में कार्यों तक पहुँचने के द्वारा इसी तरह का प्रदर्शन किया जा सकता है।
  8. नमूना मामूली झुकाव प्रदर्शन कर सकते हैं के रूप में, क्लिक करके समारोह का उपयोग "XYZ झुकाव निकालें" पॉप-अप संवाद में विमान उस स्तर निर्धारित किया जाना चाहिए परिभाषित एक्स, वाई, 3 संदर्भ अंक की जेड निर्देशांक प्रदान करके झुकाव सुधार प्रदर्शन " जेड समन्वय संचालन विशेष कार्य "मेनू" के तहत "।
  9. बहाव और झुकाव सुधार के बाद, स्थानीयकरण निर्देशांक बचाने के लिए। मुख्य इंटरफेस पर "प्रदान" आदेश का उपयोग करके आगे के विश्लेषण (चित्रा -4 ए-डी) के लिए एक सुपर संकल्प छवि पुनर्निर्माण किया। रंग इंगित करने के लिए जेड समन्वय स्थापित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, चयनित क्षेत्र के एक पक्ष को देखने भी गाया जा सकता है। स्थानीयकरण निर्देशांक आगे मात्रा का ठहराव के लिए पाठ फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जा सकता है, या खंगाला छवि एक tif फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है।

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Representative Results

iPALM के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं संरेखण, पंजीकरण, और ऑप्टिकल सिस्टम की जांच कर रहे हैं। जेड के समन्वय के लिए निकासी ये 3 तरह बीम फाड़नेवाला अपेक्षित भीतर उचित हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। सतत निगरानी सक्षम करने के लिए, प्रतिदीप्ति की लगातार बिंदु स्रोतों जरूरी हैं। इस फ्लोरोसेंट Au या द्वि-धातु नैनोकणों 23 जिसका photoluminescence स्थानीय सतह plasmon अनुनाद (LSPR) से उठता का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। वे रोशनी पर एक स्थिर एकल द्विध्रुवीय के रूप में कार्य और आम तौर पर 5 से अनुवादित किया जा सकता है - 10 एनएम सटीकता। इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनोकणों सबसे एकल अणु fluorophores, ऐसा है कि दोनों fluorophores और fiducials समान EMCCD कैमरों पर उत्तेजना तीव्रता और लाभ सेटिंग्स के साथ imaged किया जा सकता की सीमा के भीतर चमक का एक स्तर है, फेंकना संतृप्ति के बिना (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, इन fiducials भी बहुत कारकोंilitate, ध्यान केंद्रित जिससे fiducials के स्पष्ट चौड़ाई ध्यान समायोजन के दौरान नजर रखी जा सकती है। इसके अलावा, इस तरह के पिरान्हा नक़्क़ाशी या प्लाज्मा सफाई के रूप में coverglass सतह के कड़े सफाई, भी, जैसा कि पहले बताया आवश्यक है, के बाद से साफ किया या खराब साफ coverglasses के नकली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति आसानी से एकल अणु संकेतों डूब कर सकते है।

iPALM उच्च परिशुद्धता पाम (x, y) के साथ एक साथ जेड समन्वय माप सक्षम करने के लिए अवस्थायाँ इंटरफेरोमेट्री पर निर्भर करता है। iPALM साधन में, प्रत्येक उत्सर्जित प्रतिदीप्ति फोटॉन दोनों ऑप्टिकल पथ, एक कस्टम निर्मित 3 तरह बीम फाड़नेवाला में जो फिर स्वयं हस्तक्षेप के माध्यम से प्रचार करने के लिए विचार किया जा सकता है। जेड समन्वय स्थापित इस प्रकार दखल फोटोन के चरण में इनकोडिंग है। ~ 120 3 तरह 3 camer के बीच एकल अणु छवियों की तीव्रता विभिन्नता में बीम फाड़नेवाला परिणाम से उत्पादन मुस्कराते हुए ° के आपसी मतभेद चरणके रूप में, की अनुमति जेड - एक अंशांकन वक्र से निकासी समन्वय। इस के आधार पर, iPALM नमूना धारक विधानसभा के बाद से यह पीजोइलेक्ट्रिक actuators कि कि संरेखण और जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता Z में एनएम परिशुद्धता अनुवाद की अनुमति की एक जोड़ी के साथ सुसज्जित है, एक आवश्यक घटक है।

उचित ध्यान और संरेखण पर, जेड अक्ष के साथ नमूना का अनुवाद एक हस्तक्षेप प्रभाव उत्पन्न होगा। यह तीन कैमरा चैनल (चित्रा 1C-डी) के बीच विश्वस्त तीव्रता के दोलन के रूप में प्रकट होता है। इन दोलनों भी संकेत मिलता है कि दोनों के ऊपर और नीचे ऑप्टिकल पथ किरण लगभग मिलान कर रहे हैं, एकल फोटान हस्तक्षेप की इजाजत दी। आमतौर पर, साधन पर मोड़ पर, प्रत्येक कैमरे के प्रारंभिक चरणों इष्टतम नहीं हो जाएगा और जेड स्थिति का स्कैन अंशांकन और संरेखण के लिए एक नैदानिक ​​उपकरण के रूप में की जरूरत है। इष्टतम चरणों पर पहुंचने के लिए, बीम फाड़नेवाला के नीचे दर्पण(चित्रा 1 ए) पीजोइलेक्ट्रिक टिप-झुकाव मंच का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है। 20 एनएम समायोजन - Z-स्थिति की जांच स्कैन प्रत्येक छोटे 10 के बाद लिया जाता है। हर चैनल में असंदिग्ध की तीव्रता तो स्थानीयकरण विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है (यानी, एक 2 डी गाऊसी समारोह के साथ फिटिंग)। कुल तीव्रता द्वारा सामान्यीकृत तीव्रता एक sinusoidal तरंग द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, की अनुमति चरण अवधि की गणना की जा करने के लिए; इस प्रकार, चरण प्रत्येक कैमरे को इसी रूप में निर्धारित किया जा सकता चित्रा 1C में देखा। हम ध्यान दें कि एकल फोटान हस्तक्षेप iPALM में इस्तेमाल सिद्धांत भी एक बहुत सरल 2-तरह बीम फाड़नेवाला का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, एक 2-तरह बीम फाड़नेवाला के बाद से या विनाशकारी हस्तक्षेप की सीमा के पास 3 डी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए अव्यावहारिक है, एक चैनल में संकेत कम है, तीव्रता और स्थानीयकरण निर्देशांक के शोर अनुमान में जिसके परिणामस्वरूप, जो प्रभावी रूप से प्रतिबंधित Z समन्वय बजी करने के लिए दृढ़ संकल्पई जहां दोनों कैमरों पर्याप्त तीव्रता (<100 एनएम) है। इस आशय काबू पाने की जरूरत चैनलों की न्यूनतम संख्या तीन है, और 3 और 4 तरह प्रोजेक्शन सिस्टम साहित्य 11,30 में वर्णित किया गया है।

इष्टतम शर्तों के तहत, एक 3-तरह बीम फाड़नेवाला के लिए, 3 कैमरों के बीच मतभेद चरण के बारे में 120 डिग्री होना चाहिए। IPALM के लिए 3 तरह बीम फाड़नेवाला 3 चिंतनशील इंटरफेस, चित्रा 1 ए में diagrammed के रूप में शामिल है। बीम फाड़नेवाला एक फ्लैट अचालक दर्पण ऊपर तैनात है, एक पतली अपवर्तनांक मिलान तेल से भरा अंतर के साथ, पथ के ठीक समायोजन बीम फाड़नेवाला भीतर लंबाई अनुमति देने के लिए और इष्टतम चरण मतभेदों को प्राप्त करने के लिए। जैसा कि चित्र -1 सी-डी में दिखाया गया है, iPALM के लिए उचित संरेखण पर, कैमरा एक 120 डिग्री आपसी अंतर चरण के करीब हैं। अभ्यास में, एक चरण के अंतर से अधिक 105 डिग्री आम तौर पर स्वीकार्य है। इस तरह अंशांकन दोनों इंडस्ट्रीज़icates कि प्रणाली अच्छी तरह से गठबंधन किया है और यह बाद में जेड समन्वय निकासी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह भी विभिन्न fiducials का उपयोग कर उत्पन्न अंशांकन वक्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है। मध्यम चमक के साथ ज्यादातर fiducials आम तौर पर एक भी द्विध्रुवीय के रूप में फेंकना, उपज अच्छी तरह से व्यवहार अंशांकन घटता। हालांकि, fiducials के कभार समुच्चय (अक्सर चरम चमक के साथ उन) एक विषम तरीके से व्यवहार कर सकता है, अविश्वसनीय अंशांकन घटता उपज। यह भी इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र के पास और जैविक हित के क्षेत्र (चित्रा 1 बी), खासकर के बाद iPALM सेटअप में इस्तेमाल उच्च एनए उद्देश्यों लेंस फ्लैट क्षेत्र को सही नहीं है पास fiducials का चयन करने की सलाह दी जाती है। प्रभावी क्षेत्र का दृश्य केंद्रीय क्षेत्र, क्षेत्र के किनारे की ओर अधिक से अधिक विश्वस्त चौड़ाई से स्पष्ट करने के लिए सीमित है।

प्रारंभिक संरेखण के बाद, खेतों का दृश्य वांछनीय मो के साथ कोशिकाओं से युक्तrphology और कई fiducials अच्छा अंशांकन सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग के लिए चुना जाता है। यह धीरे-धीरे 2-अक्ष servomotor ड्राइव का उपयोग नमूना धारक का अनुवाद करके प्राप्त किया जा सकता है। नमूना के अनुवाद, कुछ defocusing में परिणाम होगा क्योंकि नमूना हमेशा पूरी तरह से फ्लैट नहीं है। इसलिए, ध्यान केंद्रित करने के लिए लगातार अनुवाद के दौरान समायोजित किया जाना चाहिए। एक बार इमेजिंग क्षेत्र में चुना गया है, अंशांकन के दूसरे दौर के अनुकूलन करने के लिए अंशांकन वक्र फिर सिस्टम संरेखण ठीक धुन करने के लिए किया जाता है और वास्तविक अंशांकन वक्र प्राप्त करने के लिए। महत्वपूर्ण बात है, नाभिक या विषम अपवर्तनांक (जैसे, हवा के बुलबुले) के साथ पास के क्षेत्रों के अधीन क्षेत्रों में सामान्य रूप में बचा जाना चाहिए लंबाई के बाद से इन संबंधित पथ की महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण होगा, विकृत जेड समन्वय।

उच्च घनत्व लेबलिंग के साथ, इस तरह के एलेक्सा स्त्राव 647 के रूप में जैविक fluorophores से प्रतिदीप्ति संकेतों अत्यंत उज्ज्वल हो सकता है। मैं के रूप में दिखाएn चित्रा 2A, thiol (एसएच) समूह 31 के एक उच्च एकाग्रता युक्त उचित बफर तैयारी के साथ, fluorophore तेजी से उच्च उत्तेजना रोशनी के तहत बंद किया जाना चाहिए। यह अणुओं के बहुमत से प्रतिदीप्ति संकेतों के दमन में परिणाम है। दिये गये उदाहरण में, fluorophores के एक बहुत छोटे से अल्पसंख्यक प्रसंभात्य "पर" राज्य में लौटने। ये कम से वितरित किया जा करने के लिए और इस तरह स्विच करने से पहले कुछ फ्रेम के लिए एक एकल अणुओं या के रूप में देखे जा सकते हैं उम्मीद कर रहे हैं "बंद।" photoswitching गतिशीलता दृढ़ता से उत्तेजना तीव्रता और एसएच की एकाग्रता पर निर्भर हैं, और इस तरह, एक दिया प्रणाली के लिए, देखभाल उचित लेबलिंग घनत्व अनुकूलन करने के लिए, विशेष रूप से एक अपेक्षाकृत उच्च तीव्रता उत्तेजना के बाद से लिया जाना चाहिए (640 - 647 एनएम) है एलेक्सा स्त्राव 647 अणुओं के बहुमत बंद करने के लिए की जरूरत है। उत्तेजना पर्याप्त मजबूत नहीं के एलेक्स स्त्राव 647 इच्छा एक महत्वपूर्ण अंश है"पर" राज्य में रहते हैं, उच्च पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप, एक अणु प्रतिदीप्ति, खराब गुणवत्ता एकल अणु स्थानीयकरण परिणाम देख, और, अंततः में कठिनाइयों। एक अच्छी तरह से संतुलित शर्त के तहत, एकल अणु कच्चे डेटा, अणु (सैकड़ों) फ्रेम (चित्रा 2 बी) के अनुसार की एक पर्याप्त बड़ी संख्या होनी चाहिए, जबकि प्रत्येक अणु पर्याप्त विरल स्पष्ट पता लगाने और स्थानीयकरण विश्लेषण की अनुमति है। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि iPALM के लिए, photoswitching के सिद्धांतों पाम या तूफान के उन लोगों के लिए समान हैं लायक है, और इस प्रकार, नमूने ठीक से iPALM के लिए तैयार सीधे सरल 3 डी-पाम या 3 डी तूफान सिस्टम पर इस्तेमाल किया जा सकता है। अणुओं के एक उच्च पर्याप्त घनत्व हासिल करने के लिए Nyquist नमूना संतुष्ट करने के लिए आमतौर पर कच्चे डेटा के 50,000 या अधिक फ्रेम की आवश्यकता होती है (यानी, 3 कैमरों के लिए 150,000 कुल फ्रेम)। अधिग्रहण की प्रगति, fluorophores के एक बढ़ती हुई अंश विनाशकारी photobleaching से समाप्त किया जा सकता है, बल्ला, जिसके परिणामस्वरूपसेवा ही अणु घनत्व। इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, 405 एनएम नीले प्रकाश (405 एनएम) का संक्षिप्त दालों के अंतराल पर नमूना पर प्रबुद्ध किया जा सकता fluorophore सक्रियण बढ़ावा देने के लिए।

लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकता के कारण, iPALM के लिए इष्टतम परिणाम (या सामान्य में एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) कम नमूना बहाव और / या अच्छा बहाव सुधार की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, फ्रेम स्थानांतरण मोड (20 हर्ट्ज फ्रेम दर) में 50 मिसे के जोखिम समय का उपयोग कर, 50,000 फ्रेम के लिए कुल अधिग्रहण समय 42 मिनट है। इस अवधि के दौरान, एनएम के दसियों से अधिक यांत्रिक बहाव की उम्मीद है। दरअसल, उच्च स्थानीयकरण परिशुद्धता और उच्च घनत्व लेबलिंग के अलावा, संकल्प भी बहाव सुधार की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। वहाँ थर्मल में उतार-चढ़ाव एक प्रमुख कारण होने के साथ इन drifts करने के लिए कई मूल रहे हैं। इस विचार, जहां संभव हो, iPALM भागों इन्वार, एक कम थर्मल विस्तार मिश्र, या स्टेनलेस स्टील का उपयोग कर कस्टम-मशीनीकृत कर रहे हैं के कारण,जिनमें से दोनों पीतल या एल्यूमीनियम की तुलना में काफी कम थर्मल विस्तार विशेषताओं है। दुर्भाग्य से, यह भी एल्यूमीनियम के लिए अतिरिक्त लागत के सापेक्ष है, जो optomechanical घटकों के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल धातु है, बहुत सस्ता है और मशीन के लिए आसान जा रहा लगाता है। बहाव के अन्य स्रोतों परिधीय उपकरण, परिवेश वातावरण, या हवा के बहाव से यांत्रिक कंपन हो सकता है। ये एक उपयुक्त बाड़े में रखकर प्रणाली और माइक्रोस्कोप के क्षेत्र में हवा का प्रवाह दिशा पुनः निर्देशित करके कम से कम किया जाना चाहिए। सेटअप एक अनुसंधान ग्रेड ऑप्टिकल मेज पर बनाया जाना चाहिए और यदि संभव हो, प्रशंसक युक्त घटकों बंद रखा जाना चाहिए ऑप्टिकल तालिका। फिर भी, सभी सावधानियों के बावजूद, बहाव के कुछ राशि में रहेगा। गंभीर, इन drifts इस तरह के कम से कम किया जाना चाहिए कि छवि अधिग्रहण के समय के दौरान ध्यान में रहता है। हमारे सिस्टम में, इन तरीकों निष्क्रिय स्वीकार्य स्तर तक बहाव को कम करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, यह सक्रिय बहाव कॉम को लागू करने के लिए संभव होना चाहिएघटनाएं तरीकों लंबी अवधि और उच्च परिशुद्धता इमेजिंग 32 सकें।

10 लाख डाटासेट प्रति एकल अणु चोटियों - कच्चे डेटा की प्रोसेसिंग के बाद, 3 डी स्थानीयकरण निर्देशांक आम तौर पर 5 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, समय के एक समारोह के रूप बहाव fiducials के स्थानीयकरण निर्देशांक से देखे जा सकते हैं। एकाधिक fiducials औसत बहाव सुधार प्रक्षेपवक्र (चित्रा 3 ए-बी) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, यह चोटियों कि स्थानीयकरण विश्लेषण के दौरान 2 डी गाऊसी समारोह को खराब फिट बाहर फिल्टर करने के लिए प्रथागत है। यह नकली शोर या आंशिक रूप से अतिव्यापी एकल अणु चोटियों के कारण हो सकता है और फिटिंग की प्रक्रिया के दौरान गणना की बड़ी अवशिष्ट वर्ग त्रुटि द्वारा भेदभाव किया जा सकता है। कम चमक (के रूप में फोटोन गिनती द्वारा इंगित) और, इस प्रकार, उच्च अनिश्चितता के साथ चोटियों (यानी, की तुलना में ~ 25 एनएम बड़ा) भी बाहर, छान रहे हैं एकइन संभावना गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से उत्पन्न होती हैं। इसी तरह, चोटियों जिसके लिए 3 कैमरा चैनलों से तीव्रता अंशांकन वक्र करने के लिए खराब फिट भी खारिज कर दिया, के रूप में जेड निर्देशांक प्राप्त अविश्वसनीय हैं कर रहे हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि iPALM (और सामान्य में स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) की पूरी जानकारी सामग्री, बड़े पैमाने पर है विश्लेषण के परिणाम न केवल fluorophore निर्देशांक में, बल्कि ऐसी तीव्रता, चौड़ाई, चमक, आदि हालांकि के रूप में कई अतिरिक्त पैरामीटर के बाद से, व्यवहार में, के बाद से अपेक्षाकृत कुछ कम्प्यूटेशनल उपकरण वर्तमान में समन्वय स्थापित अंतरिक्ष में विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं, स्थानीयकरण निर्देशांक आम तौर पर प्रदान की गई है या आगे के विश्लेषण के लिए पिक्सेल आधारित छवियों में खंगाला हैं।

iPALM छवि पुनर्निर्माण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण स्थानीयकरण अनिश्चितता गऊ के रूप में सेट के साथ, का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रत्येक स्थानीयकरण एक सामान्यीकृत 2 डी गाऊसी समारोह के साथ समन्वय स्थापित हैssian चौड़ाई 33। इस प्रकार, उच्च परिशुद्धता निर्देशांक (आम तौर पर कम पृष्ठभूमि के खिलाफ उच्च चमक के साथ एकल अणु चोटियों) के रूप में तेज और संकीर्ण चोटियों दिखाई देते हैं, जबकि कम सटीक निर्देशांक (आम तौर पर कम चमक या उच्च पृष्ठभूमि एकल अणु चोटियों) मद्धम और व्यापक रूप में प्रकट चोटियों। इस तरीके में, प्रत्येक अणु छवि के लिए तीव्रता का एक ही राशि का योगदान देता है। एक 3 डी डेटा सेट के लिए, जेड समन्वय रंग, आम तौर पर एक रंग पैमाने (चित्रा 4C-डी) के आधार पर का उपयोग दर्शाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, छवियों को एक पक्ष दृश्य (एक्स, जेड या वाई, जेड) प्रक्षेपण के रूप में या संस्करणों के रूप में दिखाया जा सकता है। सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के एक नंबर इस तरह के डेटा 34 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

के रूप में आंकड़े 4-6 में दिखाया गया है, iPALM छवियों विवर्तन सीमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर एक महत्वपूर्ण सुधार निकलेगा। HUVEC कोशिकाओं में एफ actin वास्तुकला ज्यादा बढ़ाया स्थानिक Reso के साथ देखे जा सकते हैंlution। कॉर्टेक्स के क्षेत्रों में, अलग तंतु का नेटवर्क है, देखा जा सकता है, जबकि तनाव फाइबर, बंडल, और lamellipodia में, घनी पैक एफ actin नेटवर्क एक filamentous बनावट को मनाया जाता है, हालांकि अलग-अलग तंतु अलग पहचाना नहीं हैं। यह दोनों fluorophores की चमक और स्थानीयकरण परिशुद्धता में सीमाओं के कारण होने की संभावना है। अलग cortical तंतु की उपस्थिति पता चलता है कि एफ actin नेटवर्क के फैटी पर्याप्त अच्छी तरह से संरक्षित है; इस प्रकार, iPALM cortical वास्तुकला निस्र्पक के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। चित्रा 5 में, एक HUVEC सेल के एक उप क्षेत्र एक actin रेशा मात्रा निर्धारित की प्रोफाइल के साथ प्रदर्शित किया जाता है। यह देखा जा सकता है कि एक रेशा के Z-हिस्टोग्राम, करने के लिए अनुप्रस्थ (एक्स, वाई) को देखने के लिए ~ 45 एनएम तुलना में, चौड़ाई में लगभग 15 समुद्री मील दूर है अपेक्षाकृत छोटे दिखा रहा है कि iPALM को जेड संकल्प रिश्तेदार में एक महत्वपूर्ण संकल्प सुधार पैदावार एक्स, वाई-विमान, जैसा कि उम्मीद थी। हालांकि, बाद से actuएफ actin के अल व्यास ~ 8 एनएम, यह स्पष्ट नहीं है मनाया रेशा एक भी रेशा या कुछ तंतु का एक बंडल है कि क्या है। Correlative इमेजिंग iPALM का उपयोग कर और ईएम एफ actin वास्तुकला के आगे लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी रणनीति हो सकती है, हालांकि इस दृष्टिकोण एफ actin अभी तक 23 का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: iPALM 3-डी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के योजनाबद्ध आरेख। ए) iPALM प्रकाशिकी के Schematics। दोहरे उद्देश्य लेंस (निकॉन, एनए 1.49 60X) प्रत्येक उत्सर्जित प्रतिदीप्ति फोटॉन दोनों ऊपर और नीचे ऑप्टिकल किरण रास्तों के माध्यम से प्रचार करने के लिए अनुमति देते हैं, और वे 22.5 डिग्री पर उन्मुख दर्पण की एक जोड़ी द्वारा बीम फाड़नेवाला में हस्तक्षेप करने के लिए पुनः निर्देशित कर रहे हैं। आत्म दखल फोटोन के चरण सीधे δZ के लिए आनुपातिक है, इस प्रकार एन्कोडिंग की fluorophore जेड समन्वय, और हमें मापा जा सकता हैतीन उत्पादन बीम के बीच ~ 120 डिग्री के आपसी मतभेद चरण के साथ एक 3 तरह बीम फाड़नेवाला हैैं। वे ट्यूब लेंस (एल 1-L3, च = 400 एनएम) द्वारा केंद्रित है और उत्सर्जन फिल्टर करके छान रहे हैं (एफ 1 - F3)। प्रत्येक अणु इसलिए, कैमरों (EMCCD1-3) के बीच है, लेकिन इसी तरह की एक्स पर y निर्देशांक अलग तीव्रता के साथ प्रकट होता है। (ए) reproduced और रेफरी से संशोधित किया गया है। 11. (बी) एलेक्सा स्त्राव 647 चमकीले धब्बों के साथ एफ actin के लिए लेबल HUVEC कोशिकाओं के विवर्तन सीमित छवि के Au nanoparticle fiducials निरूपित। कैमरों # 1 के लिए चरण कोण - 3 क्रमशः, लाल, हरे और नीले रंग लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, कैमरे # 1 के बीच अंतर चरण के साथ, प्रत्येक असंदिग्ध पर केंद्रित - 3 संकेत दिया। स्केल पट्टी:। 5 माइक्रोन (सी) इंटरफेरोमेट्रिक प्रभाव दिखा Fiducial छवियों। प्रत्येक कैमरे (CCD1-3) या कुल (योग), जेड-स्थिति के रूप में लिया (एनएम में, नीचे पंक्ति पर) के लिए एक Au nanoparticle असंदिग्ध की छवियाँ जांच के लिए स्कैन किया जाता है। ईए भीतर तीव्रताके रूप में (बी)। (डी) iPALM अंशांकन वक्र में दिखाया गया CH कैमरा, एक चरण रिश्ते के साथ कांपना करने के लिए देखा जा सकता है। नमूना जेड अक्ष के साथ अनुवाद किया है। EMCCD1-3 के लिए एक Au nanoparticle असंदिग्ध की तीव्रता, लाल, हरे और नीले रंग की लाइनों में क्रमश: (ऊपर) के रूप में दिखा रहे हैं। ये तो सामान्यीकृत कर रहे हैं और मतभेद चरण (नीचे) निर्धारित करने के लिए फिट बैठते हैं। संरेखण के दौरान प्रणाली सभी तीन कैमरों के बीच अधिक से अधिक मतभेद चरण प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है। अंशांकन वक्र की निकासी में उपयोग करने के लिए प्रत्येक इमेजिंग साइट पर लिया जाता है जेड समन्वय प्रत्येक अणु की। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: photoswitching अल का एक अणु इमेजिंगएक्टिन लेबल के रूप में EXA स्त्राव 647-phalloidin। (ए) प्रारंभिक photoswitching कदम है। तय कोशिकाओं में एफ actin सबसे fluorophores के तेजी से स्विच बंद में एक thiol युक्त छवि बफर परिणामों में एलेक्सा स्त्राव 647 उच्च तीव्रता रोशनी संयुग्मित Phalloidin द्वारा एक उच्च घनत्व में लेबल है। (बी) के कच्चे एकल अणु के प्रतिनिधि तख्ते फ्रेम। स्थिर राज्य निमिष में सक्रिय एलेक्सा स्त्राव 647 पर्याप्त विरल है कि व्यक्तिगत एकल अणुओं एक पीएसएफ आकार मौके के रूप में प्रकट होना चाहिए। (ए) में दिखाए गए एक ही कोशिकाओं, उलटा इसके विपरीत के साथ दिखाया गया की छवियाँ। एक में स्केल सलाखों और बी:। 5 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: बहाव सुधार multip का उपयोग कर(शीर्ष दाएँ कोने पर फिट मापदंडों 5 क्रम वें), (बी, वाई समन्वय ए, एक्स समन्वय) बहुपद फिटिंग का उपयोग बहाव गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। le fiducials स्थानीयकरण चार fiducials के लिए निर्देशांक। औसत बहाव प्रक्षेपवक्र की अनुमति देता है के साथ उप-एनएम 5 परिशुद्धता बहाव का सुधार (एक्स: 3.085 एनएम, Y: 3.606 एनएम)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: iPALM द्वारा 3-डी एफ actin वास्तुकला का दृश्य। (ए) एफ actin के साथ HUVEC कोशिकाओं एलेक्सा स्त्राव 647-phalloidin द्वारा लेबल के विवर्तन सीमित छवि (चित्रा 2 में सेल के subareas के लिए इसी)। उज्ज्वल हाजिर Au nanoparticle fiducials के कारण है। (सी) में इस क्षेत्र के लिए iPALM विश्लेषण प्रत्येक स्थानीयकरण के साथ खंगाला iPALM छवि, द्वारा निर्धारित निर्देशांक एक 2 डी गाऊसी चौड़ाई स्थानीयकरण अनिश्चितता को इसी के साथ द्वारा प्रदान की गई समन्वय। जेड समन्वय रंग पट्टी के अनुसार रंग का है। घने और विरल filamentous सुविधाओं के क्षेत्र में देखा जा सकता है। स्केल सलाखों (एसी): 1 माइक्रोन (डी) ज़ूम में filamentous cortical actin टोपोलॉजी दिखा सी में बॉक्सिंग क्षेत्र का दृश्य।। स्केल पट्टी:। 250 एनएम कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: एफ actin iPALM द्वारा कल्पना की नेनो आयाम। (ए) एफ actin लेबल बी के साथ खंगाला iPALM की छवि HUVEC कोशिकाओं Y एलेक्सा स्त्राव 647-phalloidin। रंग रंग पट्टी के अनुसार जेड समन्वय इंगित करता है। स्केल पट्टी:। 1 माइक्रोन (बी) ट्रांसवर्स एक्स के पार अनुभाग हिस्टोग्राम, वाई-स्थानीयकरण में बॉक्सिंग क्षेत्र की लंबी अक्ष (ए) के साथ समन्वय करता है। हिस्टोग्राम प्राप्त करने के लिए, निर्देशांक बॉक्स की लंबी अक्ष पर पेश किया और एक 5 एनएम बिन-आकार के साथ binned रहे हैं। ग्रे वक्र आधा अधिकतम 43.88 एनएम (FWHM) पर एक पूर्ण चौड़ाई के साथ हिस्टोग्राम के लिए एक गाऊसी सबसे अच्छा फिट इंगित करता है। (सी) स्थानीयकरण के Z-स्थिति की हिस्टोग्राम (ए) में बॉक्सिंग क्षेत्र में समन्वय करता है। जेड पदों 1 एनएम के एक बिन आकार के साथ binned रहे हैं। ग्रे वक्र हिस्टोग्राम के लिए एक गाऊसी सबसे अच्छा फिट, 17.50 एनएम के एक FWHM साथ इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6:। विभिन्न लेबल अभिकर्मकों का उपयोग एफ actin के iPALM इमेजिंग की तुलना एलेक्सा स्त्राव 647 संयुग्मित phalloidin (ए), एलेक्सा स्त्राव 568 संयुग्मित phalloidin (बी) का उपयोग एफ actin लेबल की खंगाला iPALM चित्र, या actin के साथ अभिकर्मक से -mEos2 संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति वेक्टर (सी)। स्केल सलाखों (एसी):। 1 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

IPALM के ऑप्टिकल प्रणाली, एक 4-π दोहरे विरोध के उद्देश्य डिजाइन पर आधारित है के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। के रूप में पहले 23 में वर्णित है और 1 टेबल में सूचीबद्ध सेटअप, दोनों कस्टम-मशीनीकृत और वाणिज्यिक ऑप्टो यांत्रिक भागों का उपयोग कर निर्माण किया है। हमारे सेटअप के अलावा, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (HHMI) एक प्रणाली है कि Janelia रिसर्च परिसर में उन्नत इमेजिंग सेंटर में वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ है होस्ट करता है। पूर्ण यांत्रिक चित्र, नियंत्रण schematics, और सॉफ्टवेयर के लिए, पाठकों को अधिक जानकारी के लिए HHMI पर हेराल्ड हेस के साथ पूछताछ करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। एफ actin visualizing के लिए iPALM के साथ ही अन्य एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग कर के लिए एक प्राथमिक लाभ नमूना तैयार ईएम तकनीक है, जो आम तौर पर कठोर नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, श्रमसाध्य तैयारी, और अत्यधिक कुशल चिकित्सकों की तुलना में 3,23 के सापेक्ष कम है । Additionallवाई, प्रतिदीप्ति स्वाभाविक रूप से मल्टीचैनल इमेजिंग, जो ईएम के लिए मुश्किल बना हुआ है के लिए उत्तरदायी है। फिर भी, के रूप में आगे नीचे वर्णित है, वहाँ दृष्टिकोण के लिए कई वर्तमान सीमाओं, दोनों नमूना तैयार करने और इमेजिंग प्रक्रिया के संदर्भ में हैं। सबसे पहले, ईएम नमूना तैयार करने के लिए मामला है, देखभाल नमूनों 35 की अच्छी ultrastructural संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए एक प्रोटोकॉल संकल्प के एक विवर्तन सीमित स्तर nanoscale स्तर पर गंभीर perturbations पैदा कर सकता है के लिए पर्याप्त था। actin इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं के समुचित निर्धारण नमूना गुणवत्ता प्रभावित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। Glutaraldehyde एक पसंदीदा लगानेवाला के बाद से यह बहुत अच्छी तरह से cytoskeleton और झिल्ली को बरकरार रखता है, हालांकि एंटीबॉडी के साथ सह-धुंधला के मामलों में, मिलान साइटों प्रभावित हो सकता है। ऐसे मामलों में, paraformaldehyde, एक स्वीकार्य समझौता पेशकश कर सकते हैं के रूप में यह बेहतर एंटीबॉडी मिलान साइटों को संरक्षित करने के लिए जाता है। महत्वपूर्ण बात एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के लिए, इन fixatives करते हैंपृष्ठभूमि autofluorescence उत्पन्न करने के लिए; इस प्रकार, borohydride द्वारा पोस्ट-निर्धारण शमन आवश्यक है, विशेष रूप से glutaraldehyde के मामले में।

इसके अतिरिक्त, fluorophores और लेबलिंग रणनीतियों का उचित चयन सफल प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक हैं। एफ actin के nanoscale आयाम के कारण, लेबल के उच्च घनत्व के रूप में Nyquist नमूना प्रमेय 36 द्वारा निर्धारित की गई, अंतर्निहित filamentous नेटवर्क पर कब्जा करने के लिए आवश्यक हैं। actin के लिए, phalloidin जैविक कई निर्माताओं से उपलब्ध fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बहुत ही उच्च घनत्व लेबलिंग की अनुमति देता है। हालांकि, बाद से phalloidin विषैला होता है, सेल निर्धारण और permeabilization की आवश्यकता है। रहते सेल संगत actin लेबलिंग के लिए वैकल्पिक रणनीतियों फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) के विलय का उपयोग शामिल है, या तो monomeric actin के साथ या छोटे actin बाध्यकारी polypeptides साथ। हालांकि, हमने पाया है कि इन (phalloidin की तुलना में एक कम घनत्व लेबलिंग उपज होते हैं 37 से जीवित कोशिकाओं में पेश किया, लेकिन इस दृष्टिकोण महंगी और श्रम प्रधान होने की उम्मीद है। fluorophores के संदर्भ में, एलेक्सा स्त्राव 647 आम तौर पर स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के लिए लगातार अच्छा प्रदर्शन पेशकश करने के लिए पाया गया है। यह एक अणु चोटी और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 38 के बीच विपरीत अनुपात चमक भागफल के संदर्भ में वर्णित किया जा सकता है। क्योंकि पृष्ठभूमि संचयी स्थानीयकरण परिशुद्धता नीचा हो सकता है एक उच्च लेबलिंग घनत्व, एक उच्च विपरीत अनुपात की आवश्यकता है। हमारे अनुभव में, इस तरह के ATTO488, ATTO520, और एलेक्सा स्त्राव 568 (चित्रा 6B) के रूप में कई अन्य fluorophores, एफ actin कल्पना करने के लिए है, हालांकि साथ एलेक्सा स्त्राव 647 है, जो मजबूत photoswitching प्रदर्शन भर में प्रदान की तुलना में कम अनुरूप परिणाम इस्तेमाल किया जा सकता इमेजिंग बफर की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला।

39। यह भी उतना ही फायदे और iPALM की सीमाओं पर लागू होता है। अन्य 3 आयामी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक की तुलना में, iPALM तिथि करने के लिए उच्चतम को हल करने के लिए ऑप्टिकल दृष्टिकोण, विशेष रूप से जेड अक्ष के साथ, जेड संकल्प लगभग 2 बार की तुलना में एक्स, वाई-संकल्प 11 के साथ बेहतर बनी हुई है। हालांकि, एक उच्च Z संकल्प के लिए इंटरफेरोमेट्री पर iPALM की निर्भरता भी इमेजिंग गहराई पर प्रतिबंध लगाता है, क्योंकि अंशांकन वक्र आवधिक है। दूसरे शब्दों में, जेड निर्देशांक हर 250 एनएम या तो (~ 700 के लिए एलेक्सा स्त्राव 647 एनएम का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) दोहराएँ। व्यवहार में, यह TIRF रोशनी, जिनमें से क्षणभंगुर क्षेत्र गहराई के भीतर करने के लिए उत्तेजना क्षेत्र की सीमा का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता <coverglass से 200 एनएम। इस प्रकार, गहरी fluorophores में नमूना उत्साहित नहीं हैं और अदृश्य रहते हैं। बहरहाल, यह भी जैविक संरचना है कि, इस तरह के फोकल adhesions, cortical cytoskeleton, और उदर प्लाज्मा झिल्ली के रूप में coverglass के करीब निकटता में उन लोगों के लिए imaged किया जा सकता है, जबकि अधिक आंतरिक संरचनाओं पहुंच से बाहर हैं सीमा। तय नमूना के लिए, एक ही उपाय 40 cryosectioning प्रदर्शन है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण अत्यधिक श्रमसाध्य है और विशेष विशेषज्ञता है कि आमतौर पर सुलभ नहीं है की आवश्यकता है।

वैकल्पिक रूप से, iPALM अविन्दुक-defocusing योजना 12 3 डी-तूफान में इस्तेमाल के साथ इंटरफेरोमेट्री के संयोजन के द्वारा एक विस्तारित जेड श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण दोहरी जेड समन्वय readouts, इंटरफेरोमेट्री है, जो उच्च परिशुद्धता लेकिन आवधिक है से पहले, और अविन्दुक defocusing, जो कम सटीक लेकिन गैर आवधिक है द्वारा दूसरे प्रदान करता है। बाद तो "खोलना" या अपकर्ष तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइंटरफेरोमेट्रिक जेड निर्देशांक, इस प्रकार ~ 750 एनएम के लिए iPALM इमेजिंग गहराई का तीन गुना सक्षम करने, प्रभावी रूप से उच्च एनए उद्देश्य लेंस के आंतरिक फोकल गहराई आ। चरण unwrapping के साथ, iPALM छवि संरचनाओं के लिए गहरी नमूने के भीतर, इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में, सभी 3 आयामों में थोड़ा कम परिशुद्धता के साथ होने के कारण अतिरिक्त defocusing 40 करने के लिए इस्तेमाल किया गया है यद्यपि।

iPALM की एक और आंतरिक सीमा इमेजिंग गति है। तख्ते की बड़ी संख्या स्थानीयकरण निर्देशांक के एक उच्च घनत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं के बाद से, कैमरा गति आमतौर पर अधिग्रहण दर पर सीमा नहीं है। वर्तमान EMCCD कैमरों 10 पर चलने के साथ - 20 मेगाहर्ट्ज readout दरों, मिनट के दसियों फ्रेम के लिए पर्याप्त संख्या के लिए आवश्यक हैं। इतने लंबे समय के तराजू की आवश्यकता है कि नमूना तय किया जा। इधर, इस तरह के बहुत तेजी से वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (sCMOS) कैमरा के रूप में कैमरे प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों,, आईएम में तेजी से वृद्धि सक्षम हो सकता है, गति 41 उम्र बढ़ने हालांकि यह अभी तक iPALM के लिए लागू नहीं किया गया। कुछ एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के लिए, एक घने एकल अणु क्षेत्र एक संशोधित एल्गोरिथ्म 42 का उपयोग विश्लेषण या संवेदन 43 संकुचित किया जा सकता है। इस तरह की रणनीतियों का अनुकूलन भी इसलिए, कम फ्रेम सघन एकल अणु छवियों की अनुमति देकर iPALM में तेजी लाने और, हो सकती है।

स्थानिक संकल्प में गति और इमेजिंग रेंज में सीमाओं और ताकत के साथ, iPALM के लिए एक प्रमुख आवेदन एक ultrastructural तरीका है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लाभों का लाभ उठाता विशिष्ट प्रोटीन 14,15,44 के nanoscale संगठन अनावरण करने के रूप में है। इसके अलावा सुधार, दोनों प्रकाशिकी और fluorophore प्रौद्योगिकियों के मामले में, iPALM स्थानिक संकल्प में आगे बढ़ाने के लिए सक्षम होना चाहिए। उदाहरण के लिए, iPALM छवि प्रसंस्करण वर्तमान में एक अपेक्षाकृत सरल पहले के आदेश सन्निकटन दृष्टिकोण, प्रत्येक एकल एक 2 डी-गाऊसी समारोह से और के रूप में मॉडलिंग अणु के साथ कार्यरत हैंएक होने की sumed isotopically द्विध्रुवीय औसत। इस हाल के तरीकों, जो बात-प्रसार समारोह और द्विध्रुवीय अभिविन्यास, या देखने के क्षेत्र भर में ऑप्टिकल aberrations के स्पष्ट उपचार का एक और अधिक सटीक मॉडल को रोजगार के लिए काफी स्थानिक संकल्प में सुधार करने के साथ संवर्धित किया जा सकता है। इसी तरह, photocaging सूचित किया गया है, जो परिमाण 45 के आदेश से fluorophore चमक को बढ़ाता है। दरअसल, जब से उनके ultrastructural संगठन के प्रमुख तत्वों को अच्छी तरह से विशेषता किया गया है, एफ actin cytoskeleton iPALM में आगे पद्धति के घटनाक्रम के परीक्षण के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मॉडल प्रणाली हो सकता है। सच ईएम-स्तर को हल करने की शक्ति के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन संगठन का विश्लेषण करने की क्षमता बहुत सेलुलर संरचना और समारोह के असंख्य पहलुओं के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

YW और पी कृतज्ञता सिंगापुर नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, पीके (एनआरएफ-NRFF-2011-04 और NRF2012NRF-CRP001-084) को सम्मानित किया धन से समर्थन स्वीकार करते हैं। हम यह भी बुनियादी सुविधाओं के समर्थन के लिए MBI खुली प्रयोगशाला और माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

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