एक अनुकूलित प्रोटोकॉल लिम्फोसाइटों में ग्लाइकोलाइसिस और mitochondrial श्वसन विश्लेषण करने के लिए

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54918, doi:10.3791/54918 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

लिम्फोसाइटों intracellular संकेत दे रास्ते, जो बारी में तेजी सेलुलर प्रसार, प्रवास और भेदभाव, और साइटोकाइन उत्पादन होता सक्रिय द्वारा उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब। इन घटनाओं के सभी कसकर सेल की ऊर्जा स्थिति से जुड़े होते हैं, और इसलिए ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते का अध्ययन कर इन कोशिकाओं के समग्र कार्यक्षमता के बारे में सुराग दे सकता है। बाह्य प्रवाह विश्लेषक कई प्रकार की कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइसिस और mitochondrial श्वसन के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण है। इस प्रणाली में कुछ प्रकाशित रिपोर्ट में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अभी तक एक व्यापक प्रोटोकॉल लिम्फोसाइटों के लिए विशेष रूप से अनुकूलित कमी है। लिम्फोसाइटों नाजुक कोशिकाओं है कि पूर्व vivo परिस्थितियों में जीवित रहने के खराब कर रहे हैं। बार बार लिम्फोसाइट कैंपेन्स के दुर्लभ हैं, और कम सेल नंबर के साथ काम करना अनिवार्य है। इस प्रकार, एक प्रयोगात्मक रणनीति है कि इन कठिनाइयों के पते की आवश्यकता है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंकि बाह्य प्रवाह विश्लेषक में उनके चयापचय राज्यों के विश्लेषण के लिए लसीकावत् ऊतकों से व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है, और। इसके अलावा, हम जो में अलग सेल घनत्व में कई लिम्फोसाइट उपप्रकार के चयापचय गतिविधियों की तुलना में थे प्रयोगों के परिणामों प्रदान करते हैं। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि हमारे प्रोटोकॉल भी कम सेल सांद्रता में संगत, अच्छी तरह से मानकीकृत परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस प्रकार यह भविष्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चयापचय की घटनाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित अध्ययन में व्यापक आवेदन कर सकते हैं।

Introduction

एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिरक्षा सक्रियण और प्रतिरक्षा दमन के बीच एक कसकर विनियमित संतुलन है। प्रतिरक्षा सक्रियण उत्तेजक के जवाब में तेजी से सेल प्रसार और प्रवास, साथ ही साइटोकाइन उत्पादन, एंटीबॉडी स्राव और बढ़ phagocytosis ड्राइव, जबकि प्रतिरक्षा दमन बस इन घटनाओं को रोकता है और इसलिए अनावश्यक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-6 को रोकने में महत्वपूर्ण है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक सीधा लिंक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता की स्थिति और विभिन्न चयापचय मार्ग 7 की गतिविधि के बीच मौजूद है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर और बंद ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते बंद करके आराम और सक्रिय राज्यों के बीच बदलाव कर सकते हैं। इसके अलावा, यह देखा गया है कि विभिन्न प्रकार के प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के दौरान उनके वृद्धि की ऊर्जा जरूरतों को ईंधन के लिए विभिन्न चयापचय रणनीतियों का इस्तेमाल कर सकता है। उदाहरण के लिए, जबकि टी lymphocytes की सक्रियता के एक लगभग पूरी तरह से glycolytic राज्य 8 में कोशिकाओं का निर्देशन 9,10 के एक संतुलन का उपयोग करें। ये अध्ययन सेलुलर चयापचय पर प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के प्रभाव की जांच के महत्व को इंगित करते हैं।

वास्तविक समय है, ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR), आक्सीकारक फास्फारिलीकरण और ग्लाइकोलाइसिस के संकेतक के रूप में एक साथ माप, एक आम रणनीति ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते 11-13 के राज्यों को संबोधित करने के लिए है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, इस तरह के Seahorse एक्सएफ 96 के रूप में एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक, नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक उपकरण के तेजी से सेल प्रकार भर में या अलग उत्तेजना की स्थिति पर ओसीआर और ECAR में परिवर्तन तुलना कर सकते हैं। अब तक, प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, इन उपकरणों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। हालांकि, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विशेष प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए डिजाइन उपलब्ध नहीं है।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से लिम्फोसाइट, ओटी से अलगकई महत्वपूर्ण मायनों में उसकी प्रकार की कोशिकाओं। लिम्फोसाइटों नाजुक कोशिकाओं है कि पूर्व vivo की स्थिति 14-16 में लंबी अवधि के लिए जीवित नहीं कर रहे हैं। यह उससे भी बड़ा मुद्दा है जब वे सबऑप्टिमल विकास मीडिया में इस तरह के बाह्य प्रवाह विश्लेषण में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में आवश्यक पोषक तत्वों, कमी में संवर्धित कर रहे है। मैक्रोफेज और कई सेल लाइनों के विपरीत, लिम्फोसाइट प्लास्टिक की सतहों का पालन नहीं करते; इसलिए यह तनाव पैदा करने के बिना विश्लेषण थाली करने के लिए उन्हें संलग्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, कुछ लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या अत्यंत दुर्लभ हो सकता है और उन्हें आवश्यक, इष्टतम मात्रा में फसल कटाई के चुनौतीपूर्ण 17-19 हो सकता है।

यहाँ, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि विशेष रूप से लिम्फोसाइटों के लिए विकसित की है प्रदान करते हैं। Splenocytes, बी लिम्फोसाइट और भोले सीडी 4+ टी लिम्फोसाइटों माउस प्लीहा और लिम्फ से अलग 20 नोड्स, हम differen में उनके आराम राज्य ग्लाइकोलाइसिस और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण की विशेषताओं को दिखाने का प्रयोगटी सेल घनत्व। डेटा अच्छी तरह से अंत परख सेल lysate प्रोटीन सांद्रता, जो सीधे सेल नंबर के लिए आनुपातिक थे मापने के द्वारा प्रत्येक के लिए प्रारंभिक सेल संख्या में मतभेद के लिए खाते के लिए सामान्यीकृत थे। हमारी प्रोटोकॉल न केवल बाह्य प्रवाह assays के लिए व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के तेजी से अलगाव के लिए दिशा निर्देश प्रदान करता है, लेकिन यह भी डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सबऑप्टिमल सेल सांद्रता में काम करने के लिए अनुमति देता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों एलआईजी-4 पशु प्रोटोकॉल है, जो NIAID पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था के अनुसार किए गए।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. चुंबकीय जुदाई (एमएस) बफर तैयार: पीबीएस (7.2 पीएच) 0.5% बीएसए और 2 मिमी EDTA या स्वत: जुदाई समाधान 0.5% BSA के साथ पूरक के साथ पूरक। बाँझ फिल्टर (0.22 माइक्रोन) और दुकान में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. RF10 मध्यम तैयार: RPMI 1640 मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, 50 माइक्रोन के स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक, 50 माइक्रोन के 2 -mercaptoethanol, 10 मिमी HEPES। बाँझ अभिकर्मकों का प्रयोग करें। बाँझ फिल्टर और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. एक्सएफ आधार माध्यम 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine और 25 मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक: mitochondrial तनाव परीक्षण के माध्यम से तैयार।
  4. ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के माध्यम से तैयार: एक्सएफ आधार माध्यम supplemen2 मिमी एल glutamine के साथ टेड।
  5. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 7.4, बाँझ फिल्टर और स्टोर करने के लिए दोनों mitochondrial और ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण मीडिया के पीएच को समायोजित करें। 37 डिग्री सेल्सियस और करने के लिए गर्म मीडिया पीएच फिर से समायोजित उपयोग करने से पहले (37 डिग्री सेल्सियस पर पीएच माप के लिए बाहर ले)।
    नोट: एक्सएफ माध्यम का उपयोग कर, जो बाईकार्बोनेट का अभाव है, महत्वपूर्ण है। चूंकि बाह्य प्रवाह विश्लेषक में माहौल केवल परिवेश सीओ 2 में शामिल है, के माध्यम में किसी भी बाइकार्बोनेट, ग्लाइकोलाइसिस का प्रतिफल के रूप में जारी प्रोटॉन के लिए बाध्य करने पर, सीओ 2 और पानी के लिए फार्म अलग कर देना होगा। सीओ 2 प्रयोग के दौरान देगास, पीएच में drifts कि glycolytic अम्लीकरण संकेत अस्पष्ट होगा कारण होगा।
  6. oligomycin तैयार: 10 मिमी DMSO में शेयर समाधान तैयार करें; -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  7. तैयार 2,4-DNP: DMSO में 1 एम स्टॉक समाधान तैयार है; -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  8. antimycin एक तैयार: 10 मिमी DMSO में शेयर समाधान तैयार करें; -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  9. rotenone तैयार: तैयार 10 मिमी रोंDMSO में Tock समाधान; -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  10. ग्लूकोज तैयार: एक 250 मिमी समाधान के लिए फार्म ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के माध्यम में ग्लूकोज भंग; प्रत्येक प्रयोग से पहले नए सिरे से तैयार करने और स्थिर नहीं है।
  11. तैयार 2-महानिदेशक: एक 500 मिमी समाधान के लिए फार्म ठोस ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के माध्यम में 2-डीजी भंग; प्रत्येक प्रयोग से पहले नए सिरे से तैयार करने और स्थिर नहीं है।

2. फसल काटने प्लीहा और चूहों से लिम्फ नोड्स

  1. ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस euthanize।
  2. 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे।
  3. बाद में टी सेल अलगाव के लिए, तिल्ली, सतही ग्रीवा, सतही / गहरी कक्षा, जबड़े, वंक्षण, और mesenteric लिम्फ नोड्स फसल।
  4. बाद में बी सेल अलगाव के लिए, फसल केवल तिल्ली।
    नोट: एक जैव सुरक्षा कैबिनेट का प्रयोग करें और प्रसंस्करण जब तक बर्फ पर पीबीएस या RF10 मीडिया में काटा अंगों रहते हैं। सभी संसाधन और isol के लिए बाँझ Labware और बाँझ तकनीक का प्रयोग करेंव्यावहारिक कदम। अलगाव दक्षता बढ़ाने के लिए और कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए बर्फ पर सभी buffers और मीडिया रखें।

3. ऊतक प्रसंस्करण

  1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी की जगह और झरनी पर अंगों हस्तांतरण। टी सेल अलगाव के लिए, सभी अंगों गठबंधन और बी सेल अलगाव हस्तांतरण केवल तिल्ली के लिए।
  2. एक बाँझ 3 मिलीलीटर सिरिंज से सवार का प्रयोग, झरनी के माध्यम से ऊतक मैश। के दौरान mashing, यकीन है कि फिल्टर और अंगों को हर समय नम कर रहे हैं और उन्हें गीला के रूप में एमएस बफर जोड़कर आवश्यकता है। यह दोनों सेल व्यवहार्यता उच्च रखने और फिल्टर के clogging रोकने जाएगा।
  3. mashing के बाद लागू 5-10 मिलीलीटर एमएस फिल्टर करने के लिए बफर सेल वसूली बढ़ाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र। (इन शर्तों के तहत आगे की सभी centrifugations बाहर ले, जब तक निर्दिष्ट)।
  4. तरल छानना और 5 मिलीलीटर एसीके लाल रक्त कोशिका lysis बफर में गोली resuspend। Incuबर्फ पर 5 मिनट के लिए पीटा लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए (लाल रक्त कोशिकाओं क्योंकि वे चुंबकीय जुदाई के साथ हस्तक्षेप हटा दिया जाना चाहिए)। 10-20 मिलीलीटर जोड़े एमएस बफर और सेंट्रीफ्यूज।
  5. 1 मिलीलीटर एमएस बफर (इस निस्पंदन एरिथ्रोसाइट सेल से मलबे को हटा देगा) के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 30 माइक्रोन सेल फिल्टर जगह और प्रधानमंत्री यह। Centrifuged ट्यूब से तरल छानना, 5 मिलीलीटर एमएस में गोली resuspend बफर और फिल्टर के माध्यम से इसे पारित। 4 मिलीलीटर एमएस बफर के साथ प्रारंभिक ट्यूब धो सेल वसूली बढ़ाने के लिए, और इस का उपयोग फिल्टर कुल्ला करने के लिए।
  6. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करना, कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण। यह सेल नंबर, चुंबकीय जुदाई धारा 4 में आवश्यक splenocytes बाद के बाह्य प्रवाह परख में इस्तेमाल किया जाए तो अभिकर्मकों की राशि का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाएगा इस समय कक्षों की उपयुक्त संख्या अलग निर्धारित करें।
  7. निलंबन अपकेंद्रित्र और चुंबकीय जुदाई के लिए आगे बढ़ें। Resuspend splenocytes इस्तेमाल नहीं किया5 मिलीलीटर RF10 में बी सेल अलगाव के लिए और बाह्य प्रवाह परख जब तक बर्फ पर रहते हैं।

4. बी कोशिकाओं और अनुभवहीन सीडी 4 + टी कोशिकाओं के चुंबकीय जुदाई

  1. बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल, विरोधी बायोटिन microbeads, और एमएस बफर के लिए आवश्यक मात्रा में निर्धारित करते हैं। एक गाइड के रूप में 10 8 कोशिकाओं के लिए निम्न संस्करणों का प्रयोग करें और ऊपर पैमाने पर या नीचे के रूप में आवश्यक।
    नोट: एक फ्रिज में नहीं बल्कि बर्फ पर से बर्फ पर incubating एंटीबॉडी बाध्यकारी दक्षता और लंबे समय तक ऊष्मायन बार आवश्यक हो सकता है कम कर सकते हैं के बाद से नमूने सेते हैं।
भोले सीडी 4+ टी सेल जुदाई के लिए अभिकर्मकों 10 8 कोशिकाओं के लिए वॉल्यूम
(उचित पैमाने पर)
बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल 100 μl
पहले ऊष्मायन के लिए एमएस बफर 400 μl
विरोधी बायोटिन microbeads 200 μl
CD44 microbeads 100 μl
दूसरी ऊष्मायन के लिए एमएस बफर 200 μl
5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल और कोशिकाओं को सेते हैं। विरोधी बायोटिन microbeads, CD44 microbeads जोड़ें, एमएस बफर और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

तालिका 1: टी सेल अलगाव मात्रा और निर्देश।

बी सेल जुदाई के लिए अभिकर्मकों 10 8 कोशिकाओं के लिए वॉल्यूम
(उचित पैमाने पर)
बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल 100 μl
पहले ऊष्मायन के लिए एमएस बफर 400 μl
विरोधी बायोटिन microbeads 200 μl
दूसरी ऊष्मायन के लिए एमएस बफर 300 μl
15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल और कोशिकाओं को सेते हैं। बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल और एमएस बफर का उचित मात्रा में जोड़ें, और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं। विरोधी बायोटिन microbeads की उचित मात्रा में जोड़ें और एमएस बफर और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं। दूसरी ऊष्मायन के बाद, एमएस बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ ट्यूब भरें।

तालिका 2: बी सेल अलगाव मात्रा और निर्देश।

  1. एमएस बफर में गोली Resuspend: मैनुअल जुदाई के लिए 500 μl, स्वत: अलग होने के लिए 3-4 मिलीलीटर।
  2. या तो मैनुअल या स्वचालित विभाजन के साथ जारी रखेंनिम्नलिखित नुसार:
    1. मैनुअल पृथक्करण:
      1. जुदाई चुंबक में एक लोकसभा स्तंभ डालें, 3 मिलीग्राम एमएस बफर के साथ धोने से प्रवाह के माध्यम से, और प्रधानमंत्री स्तंभ इकट्ठा करने के लिए नीचे एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जगह। के माध्यम से प्रवाह त्यागें।
      2. primed लोकसभा स्तंभ सेल निलंबन स्थानांतरण और इसके माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं; 3 मिलीग्राम एमएस बफर और कॉलम के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से इस पास के साथ ऊष्मायन के दौरान इस्तेमाल ट्यूब धो लें। eluate शुद्ध कोशिकाओं में शामिल होंगे। बी सेल अलगाव के लिए, शुद्ध कोशिकाओं कॉलम के माध्यम से एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक दूसरी बार गुजरती हैं, और कपड़े धोने कदम दोहराएँ। यह पवित्रता और उपज में वृद्धि होगी।
    2. स्वचालित पृथक्करण:
      1. स्वत: विभाजक पर स्विच और बफर चल रहे हैं, समाधान और 70% इथेनॉल rinsing के स्तर की जांच। सुनिश्चित करें कि अपशिष्ट जुदाई शुरू करने से पहले खाली है।
      2. टी के ट्यूब के आकार के आधार पर उचित ठंडा रैक का चयन करेंवह unpurified नमूना (जैसे, 15 मिलीलीटर)। आदेश कोशिकाओं जुदाई प्रक्रिया के दौरान व्यवहार्य रखने के लिए, रैक कि है कि पहले 3-4 घंटे के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा कर दिया उपयोग करें, या जब तक शीतलक ठोस हो जाता है।
      3. स्वत: विभाजक के नमूना मंच पर ठंडा रैक माउंट।
      4. स्लॉट ए 1, बी 1 स्लॉट में नकारात्मक अंश के लिए एक ट्यूब में नमूना ट्यूब, और सी 1 में सकारात्मक अंश के लिए एक ट्यूब रखें। एक से अधिक नमूना एकत्रित करते हैं, तो अगले कॉलम (ए 2, बी 2, सी 2, आदि) में अतिरिक्त ट्यूबों की जगह।
      5. टचस्क्रीन पर जुदाई टैब का चयन करें, और रैक पर ट्यूब की व्यवस्था संकेत मिलता है। जुदाई मेनू से, "depletes" कार्यक्रम का चयन और धोने के उचित प्रकार के साथ कार्यक्रम चक्र पूरा (नीचे नोट देखें)।
        नोट: "depletes" कार्यक्रम मशीन के सबसे संवेदनशील विधा है, जो पवित्रता प्राथमिकता का उपयोग कर कमी बाहर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, वहाँ तीन अलग अलग धोने विकल्प हैं: quicकुल्ला कुल्ला, और नींद कश्मीर। नमूने एक ही स्रोत से कर रहे हैं और जोड़ा जा रहे हैं, त्वरित कुल्ला का चयन करें। नमूने अलग रखा जाना करने के लिए कर रहे हैं, कुल्ला का चयन करें। नींद विकल्प को चुनें यदि कोई आगे isolations उस दिन बाहर किया जाएगा और मशीन निम्नलिखित अलगाव बंद हो जाएगा, तो
      6. "भागो," दबाने से अलगाव शुरू करो और जब प्रेरित बफर का स्तर की पुष्टि करें। कार्यक्रम के बाद समाप्त हो गया है, नकारात्मक अंश शुद्ध कोशिकाओं में शामिल होंगे।
    3. एमएस बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब भरें।
    4. छानना एमएस बफर और 5 मिलीलीटर RF10 मीडिया में resuspend कोशिकाओं। बाह्य प्रवाह परख जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
      नोट: आदर्श रूप में, बाह्य प्रवाह परख बाहर तुरंत अलगाव के बाद किया जाना चाहिए। हालांकि, प्रारंभिक प्रयोगों में परख परिणामों में कोई महत्वपूर्ण मतभेद अलगाव हौसले से पृथक लोगों बनाम के 3 घंटा के भीतर इस्तेमाल किया कोशिकाओं में मनाया गया।

नोट: प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित साधन की 96 अच्छी तरह प्रारूप के लिए है। वॉल्यूम यदि किसी अन्य स्वरूप प्रयोग किया जाता है समायोजित करने की आवश्यकता होगी।

  1. सेंसर कारतूस के जलयोजन
    1. सेंसर कारतूस उठाकर calibrant समाधान के 200 μl के साथ उपयोगिता थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरने और उपयोगिता थाली पर सेंसर कारतूस के निचले हिस्से, calibrant समाधान में सेंसर डूब गए।
      नोट: सत्यापित करें कि calibrant समाधान का स्तर काफी उच्च सेंसर जलमग्न रखने के लिए है। कारतूस 2 हे और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एच + के लिए जुड़े fluorophores बंदरगाहों; इन उन्हें ठीक से काम करने के लिए आदेश में हाइड्रेटेड की जरूरत है।
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर सीओ 2 या ऑक्सीजन / नाइट्रोजन के साथ नहीं पूरक में कारतूस रखें। इन शर्तों के तहत आगे की सभी incubations बाहर ले, जब तक निर्दिष्ट। हाइड्रेट करने के लिए रात भर कारतूस सेते हैं।
  2. preparचिपकने वाला लेपित प्लेट्स की समझना
    1. 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट में 22.4 माइक्रोग्राम / एमएल चिपकने वाला समाधान के 2.5 मिलीलीटर की तैयारी, पीएच 8.0 (बिकारबोनिट चिपकने वाला सोखना के लिए इष्टतम पीएच प्रदान करता है)।
    2. परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान के 25 μl लागू करें, और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर सेते हैं।
    3. महाप्राण चिपकने वाला और हर अच्छी तरह से धो दो बार बाँझ पानी के 200 μl का उपयोग कर। रुको जब तक कुओं कोशिकाओं बोने से पहले सूख रहे हैं।
  3. चिपकने वाला लेपित प्लेट्स में कोशिकाओं सीडिंग
    1. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। उचित परख माध्यम के 5 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं (mitochondrial तनाव और ग्लूकोज तनाव मीडिया के निर्माण के लिए ऊपर देखें)। परख माध्यम में वांछित एकाग्रता में फिर से अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और resuspend (मेजबान मात्रा एकाग्रता के आधार पर अलग अलग होंगे, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 180 μl में शामिल होंगे)।
      नोट: उचित परख मीडिया और मिश्रित रूप में लंबे समयएस इस्तेमाल कर रहे हैं, बाह्य प्रवाह विश्लेषक एक साथ एक ही थाली पर mitochondrial और ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण चला सकते हैं।
    2. प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 180 μl प्लेट। पृष्ठभूमि तापमान सुधार के लिए कुओं A1, A12, एच 1, और H12 उपयोग करें: इन कुओं (कोई कोशिकाओं) में परख माध्यम के 180 μl जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं।
    4. कोई ब्रेक के साथ 5 मिनट के लिए 200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से संलग्न है। दिखने में इस बात की पुष्टि है कि कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक संस्कृति सतह का पालन कर रहे हैं, एक monolayer के गठन, खुर्दबीन के नीचे देखने के द्वारा। प्लेटों एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए वापस इनक्यूबेटर पर स्थानांतरण।
  4. यौगिकों के 10x सांद्रता की तैयारी, और इंजेक्टर बंदरगाहों की लोड हो रहा है
    1. mitochondrial तनाव परीक्षण के लिए, 2.5 मिलीलीटर 10 माइक्रोन Oligomycin, 1 मिमी DNP, और mitochondrial तनाव परख mediu में 10 माइक्रोन rotenone और 10 माइक्रोन के antimycin ए, सभी का एक मिश्रण के प्रत्येक तैयारएम।
      नोट: 2,4-DNP की एकाग्रता पहले प्रकाशित अध्ययन पर आधारित है, 21 में यह एक सामान्य दिशानिर्देश लेकिन प्रत्येक कोशिका का इस्तेमाल किया शोधकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए प्रकार के लिए uncoupler की एकाग्रता है।
    2. ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए, 2.5 मिलीलीटर 250 मिमी ग्लूकोज, 10 माइक्रोन के Oligomycin, और 500 मिमी ग्लाइकोलाइसिस तनाव परख माध्यम में 2-deoxyglucose (2-डीजी) के प्रत्येक तैयार करते हैं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 10x समाधान है, और 7.4 पीएच को समायोजित करें।
    4. कारतूस एक मल्टीचैनल micropipettor और लदान गाइड का उपयोग करने का उचित इंजेक्टर बंदरगाहों में यौगिकों लोड करें, इस प्रकार है:
      बंदरगाह Mitochondrial तनाव परख ग्लाइकोलाइसिस तनाव परख
      20 μl oligomycin 20 μl ग्लूकोज
      बी 22 μl 2,4-DNP 22 μl oligomycin
      सी 25 μl antimycin ए / rotenone 25 μl 2-डीजी
      तालिका 3: यौगिक की मात्रा।

      नोट: बंदरगाहों में से प्रत्येक श्रृंखला (जैसे, सभी बंदरगाहों ए) एक ही मात्रा होना चाहिए। यह (अप्रयुक्त कुओं में बंदरगाहों परख माध्यम की एक ही मात्रा के साथ लोड किया जा सकता है) के लिए महत्वपूर्ण है कि किसी दिए गए श्रृंखला में सभी कुओं लोड कर रहे हैं, यहां तक ​​कि प्रयोग में इस्तेमाल नहीं उन लोगों के लिए, अन्यथा यौगिकों इंजेक्शन नहीं किया जाएगा।
    5. कार्यक्रम की स्थापना करते हुए कारतूस सेते हैं।
  5. बाह्य प्रवाह परख प्रोटोकॉल की स्थापना
    1. निम्नलिखित कार्यक्रम (तालिका 4) सेट करें।
      चरण लूप कैलिब्रेशन -
      संतुलन -
      आधारभूत रीडिंग 3 गुना: 3 मिनट मिक्स, रुको 0 मिनट, 3 मिनट के उपाय
      अंत पाश -
      पोर्ट एक इंजेक्षन -
      माप 3 गुना: 3 मिनट मिक्स, रुको 0 मिनट, 3 मिनट के उपाय
      अंत पाश -
      पोर्ट बी इंजेक्षन -
      माप 3 गुना: 3 मिनट मिक्स, रुको 0 मिनट, 3 मिनट के उपाय
      अंत पाश -
      इंजेक्षन बंदरगाह ग -
      माप 3 गुना: 3 मिनट मिक्स, रुको 0 मिनट, measurई 3 मिनट
      अंत पाश -
      अंत कार्यक्रम -
      तालिका 4: कार्यक्रम लेआउट।
      नोट: कुछ स्थितियों में, उदाहरण के लिए, जब सक्रिय कोशिकाओं का उपयोग, अम्लीकरण भोले कोशिकाओं में अधिक समय के लिए जारी रख सकते हैं। इस कारण से, यह उपरोक्त कार्यक्रम में "प्रतीक्षा" टाइम्स बढ़ाने या प्रत्येक माप चक्र से अधिक बार दोहराने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    2. कार्यक्रम शुरू करते हैं। अंशांकन कदम के बाद, परख प्लेट के लिए (जब प्रेरित) calibrant प्लेट की जगह।
      नोट: सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह कुओं इसी तरह की स्थिति है कि समूहों को इंगित करने के लिए संभव है। इसके अतिरिक्त, यह संकेत मिलता है जो कुओं नियंत्रण कुओं हैं महत्वपूर्ण है (इस प्रोटोकॉल में, वे थाली के चारों कोनों कर रहे हैं) और संकेत मिलता है जो कुओं खाली हैं। एक अधिक विस्तृत के लिए, कदम-दर-कदम से, यह मशीन की स्थापना और के लिए प्रोटोकॉलसॉफ्टवेयर, निर्माता की वेबसाइट से सलाह ली जानी चाहिए।
  6. मापने प्रोटीन सामग्री
    1. कोशिकाओं को परेशान करने के बिना प्रत्येक अच्छी तरह से शेष परख के माध्यम से निकालें।
      नोट: यदि यह प्रोटीन एकाग्रता परख के साथ आगे बढ़ने के लिए सुविधाजनक नहीं है, यह -20 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर पूरी थाली फ्रीज करने के लिए संभव है। तो जमे हुए हैं, जारी रखने से पहले पिघलना।
    2. एक 1x RIPA सेल माध्यम में प्रोटीज अवरोधकों का समाधान (100x स्टॉक) (50 μl के लिए पर्याप्त / अच्छी तरह से) तैयार करें।
    3. 50 μl RIPA सेल मध्यम अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक जोड़ें। 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर थाली आंदोलन, और फिर पूरी तरह lyse कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली सेते हैं।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर थाली स्पिन प्लेट के नीचे करने के लिए लिपिड और अन्य अणुओं लाने के लिए इतना है कि वे bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करते।
    5. बीसीए परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय निर्माता के अनुसार &# 39 की सिफारिशें की हैं।

Representative Results

कोशिकाओं ग्लाइकोलाइसिस का एक एकीकृत नेटवर्क का उपयोग, tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र, और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण उनकी ऊर्जा की मांग के बहुमत को पूरा करने के लिए और सेल के विकास और प्रसार के लिए आवश्यक मध्यवर्ती प्रदान करने के लिए। ये रास्ते ग्लूकोज-6-फॉस्फेट, जो बाद में पाइरूवेट में संसाधित किया जाता है के रूप में मुक्त ग्लूकोज के intracellular फँसाने के साथ शुरू करते हैं। पाइरूवेट या तो कम या लैक्टेट माइटोकॉन्ड्रिया, जहां यह रूपों एसिटाइल coenzyme एक (सीओए) में ले जाया जाता है। Acetyl सीओए तो टीसीए चक्र में प्रवेश करती है। टीसीए चक्र के उच्च ऊर्जा मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) है, जो बारी में mitochondrial मैट्रिक्स से एच + expels एक एच + भीतरी mitochondrial झिल्ली भर में ढाल उत्पन्न करने में इलेक्ट्रॉनों की आवाजाही में वृद्धि। ऑक्सीजन अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है, और एच + F हे / एफ <माध्यम से mitochondrial मैट्रिक्स में वापस लौटनेउप> 1 जटिल है, जहां उनके संभावित ऊर्जा एटीपी (चित्रा 1 ए) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

बाह्य प्रवाह परख का काम सिद्धांत विशिष्ट बिंदुओं पर ग्लाइकोलाइसिस और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण के साथ हस्तक्षेप, और जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव का आकलन करने पर निर्भर करता है। इस प्रयोजन के लिए, हम भूखे कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइसिस, और 2-deoxyglucose (2-डीजी) है, जो 2-deoxyglucose-6-फॉस्फेट, phosphoglucoisomerase 23 की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध में बदल जाती है hexokinase द्वारा, प्रचार करने के लिए, ब्लॉक करने के क्रम में ग्लूकोज का इस्तेमाल किया ग्लाइकोलाइसिस। Rotenone (आदि की एक जटिल मैं विशेष अवरोध), ए (एक जटिल आदि की तृतीय-विशिष्ट अवरोध) antimycin, oligomycin (एटीपी synthase 24 का अवरोध), और uncoupling एजेंट 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 थे परिवहन, प्रोटॉन ढाल और एटीपी संश्लेषण (चित्रा 1 ए) इलेक्ट्रॉन से संबंधित विशिष्ट घटनाओं के हस्तक्षेप करने के लिए इस्तेमाल किया। इसके बजाय 2,4-DNP की, कार्बोनिल CYANide-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। या तो मामले में, uncouplers हमेशा के लिए एक विशेष सेल प्रकार के लिए उपयोग करने से पहले आवश्यक इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए titrated किया जाना चाहिए।

ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण (चित्रा 1 बी) बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) पहले से भूखे कोशिकाओं में से एक आधारभूत माप के साथ शुरू होता है। चूंकि इन कोशिकाओं को अपनी बेसल न्यूनतम पर हैं, और इसलिए व्यावहारिक रूप के रूप में गैर glycolytic माना जा सकता है, इस बिंदु पर मापा जाता ECAR गैर glycolytic अम्लीकरण के रूप में जाना जाता है। और एच + - यह अम्लीकरण संभावना श्वसन सीओ 2 टीसीए चक्र में उत्पन्न HCO 3 करने के लिए परिवर्तित किया जा रहा से मेल खाती है। यह ग्लायकोलायसिस सक्रिय करने के लिए है, जो लैक्टेट के गठन के कारण बाह्य अम्लीकरण में वृद्धि के रूप में प्रस्तुत करता है ग्लूकोज के इंजेक्शन द्वारा पीछा किया जाता है।यह वृद्धि ग्लायकोलायसिस की सामान्य दर का प्रतिनिधित्व करता है। कोशिकाओं तो oligomycin के इंजेक्शन, जो ब्लॉक आक्सीकारक फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी की पीढ़ी के साथ चुनौती दी है। प्रकोष्ठों अपने अधिकतम स्तर तक ग्लाइकोलाइसिस सक्रिय द्वारा एटीपी उत्पादन में इस नाटकीय कमी का जवाब है, और कहा कि ECAR स्तर (glycolytic आरक्षित) में एक माध्यमिक वृद्धि में परिणाम है। परीक्षण ग्लूकोज अनुरूप 2-महानिदेशक, जो अपने गैर-glycolytic स्तर पर ECAR रिटर्न का उपयोग कर ग्लाइकोलाइसिस की कुल निषेध द्वारा समाप्त होता है। दिलचस्प बात यह है कि यह प्रस्ताव किया गया है कि, निर्माता की सिफारिशों के विपरीत, अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइसिस जरूरी 26 oligomycin के इंजेक्शन से नहीं मिलता। एक उच्च glycolytic क्षमता के साथ कोशिकाओं में, अगर वहाँ एटीपी मांग में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं है, ग्लाइकोलाइसिस पूरी तरह से इसे विनियमित होने की जरूरत के बिना mitochondrial एटीपी के नुकसान के साथ सामना करने में सक्षम हो सकता है। oligomycin साथ glycolytic दर श्वसन अवरोधकों जोड़कर पार किया जा सकता है, इस तरह के rotenone और myxothiazol, जो oligomycin पर कुछ लाभ प्रदान करते हैं: 1) वे एटीपी मांग में वृद्धि के रूप में वे एटीपी Synthase के पलटने का कारण है, एटीपी हाइड्रोलिसिस के साथ, mitochondrial झिल्ली क्षमता 26 को ठीक करने की कोशिश में प्रोटॉन पंप करने के लिए; 2) वे माध्यम है, जो ECAR परिणाम (देखें नीचे) उलझाना सकता है की सांस अम्लीकरण को रोकने के। अन्य तरीके एटीपी मांग बढ़ाने के लिए यौगिकों कि प्लाज्मा झिल्ली ATPases 26 से एटीपी की hydrolysis को प्रोत्साहित के अलावा शामिल हैं। जब एक ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण की योजना बना यह सब शोधकर्ताओं द्वारा ध्यान से विचार किया जाना चाहिए।

Mitochondrial तनाव परीक्षण (चित्रा 1 सी) ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) गैर की कमी से जूझ कोशिकाओं में से एक आधारभूत माप के साथ शुरू होता है। इस oligomycin के इंजेक्शन, जो एफ हे / एफ 1 जटिल के माध्यम से प्रोटॉन की वापसी को रोकता द्वारा पीछा किया जाता है और इस तरह तेजी से hyperpolarizmitochondrial झिल्ली तों। Hyperpolarization आगे प्रोटॉन श्वसन परिसरों के माध्यम से पंप, और सांस की दर कम हो जाती है रोकता है। शेष श्वसन प्रोटॉन रिसाव, जो लिपिड या अन्य चैनलों के माध्यम से प्रोटॉनों के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है कहा जाता है। इस hyperpolarized राज्य तेजी से uncoupling एजेंट 2,4-DNP है, जो एक प्रोटॉन ionophore के रूप में कार्य के अलावा द्वारा उलट है। जवाब में, कोशिकाओं को इसकी अधिकतम करने के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन दर में वृद्धि से एक व्यर्थ प्रयास में झिल्ली क्षमता को ठीक करने की कोशिश करते हैं, और बदले में इस ओसीआर बढ़ जाती है। अंत में, दो आदि अवरोधकों (antimycin ए और rotenone) के अलावा के साथ, mitochondrial श्वसन पूरी तरह से बंद हो जाता है और ओसीआर अपने न्यूनतम स्तर तक कम हो जाती है। इस स्तर पर, ऑक्सीजन की खपत mitochondrial गतिविधि (गैर mitochondrial) की वजह से नहीं है। ओसीआर में अंतर इन अवरोधकों द्वारा उत्पन्न अधिकतम mitochondrial श्वसन, जो आधारभूत श्वसन और अतिरिक्त क्षमता का योग है कहा जाता है।

बी और टी सेल isolations अत्यधिक व्यवहार्य शुद्ध लिम्फोसाइट आबादी निकलेगा।

के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 4 में उल्लिखित बी कोशिकाओं और भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग थे, और splenocytes बस धारा 3.3 में वर्णित के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं lysing द्वारा प्राप्त किया गया।

सेल प्रकार विशिष्ट चयापचय assays की संवेदनशीलता व्यवहार्यता और शुरू सेल की आबादी की शुद्धता पर निर्भर करता है। इसलिए, क्रम में पृथक माउस टी कोशिकाओं, splenocytes, और बी कोशिकाओं, और टी और बी कोशिकाओं की पवित्रता की व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं के छोटे aliquots प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए दाग रहे थे। आगे तितर बितर क्षेत्र बनाम ओर तितर बितर-क्षेत्र में (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) साजिश, लिम्फोसाइट gated थे, और इस फाटक, आगे तितर बितर-अहो में विकर्ण साथ आबादी के भीतरटी (एफएससी-एच) बनाम FSC-एक साजिश singlets के रूप में निर्धारित किया गया है। स्वेटर आबादी के भीतर, व्यवहार्यता कोशिकाओं है कि लाइव / मृत मार्कर (2A चित्रा) के लिए नकारात्मक दाग gating द्वारा मापा गया था; टी सेल व्यवहार्यता 97.9% थी, splenocyte व्यवहार्यता 92% थी, और बी सेल व्यवहार्यता 94% थी। सीडी 4 + जनसंख्या 27, 98.3% (चित्रा 2 बी) था - बी सेल पवित्रता, के रूप में B220 + CD19 + आबादी 26 से मापा जाता है, 99%, जबकि सीडी 4+ टी सेल पवित्रता, के रूप में CD44 द्वारा मापा गया था।

सेल lysate के प्रोटीन एकाग्रता मढ़वाया सेल नंबर का एक सीधा संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

पृथक लिम्फोसाइटों और splenocytes / अच्छी तरह से 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं पर एक चिपकने वाला लेपित 96 अच्छी तरह से परख थाली में चढ़ाया गया, 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से, 1.25 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से, और 0.625 x 10 (चित्रा 3 ए) के तहत कल्पना की गई थी। जैसी कि उम्मीद थी, संगम प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व के साथ सहसंबद्ध। बाह्य प्रवाह परख के पूरा होने पर, चढ़ाया कोशिकाओं lysed रहे थे और उनके प्रोटीन सांद्रता बीसीए परख का उपयोग मात्रा गया। सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए, lysate प्रोटीन सांद्रता रैखिक प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व (चित्रा 3 बी) है, जो इस बात की पुष्टि है कि lysate प्रोटीन सांद्रता जब बाह्य प्रवाह डेटा की व्याख्या सेल नंबर को सामान्य बनाने के लिए एक सटीक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ सहसंबद्ध किया जा करने के लिए दिखाया गया है। चढ़ाना इस प्रयोग में इस्तेमाल किया घनत्व भोले, unstimulated लिम्फोसाइटों के लिए अनुकूलित किया गया है। उत्तेजित या पहले से संवर्धित कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

Mitochondrial और glycolytic Stresएस assays मढ़वाया सेल नंबर पर निर्भर हैं।

ओसीआर बाह्य प्रवाह विश्लेषक में प्रत्येक कोशिका प्रकार और चढ़ाना घनत्व के लिए मापा गया था। जैसी कि उम्मीद थी, उच्च सेल नंबर एक उच्च मापा ओसीआर, साथ ही अधिक नाटकीय प्रतिक्रियाओं oligomycin करने के लिए, 2,4-DNP, और antimycin ए / rotenone (चित्रा -4 ए) है। प्रत्येक नमूना के प्रोटीन एकाग्रता के लिए ओसीआर माप मानकीकरण कि सामान्य रूप में, कोशिकाओं की बड़ी संख्या को और अधिक सटीक माप ओसीआर नेतृत्व पता चलता है। 5 और 2.5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाना / अच्छी तरह से टी कोशिकाओं और splenocytes, और 5 और 1.25 x 10 5 कोशिकाओं में इसी प्रकार के सामान्यीकृत ओसीआर माप में हुई अच्छी तरह / बी कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) में इसी तरह की सामान्यीकृत ओसीआर माप हुई। सामान्यीकृत बी सेल में मामूली अंतर ओसीआर माप एक अप्रत्यक्ष संकेत हो सकता है कि बी कोशिकाओं / अच्छी तरह से अन्य सेल घनत्व की तुलना में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं में बेहतर प्रदर्शन। सभी उपाय करके, 0.625 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से इनकी परिणाम दे दी है, प्रदर्शन है कि इस चढ़ाना घनत्व अपर्याप्त है। आधारभूत श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, अधिकतम mitochondrial श्वसन, गैर mitochondrial श्वसन, और एटीपी उत्पादन रैखिक सभी प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 4C) के लिए चढ़ाना घनत्व के साथ सहसंबद्ध। इसके अतिरिक्त, आधारभूत श्वसन के अधिकांश के रूप में तीन प्रकार की कोशिकाओं में कम प्रोटॉन रिसाव ने संकेत दिया, एटीपी synthesizing की दिशा में प्रयोग किया जाता है। mitochondrial तनाव प्रयोग के प्राथमिक ध्यान केंद्रित ओसीआर में परिवर्तन को मापने के लिए है, जबकि अभी भी ECAR सुनिश्चित करने के लिए कि परख सफलतापूर्वक बाहर किया गया था रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी है। ओसीआर के लिए इसी प्रकार, दो उच्च चढ़ाना घनत्व उच्च ECAR और अधिक नाटकीय प्रतिक्रियाओं oligomycin करने के लिए, 2,4-DNP, और antimycin ए / rotenone (चित्रा 4D) में हुई। antimycin ए / rotenone 2,4-DNP के अलावा पर ECAR, और में नाटकीय परिवर्तन ग्राम में परिवर्तन के अलावा श्वसन में परिवर्तन की वजह से हो सकता हैऔर एच + - lycolysis, सीओ 2 टीसीए चक्र में उत्पन्न बाद HCO 3 में बदल जाती है। यह समस्या हाल ही में संबोधित किया गया है, और वहाँ कुल बाह्य अम्लीकरण संकेत को सही ऑक्सीजन की खपत डेटा का उपयोग कर के लिए एक सरल तरीका मौजूद है, असली glycolytic दर 12,29 प्राप्त करने के लिए।

ग्लाइकोलाइसिस तनाव परख उच्चतम चढ़ाना घनत्व (चित्रा 5 ए, बी) में सबसे अधिक सफल रहा था। सभी प्रकार की कोशिकाओं में, 5 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से नमूने, ग्लूकोज के अलावा के बाद ECAR में सबसे बड़ी परिवर्तन किया था Oligomycin, और 2-महानिदेशक (चित्रा 5 ब)। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्य प्रदर्शन किया है कि सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए, 5 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से नमूने इष्टतम परिणाम सामने आए हैं, जबकि कम सांद्रता-विशेष रूप से 0.625 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से किया एक मजबूत glycolytic आरक्षित क्षमता प्रदर्शित नहीं। गैर-glycolytiग अम्लीकरण, ग्लाइकोलाइसिस, और स्पष्ट glycolytic क्षमता रैखिक सभी प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 5C) के लिए चढ़ाना घनत्व के साथ सहसंबद्ध। ग्लाइकोलाइसिस तनाव प्रयोग के लिए, ओसीआर ग्राफ से पता चलता है कि ग्लूकोज थोड़ा mitochondrial श्वसन, जो तब oligomycin उपचार से हिचकते को उत्तेजित करता है; 2-महानिदेशक के अलावा ओसीआर (चित्रा 5 डी) को प्रभावित नहीं किया। ओसीआर ग्राफ एक और संकेत है कि ग्लाइकोलाइसिस तनाव प्रयोग सफलतापूर्वक बाहर किया गया था के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, ओसीआर ग्राफ ECAR ग्राफ सही करने के लिए, अगर, आवश्यकता के रूप में mitochondrial तनाव परीक्षण 12,29 के मामले में ऊपर बताया इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। बाह्य प्रवाह assays की रूपरेखा (ए) ग्लाइकोलाइसिस (बाएं) के चित्रण और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (दाएं) की कार्रवाई दिखाचयापचय बाह्य प्रवाह assays में इस्तेमाल किया दवाओं। (बी) बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) ग्राफ के योजनाबद्ध; ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) ग्राफ (सी) के योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं, और splenocytes व्यवहार्यता और पवित्रता का निर्धारण करने के stepwise gating cytometry टी कोशिकाओं, splenocytes, और बी कोशिकाओं की व्यवहार्यता (ए) दिखा भूखंडों प्रवाह; और टी और बी कोशिकाओं (बी) की पवित्रता। परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सेल संगम विभिन्न चढ़ाना घनत्व में प्रत्येक कोशिका प्रकार की lysate प्रोटीन सांद्रता के साथ संबद्ध (ए) लाइट x 10 5 कोशिकाओं 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं से / 0.625 करने के लिए अच्छी तरह से लेकर चढ़ाना घनत्व पर परख थाली कुओं में कोशिकाओं की micrographs / कुंआ। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन निरूपित। विभिन्न चढ़ाना घनत्व पर (बी) Lysate प्रोटीन सांद्रता, के रूप में बीसीए परख द्वारा मापा जाता है। परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Mitochondrial तनाव परख। रॉ (ए) और प्रत्येक कोशिका प्रकार और चढ़ाना घनत्व के लिए मानकीकृत (बी) ओसीआर दिखाए जाते हैं। (सी) आधारभूत अधिकतम mitochondrial और गैर-mitochondrial श्वसन के स्तर पर है, साथ ही ऑक्सीजन प्रोटॉन रिसाव या एटीपी उत्पादन से जुड़े खपत में सेल नंबर पर निर्भर परिवर्तन, प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं। Mitochondrial तनाव परीक्षणों से प्राप्त (डी) कच्चे ECAR मूल्यों दिखाए जाते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 7-8 कुओं का मतलब प्रतिनिधित्व करता है। लेबल तीर / antimycin एक (आर / ए) oligomycin के इंजेक्शन (ओ), 2,4-DNP (डी), और rotenone निरूपित। परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

_upload / 54918 / 54918fig5.jpg "/>
चित्रा 5:। Glycolytic तनाव परख कच्चे (ए) और प्रत्येक कोशिका प्रकार और चढ़ाना घनत्व के लिए मानकीकृत (बी) ECAR दिखाए जाते हैं। (ग) गैर-glycolytic अम्लीकरण, ग्लूकोज प्रेरित ग्लाइकोलाइसिस और कुल glycolytic क्षमता के लिए ECAR में सेल नंबर पर निर्भर परिवर्तन दिखाए जाते हैं। Glycolytic तनाव परीक्षणों से प्राप्त (डी) कच्चे ओसीआर मूल्यों दिखाए जाते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 7-8 कुओं का मतलब प्रतिनिधित्व करता है। लेबल तीर ग्लूकोज (जी), oligomycin (ओ), और 2-deoxyglucose (2-डीजी) के इंजेक्शन निरूपित। परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल हम शुद्ध और व्यवहार्य लिम्फोसाइट कैंपेन्स, जो बाद में अलग सांद्रता में बाह्य प्रवाह विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया ग्लाइकोलाइसिस और mitochondrial श्वसन प्रदर्शन में अंतर का मूल्यांकन करने के कुशल अलगाव के लिए अनुमति विकसित किया। इस प्रोटोकॉल लिम्फोसाइटों के लिए विशेष रूप से बनाया गया है और विशेष तरह के कम बेसल चयापचय गतिविधि, कमजोरी, कम आवृत्ति के रूप में इन प्रकार की कोशिकाओं से संबंधित कारणों से संबोधित करते हैं, और उनकी असमर्थता परख प्लेटों का पालन करने के लिए। इसलिए, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 11,12 की तुलना में, हमारे विधि इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए एक और अधिक सुविधाजनक और बेहतर अनुकूलित मार्गदर्शन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम है, शुद्ध और व्यवहार्य सेल आबादी हो रही है, इष्टतम संगम पर चढ़ाना कोशिकाओं, और अच्छी तरह से प्रत्येक में प्रोटीन एकाग्रता के लिए बाह्य प्रवाह परख माप का मानकीकरण भी शामिल हैं।

मैंचढ़ाया दोनों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं और यह भी कोशिकाओं के nitial नंबर प्रोटीन एकाग्रता माप का उपयोग मात्रा निर्धारित किया। सेल नंबर और प्रोटीन एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध की पुष्टि की है कि प्रोटीन एकाग्रता वास्तव में एक तरह से अलग कुओं के बीच सेल नंबर में परिवर्तन के प्रभावों का मानकीकरण करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रोटीन सांद्रता के लिए ECAR और ओसीआर परिणाम मानकीकरण करके, हम पता चला कि, कम सेल संगम के बावजूद, के रूप में कुछ के रूप में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सबसे assays में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं है कि सेल प्रकार और assays के बीच विभिन्न इस्तेमाल किया जा सकता की निचली सीमा। उदाहरण के लिए, जबकि कुछ के रूप में 1.25 x 10 5 कोशिकाओं बी सेल ओसीआर माप, यहां तक कि 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अच्छी तरह से एक ही सेल प्रकार की glycolytic प्रदर्शन का आकलन करने के लिए पर्याप्त नहीं थे। इसलिए, जब तक सेल नंबर, एक सीमित कारक नहीं है के रूप में पदभार पर चढ़ाना90% संगम है, जो लगभग 5 x 10 5 लिम्फोसाइट से मेल खाती है / अच्छी तरह से, बेहतर है। आगे अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है जब की कोशिकाओं को अलग अलग आकार-तरह के पहले से ही सक्रिय है और आंशिक रूप से विभेदित लिम्फोसाइट-कर रहे हैं इस्तेमाल किया। साथ ही, जब पहले से सुसंस्कृत प्राथमिक लिम्फोसाइट का उपयोग कर, वहाँ अलग उपचार की स्थिति के बीच सेल व्यवहार्यता में एक भिन्नता है, जो मर के बाद से सेल नंबर का एक उपाय के रूप में प्रोटीन एकाग्रता की विश्वसनीयता कम होगा हो सकता है या मर कोशिकाओं को भी मापा प्रोटीन के स्तर के लिए योगदान कर सकते हैं । ऐसे मामलों में, यह cytometry बाह्य प्रवाह assays के बाहर ले जाने से पहले प्रवाह से जीवित कोशिकाओं से हल करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

हौसले से अलग और अत्यधिक व्यवहार्य लिम्फोसाइट आबादी का उपयोग हमारे assays में, हम दोनों ओसीआर और ECAR मापन के लिए विश्वसनीय कार्यात्मक डेटा प्राप्त की। सभी प्रकार की कोशिकाओं mitochondrial तनाव की परीक्षा में इसी तरह से व्यवहार करते हैं, सेल प्रकार के बीच हड़ताली मतभेद थेग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण में मनाया। उदाहरण के लिए, भोले टी कोशिकाओं की glycolytic प्रदर्शन splenocytes या बी कोशिकाओं की तुलना में कम था, और यह oligomycin के अलावा के साथ बदल नहीं किया था। इस अवलोकन हमारे प्रोटोकॉल की वैधता की पुष्टि, पहले प्रकाशित अध्ययन 7,30 के साथ कतार में है।

अंत में, हमारे विधि एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग लिम्फोसाइटों के चयापचय गतिविधि के परीक्षण के लिए एक कुशल और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है, और यह सक्रियण, सेल भेदभाव या नियत पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तन की खोज प्रतिरक्षा अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है इस तरह के संक्रमण, औतोइम्मुिनित hematologic कैंसर जैसे रोग phenotypes करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS (pH 7.2) Gibco-ThermoFisher 20012-050 To make MACS buffer
Bovine Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich A3803 To make MACS buffer
0.5 M EDTA, pH 8 Quality Biological 10128-446 To make MACS buffer
autoMACS rinsing solution Miltenyi Biotec 130-091-222 Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.
RPMI-1640 Gibco-ThermoFisher 11875-093 Contains phenol red and L-glutamine
Fetal Bovine Serum Gibco-ThermoFisher 10437-028 For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. 
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) Gibco-ThermoFisher 15140-122 Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media.
L-Glutamine 200 mM (L-Glut) Gibco-ThermoFisher 25030-081 Component of RF10 and stress test media
Sodium pyruvate 100 mM Gibco-ThermoFisher 11360-070 Component of RF10 and stress test media
HEPES 1 M Gibco-ThermoFisher 15630-080 Component of RF10
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco-ThermoFisher 11140-050 Component of RF10
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco-ThermoFisher 21985-023 Component of RF10
Falcon 70 μm cell strainer Falcon-Fischer Scientific 87712 Used in cell isolation
Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip Covidien 8881513934 Used in cell isolation
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E Used in cell isolation
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed Partec CellTrics 04-004-2326 Used in cell isolation
B Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-862 Used in cell isolation
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-104-453 Used in cell isolation
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in cell isolation
MidiMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnet for separation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 Holder for magnets
autoMACS Rinsing Solution 130-091-222 Rinsing solution for autoMACS Pro Separator
autoMACS Pro Separator Instrument Miltenyi Biotec N/A
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375-5G
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) Sigma-Aldrich D198501
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 Follow manufacturer's instructions
Seahorse XFe96 FluxPak Seahorse Bioscience 101085-004 Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Seahorse XF Base Medium Seahorse Bioscience 102353-100 Used to prepare stress test media
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Seahorse Bioscience
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm EMD Millipore-Fisher Scientific SCGPU10RE Used to sterile filter media.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 487031 Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motz, G. T., Coukos, G. Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity. 39, (1), 61-73 (2013).
  2. Akkaya, M., Barclay, A. N. How do pathogens drive the evolution of paired receptors? Eur J Immunol. 43, (2), 303-313 (2013).
  3. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).
  4. Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118, (2), 503-508 (2000).
  5. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat Rev Immunol. 15, (3), 149-159 (2015).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, (12), 958-969 (2008).
  7. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, (6155), 1242454 (2013).
  8. Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol. 33, (4), 168-173 (2012).
  9. Doughty, C. A., et al. Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth. Blood. 107, (11), 4458-4465 (2006).
  10. Caro-Maldonado, A., et al. Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells. J Immunol. 192, (8), 3626-3636 (2014).
  11. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).
  12. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
  13. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93, (6), 690-700 (2013).
  14. Klein, A. B., et al. Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function. J Immunoassay Immunochem. 27, (1), 61-76 (2006).
  15. Hsueh, R. C., et al. Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes. AfCS Research Reports. 1, (1), 1-11 (2012).
  16. Zambrano, K., et al. Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes. Biotechnol Prog. (2016).
  17. Costa, G. L., et al. Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease. J Immunol. 164, (7), 3581-3590 (2000).
  18. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118, (2), 348-357 (2011).
  19. Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis. J Burn Care Res. 28, (3), 365-379 (2007).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).
  21. Akkaya, B., et al. A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry. J Immunol. 197, (5), 2027-2038 (2016).
  22. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. J. Clin. Invest. 125, (12), 4592-4600 (2015).
  23. Wick, A. N., et al. Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose. J. Biol. Chem. 224, (2), 963-969 (1957).
  24. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase system. Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).
  25. Terada, H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).
  26. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PLOS ONE. 11, (3), e0152016 (2016).
  27. Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping. J Immunol. 160, (8), 3861-3868 (1998).
  28. Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment. Toxicol Appl Pharmacol. 146, (1), 1-10 (1997).
  29. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847, (2), 171-181 (2015).
  30. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. J Exp Med. 212, (9), 1345-1360 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics