Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biochemistry
 

Summary

Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biyolojik küçük açı X-ışını saçılması (BioSAXS) çözeltisi yapısı, parçacık boyutu ve şekli, ve makromoleküller yüzey-hacim oranı belirlemek üzere kullanılan moleküler ve yapısal biyoloji güçlü bir tekniktir. Tekniği vb konsantrasyonları, pH değerleri, iyonik güçlü, sıcaklıklar, katkı maddeleri, geniş bir yelpazede uzanan çözelti koşulları çok çeşitli uygulanabilir, ancak örneği, tek dağılımlı olması gerekmektedir. Bu ihtar SAXS ışın demetleri üzerinde sıvı kromatografisi sistemlerinin uygulanmasına yol açtı. Burada, bir ışın-hattı üzerinde boyut dışlama (SEC) ve iyon değişim kromatografisi (IEC) yukarı entegrasyonu tarif uygun geri çıkarma ve veri azaltılması için farklı yöntemler. Bir örnek olarak, bir D5N helikas tanım aşağıdakilerden oluşan, esas aşı virüsü proteini D5 parça üzerindeki sek- ve IEC SAXS kullanımı açıklanmıştır. Biz th heksamerik yapısını gösteren, genel şeklini ve moleküler ağırlığı belirlemekE proteini.

Introduction

BioSAXS nano-boyutlu nesnelerin 1-4 şeklini belirlemek için güçlü bir araçtır. mil aralığı içinde boyut makromoleküller ihtiva eden bir çözelti ile X-ışını saçılması, çok düşük açılarda kaydedilir. Bu açısal aralık küresel parametreler hakkında bilgi içerir: dönme yarıçapı; en büyük intraparticle mesafe; parçacık şekli; ve katlanır, denatürasyon, ya da bozukluğun derecesi. Belirlenmesinde yararlı olabilir tekniği kristaller gerektirmez, ve makromolekül gibi iyonik vb kuvvet, pH, bu faktörlerin bilgisi olarak hücrenin belirli parametrelerin, taklit koşullarda muhafaza edilebilir ve böylece solüsyon içinde kalır ve, örneğin, veya ilgi bir proteinin fizyolojik ilgili oligomerik devlet bir kompleksin bir teklif modeli doğrulamak için. farklı tampon koşullarında protein-protein etkileşimlerinin karakterizasyonu, eksik etki modellerinin oluşturulması, homoloji model arıtma ve deayrık katlanmış ve katlanmamış devletlerin sona ermesi hızlı ve kolay 5 yapılabilir.

un-yorumlanabilir verilere yol açabilir toplanan veya denatüre örnekleri, parçacıkların karışımları, heterojen örnekleri, radyasyon hasarı ve tampon uyumsuzlukları: herhangi bir teknik olduğu gibi, BioSAXS içsel zayıflıkları vardır. Birçok analiz yöntemleri için, dolaylı örnek uygulamada elde etmek oldukça zordur bir gereklilik, tek dağılımlı olduğu kabul edilir. Birçok durumda, numunenin bozulması ince olduğunu ve kendi veri tespit edilemez ve verileri yorumlamak için herhangi bir girişimi yanlış, hatta yanıltıcı sonuçlar verir. Bu engelleri aşmak için, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve SAXS kombinasyonu veri kalitesini sağlamak ve giderek daha zor numuneler 6-11 için bu tekniğin daha erişilebilir hale getirmek için birçok ışın demetleri üzerinde uygulanmıştır. Son zamanlarda, online iyon değişimini geliştirerek repertuarına yeni bir yöntem ekledikromatografi (IEC) SAXS 12 -coupled. Her iki teknik analiz eskiden imkansız biyolojik parçacıkların geniş bir SAXS açıyoruz. kullanılacak yöntem seçimi ilgi partikülerinin biofiziksel özelliklerine bağlıdır.

SEC görünür moleküler kütlede en az% 10'luk bir fark ayrılması için gerekli olan, bunun sonucu olarak boyutuna göre makromolekülleri ayırır. kolon ve örneklerin fizyolojik özelliklerinin fiziksel sınırlamalar, hidrofobik yüzeylerin, esneklik ve istikrar eksikliği gibi, aynı zamanda veri toplama, analiz ve yorumlama zorlaştırıyor.

IEC kolonuna dolayısıyla bağlanma afinitesine yüklerine göre molekülleri ayıran ve iyon değiştirme kromatografisi, yerine veya SEC ilave olarak kullanılabilir. toplam yük kolayca kontrol el için nispeten basit bir pH değiştirme ya da tampon tuzu konsantrasyonunu değişen sağlayarak manipüle edilebilirIEC sütundan moleküllerin Katkı. yükü kullanarak, aksi takdirde ayrı zor olan benzer türde ve moleküllerin boyutları ayrılması, IEC rutin gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, IEC bir protein denatüre potansiyel riski taşıyan konsantrasyon adımları önlemek için izin seyreltilmiş örnekleri ile başa çıkmak mümkün olma avantajına sahiptir. Yük dağılımı yüksek Örnek bağımlı olduğundan, bu, IEC pH ve tuz konsantrasyonlarında 13,14 ilgili optimizasyon gerektirir.

Ifade saflaştırılması, veya her ikisi de zor olan birçok protein için, numunenin sadece düşük miktarlarda çalışma mevcuttur. Etkili olduğu ve bu nedenle, kayıp saflaştırma adımlarının sayısını en aza indirmek ve önemlidir. Bu nedenle, son saflaştırma adımı iyi bir veri seti toplama olasılığını artırmak amacıyla, çevrimiçi SAXS veri toplama doğrudan öncesidir.

İşteBiz mevcut ve çevrimiçi SEC-SAXS ve IEC-SAXS karşılaştırın. Her iki teknik Grenoble, Fransa 15 Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'nde (SDBY) en BioSAXS beamline BM29 üzerinde uygulanmıştır. Bir test case olarak, diğer yöntemleri kullanarak yapısal analiz etmek oldukça zor oldu aşı virüsü proteininin D5, bir D5N ve helikaz domain kullanılır. aşı virüsü Poxviridae ailesinin bir üyesidir ve variola virüsü, küçük çiçeği nedeni% 98 aynıdır. aşı sistemini kullanarak, temel sarmal primaz D5 burada odaklanarak, çoğaltma makineleri çalışma.

D5 sistein kümesi bir bölge (Res. 240-345) 16, ardından bir N-terminal Archeo-ökaryotik primaz (AEP) alan 16 ile 95 kDa proteinidir. Bundan başka Cı-terminalinde doğru D5N alanı (Res. 340-460) gelir, her D5 tipi helikazlar ile bağlantılı, ve son olarak bir süper 3 (SF3) helikas tanım olan (S. 460-785) 17 (Figüre 1 A). D5 helikas tanım dar DNA bağlanma için gerekli olan bir heksamerik halka yapısını oluşturur. Teşekkürler son SAXS ve EM çalışmalarına, primazm düşük çözünürlüklü yapıları ve sarmal alanları şimdi 18 bilinmektedir.

Burada, D5 (323-785 kalıntısı) C-terminal parçası yapısı içgörü kazanmak için SDBY de BioSAXS beamline BM29 uygulanan çevrimiçi kromatografi teknikleri nasıl kullanacağınızı gösterir.

Protocol

Bir D5 Silme Protein 1. Çevrim Hazırlanması açıklaması ve Örnek Nesil

Not: 18 tarif edildiği gibi D5 323-785 yapısı (Şekil 1 A), klonlanmış ifade edildi ve saflaştınldı.

  1. PProEx HTB vektörüne yapı Clone
    1. üreticinin tavsiye Aşağıdaki 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 've 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primerleri polimeraz ile PCR reaksiyon karışımı kullanılarak D5R bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uygulayın.
    2. Üreticinin tavsiye aşağıdaki spin sütunları üzerinden PCR parçaları arındırın.
    3. Tampon bileşimi ve kuluçkalama süresi için üreticinin tavsiyelerine uyarak, PCR parçalarını ve Ncol ve Hindlll sınır enzimleri ile plazmid Digest.
    4. , 0.5x TAE tamponunda bir% 1 agaroz jeli üzerinde parçaları (20 mM Tris, 10 mM asetik asit başlatve 0.5 mM EDTA) ve DNA boyası ile jel leke.
    5. UV ışığına jel Açığa.
      Dikkat: Kişisel güvenlik ekipmanlarını giyinin! üreticinin tavsiyelerini takip sindirilmiş PCR parçalarının bantları ve sindirilmiş plazmid kesip bir jel saflaştırma spin kolon kiti kullanarak DNA arındırmak.
    6. Hızlı bir ligasyon kiti kullanılarak imalatçının talimatları takip edilerek plazmide arıtılmış PCR parçalarını birbirine bağlamak.
    7. plazmid amplifikasyon için optimize yetkili bakteri içine ligasyon reaksiyonu ısı şoku üzerinden ürün Transform.
      1. bakteri şişeye Ligasyon ürünü yarısı ekleyin.
      2. 20 dakika boyunca buz üzerinde, reaksiyon tüpü inkübe edin.
      3. 30 sn için 42 ° C 'de tüp inkübe edin.
      4. 2 dakika boyunca buz üzerinde tüp yerleştirin.
      5. 1 Luria Bertani mL (LB) suyu (Miller), antibiyotikler olmadan ekleme ve hücreler 1 saat boyunca 37 ° C'de geri sağlar.
      6. 16.100 xg fo hücreleri aşağı Spinr3 bir masaüstü mikrotüp santrifüj lar ve orta çoğu kaldırın.
      7. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB agar plakası üzerine hücrelerinin yayılmasını ve koloniler, gece boyunca 37 ° C'de büyütülmüştür sağlar.
    8. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB 3 mL içinde bir koloni koyun ve bir gece boyunca 160 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de kültür büyür.
    9. plazmid ayıklamak için miniprep kiti talimatı uygulayın.
    10. sıralaması için plazmid bir örnek göndermek ve mutasyonların olmadığı için ve doğru biçimde takılmak üzere dizisini analiz.
    11. PProEx HTB D5 323-785 protein ekspresyonu için optimize bakteri içine inşa (1 uL kullanın ve adım 1.1.7 adımları izleyin) Transform. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB agar plakası üzerine bakterileri.
    12. bir başlangıç ​​kültürü oluşturmak için, ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB 300 mL bir koloni koymak ve 160 r çalkalanarak 37 ° C'de bakterileri büyümeyepm gecede.
  2. Ampisilin mevcudiyetinde LB 12 x 1 L inoküle (50 ug / ml nihai), 37 ° C de pProEx HTB D5 323-785 bakteri başlatıcı kültürün 20 mL her biri bir OD kadar 600 = 0.3 ulaşılır. 18 ° C'ye düşürülür ve 1 mM IPTG ile OD 600 = 0.5 de ifadesini teşvik eder. 160 rpm ve 18 ° C gecede onları sallayarak, kültürleri inkübe.
  3. 50.000 x g'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile bakteriler hasat. (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), 1x proteaz inhibitörü ile ve 25 ünite (lizis tamponu, yaklaşık 150 mL bakteriyel pelet yeniden süspanse U) / 10 ml DNaz. buz üzerinde sonikasyon yoluyla lyse bakteriler (1 inç probu,% 50 güç, 0,5-s nabız, 0,5-s duraklama, 3x 5 dk).
  4. nikel afinite sütunu (Ni-kolonu, 1.5 ml yatak hacmi) süpernatanların yerleştirin ve B için 10 kolon hacminde (CV) ile yıkayıntampon INDING (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), yıkama tamponu 10 CV (50 mM Tris-HCI [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), ve imidazol yıkama 10 CV (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, ve 30 mM imidazol). D5 323-785 Zehir (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, 200 mM imidazol).
  5. sodyum dodesil sülfat (SDS) -poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile farklı saflaştırma aşamaları kontrol edin.
    1. Yük 2-20 uL her bir saflaştırma adımı akış 1x yükleme boyası ile karıştırılmış a, 10 (2x% 4 SDS,% 20 gliserol, 120 mM Tris-HCI [pH 6.8] ve% 0.02 ağırlık / mavi birim bromofenol) % SDS jel ve çalışan tampon 1x Laemmli 200 V'da çalıştırmak (25 mM Tris, 0.192 M glisin, ve% 0.1 SDS) eritilmiştir.
    2. hazır kullanımlı Coomassie mavisi solüsyonu ile jel leke.
  6. hariçhange, üreticinin kılavuzuna göre bir tuz giderme kolonu kullanılarak bağlama tamponu ile yıkandı protein tamponu.
  7. Protein çözeltisine Tütün Etch Virüsü Nükleer dahil-a endopeptidaz (TEV, protein 1 mg / 100 mg) ilave edilerek His-tag bölmektedir. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  8. SDS-PAGE gerçekleştirerek sindirim kontrol edin (adım 1.5 bakınız)
  9. bağlama tamponu içinde Ni-sütunu dengelenmesi. protein çözeltisi geçmesine ve flow-through toplarken imidazol yıkama tamponu 2 CV ile boncuk yıkayın edelim.
  10. 0.5 mL'lik nihai bir hacme kadar bir santrifüj konsantratör kullanılarak protein konsantre edilir.
  11. jel filtrasyonu tamponu ile dengelenmiş bir boyut dışlamalı kolonuna yoğunlaştırılmış protein enjekte (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 10 gliserol ve 1 mM ditiotreitol [DTT]).
  12. 0.5 ml fraksiyonlar halinde akış yoluyla toplayın.
  13. pik örnekleri ile protein varlığı ve saflığını kontrolSDS-PAGE performans (adım 1.5 bakınız).
  14. D5 323-785 arasında elüt tepe kısımları birleştiriniz. 20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 10 gliserol ve 1 mM DTT protein çözeltisi, 5 mL için (sabit Tris DTT konsantrasyonlarını tutarken 25 mM NaCI numune ve% 5 gliserol ile seyreltilir, Önce, 20 mM Tris-HCI [pH 7] ve 1 mM DTT 5 mL, ve daha sonra 20 mM Tris-HCI [pH 7], 5% gliserol, 1 mM DTT) 20 ml.
  15. bir iyon değişim kolonuna örnek yükleyin. tampon kullanarak (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl,% 5 gliserol ve 1 mM DTT) ve tampon B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl,% 5 gliserol ve 1 mM DTT) içinde 25 mM ile 1 M'ye bir tuz gradyanı oluşturulması için
  16. 1.5 mL parçalara ayrıştırılmıştır proteini toplamak.
  17. SDS-PAGE gerçekleştirerek pik örneklerinde protein varlığı ve saflığını kontrol (adım 1.5 ve Şekil 1B'ye bakınız)
  18. 0.5 mL'lik nihai bir hacme kadar bir santrifüjlü konsantre protein çözeltisi Reconcentrate.
  19. Rerun, jel süzme tamponu içinde bir boyut-eksklüzyon kolonu üzerine konsantre edilmiş protein (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 5 gliserol, 1 mM DTT, adım 1.11 bakınız).

2. Veri Toplama

NOT: mümkün olduğunca erken Talebi ışın zamanı. SDBY için mevcut erişim türleri ve bir dilekçe nasıl kılavuzlar bulunabilir:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Teklifin kabulü ve deney için bir davetiye sonra, tüm katılımcıların güvenliği eğitimlerini tamamlamak zorunda. Eğitim onaylanmasından sonra, numuneler üzerinde gerekli güvenlik bilgisi ile birlikte deney için beamline ziyaret araştırmacıları beyan etmek (SDBY kullanıcı portalı üzerinden) "Bir-form" doldurun. Denemeyi görüşmek üzere yerel irtibat görevlisine başvurun.

  1. SEC-SAXS veri toplama
    NOT: ONL içinine arıtma, BM29 kurulu yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sistemini kullanıyoruz. Sistem, bir in-line gaz alıcı, ikili pompa, tampon seçimi ve gradyanlar, bir otomatik numune alıcı, bir UV dizi fotospektrometre ve kondüktivimetre için bir valf içerir. Doğrudan SAXS maruz birimi 19 akış kapiler takılır.
    1. kenara jel filtrasyon 1 ml tampon koyun. SEC sistemine tampon şişe takın (varsayılan Liman A).
    2. Kullanılan sütun bağlı olarak akış oranını seçin. Not: Burada kullanılan boyut dışlamalı sütun için, akış hızı 0.1 mL / dakikadır. , Sütun için maksimum basıncı tanımlayın geri basınç dikkat ve en az 1.2 CV edinimi süresi ayarlayın.
    3. "Otomatik tasfiye" fonksiyonu ile pompa ve yukarı tüpler yıkayın.
    4. Sistem tamponu ile dolana kadar bekleyin ve sütun bağlayın. en az 1.5 CV geçerek sütun dengeye.
    5. interlokdolap nedeniyle radyasyon hasarı sinyal değişimi kontrol etmek için numune değiştirici kullanırken, adım 2.1.1 kenara tampon ölçün. tampon radyasyon hasar olup olmadığını sadece devam ediyor.
    6. HPLC moduna beamline kontrol sistemini açın. kare başına 1 sn ile 200 kare toplama, tampon bir deneme sürüşü yapın. özetlenebilir yoğunluk arsa detektör tarafından verilen sayıyı yazın.
      NOT: Sinyal önce ölçülen tampon eşleşmesi gerekir, ve zamanla özetlenebilir yoğunluğu sabit kalmalıdır. Sinyal eşleşen ya da sabit değildir takdirde, sistemin daha uzun bir dengeleme gereklidir.
    7. En az 10 dakika süreyle bir masaüstü mikrotüp santrifüj 13.000 xg'de örnek aşağı doğru döndürün.
    8. (Verilen) HPLC-uyumlu cam şişenin içine örnek doldurun ve otomatik enjektör koydu. kuyu konumuna dikkat edin.
    9. Kullanıcı Güvenliği Eğitimi açıklandığı gibi, standart prosedür kullanılarak deneysel baraka kilitlenebilir.
    10. giriş yapın ve beamline kontrol yazılımı sayesinde veri depolama için bir klasör oluşturun.
    11. "Hızlı toplu" özelliğini kullanarak HPLC sistemi programlayın. Adım 2.1.10 oluşturduğunuz klasöre UV veri depolama konumunu ayarlayın. Aynı klasörde ASCII dosyasını depolamak, UV verilerinin otomatik ASCII dönüşümünü aktive etmek için emin olun.
      1. Enjeksiyon hacmi ve iyi pozisyon seçin. "Başlat" düğmesine basarak sıraya ölçümü ekleyin. Yazılım toplu kaydetmek için sorar. kaydetmek için hazırlayın, ama bu otomatik ölçümü başlar, "Kaydet" düğmesine basmayın.
    12. beamline kontrol yazılımı veri toplama parametrelerini ayarlayın. Toplam veri toplama süresi aşama 2.1.2 tanımlanan edinim süresi biraz fazla olacak şekilde kare sayısını seçin.
    13. Emniyet deklanşör açın ve beamline kontrol yazılımı kullanarak SAXS veri toplama başlar. veri kor olduğundan emin olundüzgün biçimde satın aldı. Adım 2.1.6 toplanan verilere yeni toplanan verileri karşılaştırmak ve toplanır yoğunluğu sayımların sayısı en az 100 kare için sabit kalır ve adım 2.1.6 değeri ile eşleşen olmadığını kontrol edin.
      1. Adım 2.1.11 gibi hazırlanan SEC, "Kaydet" düğmesine basarak çalıştırın başlayın, ve enjeksiyon tamamlanmış ve UV veri toplama başlar zaman camserver yazılımında görüntülenen kare numarasını not alın.
    14. Veri toplama sonra, Açık'ta "veri toplama" sekmesine ISPyB veritabanını 20 açın ve veri seti ve otomatik analiz 21 sonuçlarını erişmek için "git" düğmesine basın.
  2. IEC-SAXS veri toplama
    Not: Bunun yerine sık IEC deneyleri için sürekli lineer gradyan tampon B miktarı, önceden belirlenmiş farklı aşamalarda artan edildiği bir adım adım gradyanı kullanın.
    1. Bir sampl HPLC program oluşturunE-ücretsiz tampon çalıştırın. adım adım gradyanı% 0 tampon B başlayan ve tampon B% 100 ulaşana kadar iki CV sonra 5 puan artarak programlayın.
    2. bir kenara, her tampon bazı koyun. port A düşük tuz tampon A ve liman B. yüksek tuz tampon B ile biri ile şişeyi bağlayın
    3. akış hızı seçin ve sütun basınç limiti altında kalmak (bu örnekte, 1 mL / dakika).
    4. Adım 2.1.3 gibi, "auto-tasfiye" işlevini kullanarak pompa ve yukarı tüp yıkayın.
    5. düşük tuz tamponu A sistemi dengeye (adım 1.15) ve iyon değiştirme sütunu bağlayın. Kolon tamamen (en az 1,5 CV) dengelenir kadar bekleyin.
    6. Adım 2.1.5 olarak, örnek değiştirici kullanarak radyasyon hasar tamponlar A ve B incelemek için adım 2.2.2 kenara tampon kullanın.
    7. tampon adım 2.1.6 gibi sütunun çıkan edin. Aşama 2.2.6 kaydedilen tampon A sinyale Karşılaştırması. tekrar Notözetlenebilir yoğunluk arsa sayımların sayısı.
    8. tampon çalıştırmak için veri depolama için bir klasör oluşturun.
    9. HPLC sistemi modunda kurmak veri toplama. toplam veri toplama zamanı IEC vadede toplam zamanı aşan böylece kare sayısını seçin (adım 2.2.1 bakınız).
    10. Emniyet deklanşör açın ve SAXS veri toplama başlar. doğru ilerler emin olun ve toplanır yoğunluk en az 100 kare için adım 2.2.7 not değerde sabit kalır çift kontrol edin.
    11. HPLC yazılımı "Tek Çalıştır" özelliğini kullanın ve adım 2.2.1 programlanmış adım adım degrade başlatın. Enjeksiyon için bu adımda herhangi bir örnek enjekte etmek için -1 şişe sayısını ayarlamak. Program başladığında iktisap edilen kare sayısını yazın.
    12. Örnek çalıştırmak için HPLC programı oluşturun. (Tampon B. Tahmini% 0 aşamasında 1.1.5 çevrimdışı ölçülen her zirvede tampon B yüzdesi başlayarak adım adım degrade Program (Şekil 1C) için her ayarlayın. 2.5 CV% 100 tampon B'de bir son adımı ekleyin.
    13. En az 10 dakika süreyle bir masaüstü mikrotüp santrifüj 13.000 xg'de örnek aşağı doğru döndürün.
    14. 20 mM Tris-HCI [pH 7],% 10 gliserol ve 1 mM DTT ile karıştırılarak tampon A (25 mM) bir tuzu konsantrasyonu D5 323-785 seyreltilir.
    15. kolona elle örnek yükleyin. hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için pompa duraklatma sonra seyreltilmiş numune içine bir tampon bir giriş tüpü koyun. doğrudan akış yoluyla sütundan toplamak dedektörleri sütunu ayırın.
      1. Numune kabı boşaldığında, (tüp taşırken yine pompaları duraklatma) tampon A içine girdi tüp dönmek ve sütun tüp örnek aktarmak için tampon A ile pompalama yeniden başlatın. Tüm örnek olmuştur kezYüklenen, tampon A 2 CV geçmek ve daha sonra dedektörleri sütun bağlayın.
    16. numune çalışması için, veri depolama için bir klasör oluşturun.
    17. Emniyet deklanşör açın ve SAXS veri toplama başlar. veri toplama doğru ilerler emin olun ve toplanır yoğunluk en az 100 kare için adım 2.2.7 not değerde sabit kalır çift kontrol edin.
    18. Adım 2.2.12 programlanan adım adım degrade başlatmak için HPLC yazılımı "Tek Çalıştır" özelliğini kullanın. Enjeksiyon için bu adımda herhangi bir örnek enjekte etmek için -1 şişe sayısını ayarlamak. Program başladığında iktisap edilen kare sayısını yazın.
    19. Açık ISPyB 20 "veri toplama" ve basın veri seti ve otomatik analizi 21 bakmak için "git".
    20. "Postrun Analizi" yazılımı aracılığıyla, ASCII biçimine HPLC sistemine UV verilerini dışa aktarın.

3..SEC-SAXS Veri Azaltma ve Analiz

  1. "Git" düğmesine basarak ISPyB veri edinimi verileri açın. SAXS veri toplama çerçeveleri genel belirlemek elüsyon tepe karşılık gelmektedir. dönme yarıçapı zirve boyunca sabit olduğundan emin olun.
  2. Otomatik tampon düzeltme doğru olarak yapıldığını doğrulayın. 22 dosyaları ve bunları ortalama deneysel SAXS verilerle manipülasyonlar gerçekleştiren bir programa tepe orta kesiminde yük çerçeveleri. Ardından, otomatik olarak oluşturulan tampon dosyasını yüklemek ve ortalama kare yüksek q bölgeleri ve tampon çerçeveleri maç olmadığını kontrol edin.
  3. Kantitatif CORMAP testi 23 kullanılarak zirve boyunca edinilen çerçeveleri karşılaştırın.
    1. ilgi bölgeyi kapsayan çerçeve otomatik olarak oluşturulan çıkarmalar (* _sub.dat dosyaları) yükleyin.
    2. "Ölçek" düğmesine basarak onları birbirine Scale.
    3. karş"Veri Karşılaştırma" özelliğini kullanarak bunları e. zirve boyunca Çerçeveler arasında hiçbir sistematik bir değişiklik olmamalıdır.
  4. Tüm ilgi çekici * -_ sub.dat çerçeveleri açın "Birleştirme" düğmesini kullanarak onları birleştirme ve Dat formatında birleştirilmiş dosyayı kaydedin.
  5. düşük çözünürlükte veri daha sonra kırpma için Guinier aralıktaki ilk veri noktasını belirterek, programda "Radius dönme" aracı ile dönme yarıçapı belirleyin.
  6. Programda "Uzaktan Dağıtımı" aracıyla çift mesafeli dağıtım fonksiyonunu belirlemek ve gnom.out olarak ortaya çıkan .out dosyayı kaydedin.

4. Ab İnitio Modelleme

  1. Unix makinada, simetri kısıtlama olmadan 40 x ab initio modeli yeniden programını çalıştırın. Yeni bir klasör oluşturun ve buna gnom.out dosyasını kopyalayın. aşağıdaki gibi programı çalıştırın:
    için ((i = 1; i = 40 <; i ++)); gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i dammif yapmak; dbir
  2. Benzer şekilde, ikinci bir klasöre altı kat simetri için simetri kısıtlamaları ile bir ab initio modeli yeniden programı çalıştırın:
    için ((i = 1; i = 40 <; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; tamam
  3. Tüm ab initio modeli yeniden programı çıktı dosyalarını aynı hizaya getirin (* -1.pdb). adımlarda 4.1 ve 4.2 iki klasörlerinde, damaver -a * -1.pdb çalıştırın.
  4. Tüm modellerde (damaver.pdb) yanı sıra uygun bir moleküler görüntüleme yazılımı 26 doğru hacmi (damfilt.pdb) süzülmüş modelin birliği açın ve bunları karşılaştırmak.
  5. bir metin düzenleyicisinde damsel.log dosyasını açın. Dosyanın altındaki "referans" olarak listelenen modeli en iyi temsil eden bir modeldir.

5. IEC-SAXS Veri Azaltma, Analiz ve Modelleme

  1. Deneysel SAXS veri dosyaları 22 manipülasyonu yerine programında, yaklaşık 50 SAXS her karıştırma aşamasından kare yüktampon çalıştırmak, "ORTALAMA" düğmesine basın ve sonuçları kaydedin.
  2. ISPyB üzerinden kullanılabilir otomatik işleme sonuçlarına dayanarak, deney çerçeveleri hangi belirlemek protein elüsyon uygun ve dönme (ön) yarıçapı tepe boyunca sabit olduğundan emin olun.
  3. Deneysel SAXS veri dosyaları işleme programı 22 içine çerçeveleri yükleyin ve tampon çerçeveleri (bkz: adım 5.1) için yapıldığı gibi, onları ortalama. Ardından, adım 5.1 oluşturulan tampon dosyaları yüklemek ve zirveden ortalamasını eşleşen bir tampon bulmak için (4.2 nm -1 üstünde) yüksek q bölgeleri karşılaştırın.
    NOT: tepe ve tampon ortalaması arasındaki ofset sistematik olmalıdır. Örnek eğrisi iki tampon eğrileri arasındaki düşmek görünüyorsa, ortalama hesaplayarak kendi eğrileri enterpolasyon.
  4. tepe kısmının ortalama saçılma eğrisinin en iyi eşleşme olarak tanımlanan tampon çıkarma ve elde edilen subtr tasarrufhareket dosyası. Buna ek olarak, çıkarma hata marjı tahmin etmek önceki ve sonraki karıştırma adımları ortalama tampon eğrileri kullanılarak Çıkarılmış eğriler oluşturmak.
  5. Tekrarlayın tepe sol ve sağ yarısı için ayrı ayrı 5,3 ve 5,4 adımları ve zirve boyunca sinyal istikrarı kontrol etmek için adım 5.4 gelenler sonuçları karşılaştırın.
  6. adımları adım 5.4 den üç çıkarılır eğriler için 3.5 ve 3.6 izleyin.
  7. Her üç çıkarılır eğriler için sonuçları karşılaştırın.
    Not: çıkarma hata payı içinde sağlam kalır Yalnızca sonuçlar güvenilir olabilir.
  8. adım 5.3 tanımlanan iyi çıkartma için 4.1 ve 4.2 adımları olarak modelleme gerçekleştirin.
  9. modelleri hizalamak için 4.5'e 4.3 adım ve en iyi temsil eden bir tespit izleyin.

Sonuçların 6. Karşılaştırılması

  1. SEC temsilcisi modelleri 12 3D yapılar üst üste bir programı çalıştırmak (adım 4.5) birP6 simetri d IEC SAXS verileri (5.9 adım): supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. model_sec.pdb ve moleküler görüntüleme yazılımı içine model_iec-r.pdb alın.
  3. modelsec.pdb ve .fir dosya ve bir e-tabloda modeliec-r.pdb açın ve deneysel ve hesaplanan saçılma eğrileri 2D grafik oluşturmak.

Representative Results

Modelsiz değişmeyen analizinin sonuçları Tablo 1 'de listelenmiştir. D5 323-785 SEC-SAXS verilerin analizi 338 kDa karşı 345 kDa (a poród analizinden) bir moleküler kütle tahmin gösterdi IEC SAXS kullanılarak gözlemlendi. Her ikisi de bir heksamer için 6 kez 53.5 kDa (321 kDa) beklenen kütle ile uyum içindedir. Her iki veri setinin ab initio modelleme hiçbir empoze simetri ile yapılmıştır (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ve C6 simetrisi kullanarak (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Her iki rekonstrüksiyon için yayılma verilerine genel uyan iki durumda (Şekil 1D ve E) karşılaştırılabilir olduğu için, C6 simetri varsayılabilir. Bu nedenle, bir model (SEC kısmen engellenmiş görünen bir merkezi kanal, bir altıgen koni benzeri bir yapı ile ilgilidir: Şekil 1F; IEC: Şekil 1H). Ortalamanın önce bireysel modellerin incelenmesi bu tıkanıklık ortalama sürecinin bir dışlayıcı olması muhtemel olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1: SAXS veri analizi ve karşılaştırma D5 323 -785 (şekil Kaynaklar 12 ve 18 uyarlanmıştır). D5 protein ve D5 323-785 A) şematik alan yapısı. B) Üç zirveleri göstergesi ile Çevrimdışı iyon değişim kromatogram. Turuncu eğrisi: 280 nm (au), mavi eğri de Absorbans: zirveleri tampon B tampon B. Yüzde yüzdesi belirtilir. C) Online iyon değişim kromatogram. B. olarak renk anahtarı Ayrıca, ölçülen yoğunluk, yeşil olarak gösterilir. Deneysel saçılma eğrisind SEC-SAXS D) ve IEC E) D5 323-785 veri analizi ile elde edilen modelin eğrisi hesaplanır. SEC veri ve G) IEC verilerine dayanarak D5 323-785 F) Boncuk modeli. SEC ve IEC modelleri H) Yerleşimi. F paneller) H) bir moleküler görüntüleme yazılımı 24 kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Veri toplama parametreleri
Enstrüman: SDBY BM29
Dalga boyu (A) 0.99
q-aralık (Å -1) ,0032-,49
Örnek-dedektör mesafesi 2,864 m
Pozlama süresi (sn) kare başına 1
konsantrasyon aralığı na
Sıcaklık (K) 293
detektör Pilatus 1M (Dectris)
Akı (fotonlar / s) 1 x 10 ila 12
Işın boyutu (mikron 2) 700 x 700
D5 323-785, SEC için yapısal parametreleri
Ben 0 (cm-1) [guinier dan] 0,0237
Rg (A) [guinier dan] 48
R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg 0,77-1,24
Dmax (a) [p (r)] 145
p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1) 0,02-0,17
Poród hacmi V (p Å 3) [Scatter dan] (570 ± 5) 10 3 ×
Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] 345
dizisinden monomerik Sn Hesaplanan (kDa) 321
D5 323-785, IEC için yapısal parametreleri
Ben 0 (cm-1) [guinier dan] 0.386
Rg (A) [guinier dan] 46.5 ± 0.1
R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg 0,44-1,29
Dmax (a) [p (r)] 120
p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1) 0,03-0,18
Poród hacmi V (p & #197; 3) [Scatter dan] (577 ± 5) 10 3 ×
Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] 339
dizisinden heksamerik Sn Hesaplanan (kDa) 321

Tablo 1: SAXS veri parametreleri. tablo SAXS veri toplama ve analiz parametrelerini özetlemektedir.

Discussion

Birçok makromoleküller için kromatografi kullanılarak, son bir arıtma adımı kaliteli bir veri seti elde etmek için SAXS veri toplama öncesinde gereklidir. Ancak, tüm numuneler sabit kalır; onlar oligomerizasyon devletler karışımına toplama veya yeniden dengeleme eğilimli olabilir. Bu nedenle, ışın-hattı ile ilgili son bir çevrimiçi saflaştırma adımı en kaliteli SAXS verilerini elde etmek üzere saflaştırma ve veri toplama arasındaki süreyi en aza indirmek için kullanılır. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, sek-SAXS veya IEC-SAXS uygun örnek kalitesini elde etmek için seçilebilir. Burada, helikaz / primaz D5 türetilmiş bir protein yapı üzerinde, hem teknik açıklanmış ve tartışılmıştır.

SEC-SAXS veri toplama daha standardize hale geliyor ve birçok BioSAXS ışın demetleri üzerinde temin edilebilir. Veri analizi, özellikle arka plan çıkarma, nispeten basit ve kolaydır. Bununla birlikte, sabit bir tampon sinyalininve makromoleküler türlerin yeterli ayrılması esastır kalır. Nedenle, iyice sütun dengelenmesi için yeterli zaman ayırmak önemlidir. Bu yöntemin arıza çıkar, düşük konsantrasyonlarda, ve radyasyon duyarlı tamponların proteine ​​benzer büyüklükte kalıcı kirletici bağlı olabilir.

Uygulamada, ilk, sek-SAXS en makromoleküler örnekler için tercih edilen yöntem olarak kullanılması olasıdır. Yine de, birçok saflaştırma protokolleri kirletici ya toplanmasının varlığı nedeniyle, önceki IEC adım gerektirir. Her bir konsantrasyon ve kromatografi aşaması (% 30-50 olduğu tahmin) örnek ve zaman kayıpları ile bağlantılı olduğu göz önüne alındığında, doğrudan IEC SAXS avantajlıdır. SEC tarafından arıtılmış edilemez numuneler için, nedeniyle benzer büyüklükteki "kirletici" varlığı ya da gerekli konsantrasyonlarda ciddi agrega, IEC-SAXS her zaman daha iyi uygundur yaklaşım olurdu çünkü olsun. Ayrıca, daha yüksek akış hızları desteklenenbirçok kişi tarafından IEC sütun saflaştırma ve ölçüm arasındaki geçiş süresini azaltmak için yardımcı olabilir. Burada verilen örnekte, IEC dikkatle tuz konsantrasyonu adımları seçerek kirletici maddelerden D5 323-785 yakın tepe ayrılması için sağlayan bir adım elüsyon ile kullanılmıştır. Prensip olarak, adım sayısı sınırsızdır ama pratikte, tepe başına en az 1 adım gereklidir ve çok az seçilmelidir. Yukarıda tarif edilen arka plan çıkarma yöntemi için, uygun bir bulmak için farklı tampon terkipleri arasında, nispeten yüksek bir sayısını ölçmek için çok önemlidir.

Her iki teknik bir ortak dezavantajı kesin protein konsantrasyonu bilgi eksikliğidir. Buna bağlı olarak, ileri saçılma göre hassas kütlesinin belirlenmesi mümkün değildir. Böyle D5 323-785 olarak küresel proteinler için, poród hacmi son derece esnek ve düzensiz proteinlerin ancak, daha az hassas, kitle tahmin olsa bir alternatif sağlarBu yaklaşım geçerli olmaz.

Burada sunulan basamaklı gradyan IEC SAXS yöntemin bir varyasyonu yerine bir doğrusal gradyan kullanılmasıdır. Bu adım adım elüsyon kullanılarak alt tepe izole etmek için arzu edildiği gibi doğrusal gradyan yaklaşımda, birçok adımda çalışmak mümkün olsa da, bunun tamamıyla SAXS başlamadan önce tepe ayırmak üzere dikkatlice gradyan koşulları optimize etmek için gerekli olan deney. Bu yaklaşımda arka plan çıkarma çerçeve bilge yapılabilir ve tek tek kare karşılaştırılması tarafından doğrulandı olabilir, ama daha gelişmiş veri işleme gerektirir ve özel bir yazılım henüz mevcut değil.

Bu makromoleküler türlerin ayrılmasına belirler gibi uygun bir sütunu, her iki usul için çok önemlidir. iyon-değişim kolonları tür ve yoğunluk değişiklik gösterir boyut dışlama kolonlar, yükleme kapasitesi, ayrılabilir makromoleküllerin boyut aralığı ve çözünürlükte farklılıkonların hareketsiz ücretleri.

Burada sunulan protokol basit prensip olarak herhangi bir diğer SAXS beamline da SDBY beamline BM29, adaptasyon, özel olsa. Ana şartlar oluşturma yeteneğine sahip yeterli derecede yüksek olan X-ışını akışı saniye ya da daha az aralığında uygun bir sinyal-ses verileri elde etmek için, uygun bir detektör (ideal olarak tek foton sayımı), ve bir online sıvı kromatografi sistemi vardır geçişlerini. Tam uygulama, tabii ki, yerel beamline çevre bağlı olacaktır.

Iki yöntemi kullanarak D5 323-785 üzerinde elde edilen sonuçlar biraz farklıdır. dönme yarıçapı SEC verileri için olana göre IEC verileri için biraz daha küçük olan, ve dağılma eğrisinin lokal minimum biraz daha büyük yayılma vektörleri kaydırılır. Bu IEC SAXS ölçülen D5 323-785 biraz daha kompakt SEC-SAXS ölçülen D5 323-785 fazla olduğu anlamına gelir. Bu b olabilirSEC-saflaştınldı numunede bir kirletici daha az saflaştırma ve ölçüm tarihleri ​​arasında örnek hazırlama farklılıklar, (IEC hızlı) ya da, bağlı ör. Her iki yöntemde tamamen bağımsız olarak elde boncuk modelleri (Şekil 1H) karşılaştırılabilir. D5 323-785 beklenen içi boş, heksamerik yapıyı 18 göstermektedir.

Sonuç olarak, çevrimiçi iyon değiştirme ve çevrimiçi boyut dışlama kromatografisi SAXS 6,7,9-12,25,26 doğrudan akuple edilebilir önemli biyokimyasal saflaştırma yöntemleri bulunmaktadır. IEC-SAXS verilerinin arka plan çıkarma biraz SEC-SAXS için daha zor ve belirsiz, ama yine de mümkündür. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, SEC ve IEC SAXS hem doğal avantajlarına sahip türlerin ayrılması optimizasyonu için izin verir. doğrulama adımları (açıklandığı gibi) doğru gözlenir olduğunu, elde edilen verilerin analiz edilebilir zekâ sağlanmasıh güven ve modeller toplum içinde mevcut standart aletler kullanılarak tespit edilebilir. Birlikte, her iki tekniğin standart statik ölçümler üzerinden erişilebilir değil veri verimli, biyolojik makromoleküllerin geniş bir aralığı için çevrimiçi ayrılmasına izin verildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics