一种利用共振能量转移（FRET）的生物传感器-force议定书衡量所有核LINC复杂的机械力
2017年4月11日
最近开发了许多基于 FRET 的力生物传感器，能够实现细胞内力的蛋白质特异性解析。在该协议中，我们演示了如何使用这些传感器之一，专为核骨架-细胞骨架 （LINC） 复合物蛋白 Nesprin-2G 的连接子而设计，用于测量肌动球蛋白对核 LINC 复合物的力。
该程序的总体目标是通过专为 LINC 复合物蛋白 nesprin-2G 设计的生物传感器，通过活细胞中的 FRET 显微镜确定核骨架细胞骨架或 LINC 复合物接头上的力。这种方法可以帮助回答机械转导领域的关键问题，例如施加在活细胞核中蛋白质上的力，以及这些力在变化条件下如何变化。该技术的主要优点是它能够测量蛋白质和活细胞上非常小的力。
通常，刚接触这种方法的人会难以捕捉图像。优化显微镜激光功率和增益以在所有实验组之间接收到良好的信号是很困难的。首先，在具有温度和 CO 2 调节的标准细胞培养箱中的六孔细胞培养皿中，将 NIH 3T3 纤维原始细胞培养至 70% 至 90% 汇合。
在细胞培养通风橱中，取出培养基，并用大约 1 mL 的还原血清细胞培养基冲洗每个孔。向每个孔中加入 800 μL 还原血清细胞培养基，并将 6 孔室放入培养箱中。然后，将 700 微升还原血清细胞培养基移液到标有 L 的 1.5 毫升试管中，其中含有 35 微升脂质载体溶液，以形成脂肪混合物。
通过移液混合悬浮液。接下来，将 100 μL 还原血清细胞培养基移液到 6 个 1.5 mL（标记为 1 到 6）的试管中。如文本方案中所述，将用于 nesprin 张力传感器、nesprin 无头零力控制、mTFP1 和 venus 的血浆 DNA 移液到试管 1 到 6 中。
移液不同类型 DNA 时，请勿重复使用移液器吸头。然后，从 L 管中吸取 100 微升脂肪混合物到每个标记的试管中，并通过重复移液混合，使用干净的移液管为每管使用。将悬浮液孵育 10 到 20 分钟。
接下来，从每个标记的试管中加入 200 微升到准备好的含有细胞的六孔室的孔中。用添加的相应 DNA 标记每个孔的顶部。然后，将 6 孔室放入培养箱中 4 到 6 小时。
孵育后，吸出培养基，并加入 1 至 2 mL 还原血清细胞培养基进行冲洗。吸出还原的血清细胞培养基，向每个孔中加入 2 mL 胰蛋白酶，然后将 6 孔培养皿放入培养箱中 5 至 15 分钟。当细胞在培养箱中分离时，在六个玻璃底观察皿上涂上一层浓度为 20 μg/mL 的纤连蛋白，溶于磷酸盐缓冲盐水中。
让培养皿涂覆在细胞培养罩的表面。细胞分离后，通过添加 2 毫升 DMEM 来中和胰蛋白酶。然后，将每个孔的内容物转移到标记的 15 mL离心管中，并在摆动转子离心机中以 90 g 离心 5 分钟。
吸出上清液，并使用移液管将每个细胞沉淀重悬于 1， 000 μL DMEM 中。从玻璃培养皿中吸出纤连蛋白混合物，并将 1， 000 微升每种细胞悬液移液到培养皿上。细胞沉降到玻璃培养皿底部后，向每个孔中再添加 1 mL 培养基。
让细胞在细胞培养箱中附着和表达传感器至少 18 至 24 小时。为了验证转染效率，使用荧光显微镜，mTFP1 的激发频率接近 462 纳米，金星的激发频率接近 525 纳米。对于 mTFP1，使用以 492 纳米为中心的发射滤光片，或对金星使用以 525 纳米为中心的发射滤光片。
完成转染后大约 18 至 24 小时，使用倒置荧光显微镜将荧光细胞数量与所见细胞总数进行比较，以检查转染效率。如果转染后 48 小时内无法对活细胞进行成像，请将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 5 分钟。固定前让细胞表达传感器 24 至 48 小时。
将细胞储存在 PBS 中，并在 48 小时后查看。在细胞培养罩中，用补充有 10% 胎牛血清的成像培养基替换细胞培养基。将观察皿置于温控共聚焦显微镜载物台中。
将装有 mTFP1 转染细胞的玻璃观察皿以 60 倍放大倍率和数值孔径 1.4 放在油物镜上。在宽场荧光模式下定位表达 mTFP1 的细胞。在视野中有一个荧光池，选择光谱检测模式并捕获光谱图像。
包括 458 纳米以外的所有频率，增量为 10 纳米。在细胞上选择一个明亮的荧光区域。通过单击将光谱保存到数据库，将荧光 ROI 平均值作为归一化强度添加到光谱数据库中。
优化激光功率和增益，以实现良好的信噪比。设置因设备而异。对表达金星的细胞重复该过程并保持光谱模式。
使用 488 纳米而不是 458 纳米的激发频率。根据需要调整功率设置，但不要更改发射频率。选择半径约为 20 像素的明亮荧光 ROI。
通过单击 Save Spectra to Database，将荧光 ROI 平均值作为归一化强度添加到光谱数据库。要捕捉未混合的图像，请先将捕捉模式切换到光谱解混。将 venus 和 mTFP1 的光谱指纹添加到解混通道中。
将激发激光器设置回 458 纳米氩源。将 nesprin 张力传感器观察皿放在 60 倍油物镜上方。聚焦在具有足够明亮表达的荧光细胞上后，调整增益和激光功率以优化信噪比。
捕获至少 15 到 20 张亮度相对相似的 nesprin 张力传感器单元图像，并避免过高的像素饱和度。使用相同的成像参数用 nesprin 无头细胞重复图像捕获过程。此处显示了使用脂质介导的载体用 nesprin 张力传感器转染 3T3 成纤维细胞的代表性 10X 放大图像。
通常，在给定的视野中仅转染一小部分细胞。这里显示的是一对具有代表性的两个 3T3 细胞核，它们在光谱未混合的金星通道和 mTFP 通道中表达 nesprin-TS。两个通道的合并彩色图像显示在最右侧的面板中。
这是来自图案化和无图案衬底上稳定表达 MDCK 细胞的 nesprin-TS 掩蔽细胞核的代表性样本。比率图像定义为金星通道除以 mTFP 通道的比率，可用于进行相对定量力比较。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约八个小时内完成。
在尝试此过程时，请务必记住在转染过程中仔细标记 DNA 管，并在捕获光谱结果图像时保持成像参数恒定。观看此视频后，您应该对如何使用 nesprin 张力传感器转染细胞以及将光谱分辨图像捕获到与张力传感器上的力相关的计算机 FRET 指数有很好的了解。虽然在这种情况下，FRET 传感器用于 nesprin，但它也可以应用于细胞中需要测量力的其他蛋白质。
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概述
该协议展示了使用FRET基生物传感器来测量活细胞中核LINC复合蛋白Nesprin-2G上的肌动蛋白力。它旨在阐明作用于核骨架-细胞骨架连接器（LINC）复合物的力。
关键研究组成部分
科学领域
- 机械转导
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- LINC复合物连接核与细胞骨架。
- 了解LINC复合物上的力对于洞察细胞力学至关重要。
- FRET显微镜允许在活细胞中测量小力。
- 挑战包括优化成像条件以准确捕获数据。
研究目的
- 测量活细胞中LINC复合物上的力。
- 研究这些力在不同条件下的变化。
- 增强对机械转导过程的理解。
使用的方法
- FRET显微镜以可视化力的应用。
- 使用特定于Nesprin-2G的生物传感器。
- NIH 3T3成纤维细胞的细胞培养。
- 优化显微镜设置以进行有效成像。
主要结果
- 成功测量了LINC复合物上的肌动蛋白力。
- 洞察核的机械环境。
- 识别影响力测量的因素。
- 展示了生物传感器在活细胞成像中的有效性。
结论
- FRET基生物传感器是研究核力学的宝贵工具。
- 该方法提供了对细胞力动力学的新见解。
- 进一步的研究可以扩展对机械转导的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of mechanical forces across the nuclear LINC complex using FRET-force biosensors enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation. This approach provides predictive confidence for understanding force transmission pathways relevant to cellular mechanotransduction. Integrating these measurements supports portfolio decisions by clarifying the biological impact of nuclear-cytoskeletal connectivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of force transmission through the LINC complex in live cells.
- Supports functional validation of mechanotransduction targets by quantifying protein-level forces.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing force-dependent versus force-independent pathways.
- Provides predictive data for prioritizing targets involved in nuclear-cytoskeletal signaling.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ratiometric imaging assays for force measurement in cellular systems.
- Standardizes spectral unmixing and quantitative FRET analysis for reproducible outputs.
- Enables comparison of force dynamics across experimental groups and genetic constructs.
- Prepares robust assay platforms for downstream compound screening targeting mechanotransduction.
Translational & Preclinical Research
- Aligns force measurement outputs with disease-relevant mechanotransduction models when applicable.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Provides quantitative endpoints for evaluating intervention effects on nuclear force transmission.
- De-risks translational advancement by clarifying the role of LINC complex mechanics in cellular function.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET-force biosensor protocol fits within the early discovery to lead identification continuum, supporting both hypothesis testing and assay development for mechanotransduction targets.
- Discovery Biology: Quantifies mechanical forces on nuclear envelope proteins to clarify pathway function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET readouts for cross-condition comparison.
- Analytics: Provides ratiometric imaging and spectral unmixing outputs for robust statistical analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic endpoints for preclinical model alignment when force transmission is disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other force-sensitive proteins, enabling broad mechanotransduction assay deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by directly measuring protein-level forces.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic dependencies in cellular force transmission.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mechanotransduction targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, FRET microscopy, and spectral unmixing analysis.
- Demands access to high-resolution confocal microscopes with spectral detection capabilities.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging parameters and data processing.
- Adaptable to various cell types and force-sensitive protein constructs with protocol optimization.
- Dependent on careful experimental design to ensure quantitative comparability across groups.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Transfect Cells with Nesprin-2G and Other Plasmid DNA
4:09
Verify Transfection Efficiency
5:12
Capture Spectral Fingerprints of mTFP1 and Venus Fluorophores for Spectral Unmixing
6:53
Capture Unmixed Images
7:52
Results: Setting Imaging Parameters and Capturing Spectrally Resolved FRET Images
8:51
Conclusion
