गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व वीवो परख

इस वीडियो में प्रदर्शित प्रोटोकॉल हमें फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका को समझने की अनुमति देता है। यह पूर्व वीवो तकनीक कमोबेश फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए आंत के निकटतम सन्निकटन को इस तरह से दोहराती है कि कोई इन विट्रो अध्ययन दोहरा नहीं सकता है। इस विधि को अन्य आंत्रप्रेन्योर पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

ऑटोक्लेवेड निष्फल तेज-समाप्त कैंची और संदंश का उपयोग करके चूहों को विच्छेदन करें। इच्छामृत्यु के बाद, पेट को बेनकाब करने के लिए सभी अंगों को पिन करके जानवर को विच्छेदन सतह पर सुरक्षित करें। बलदंश, कैंची, या आंत वर्गों के लिए चिपके हुए से फर को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र स्प्रे।

चुटकी और पेट के आधार पर त्वचा के एक वर्ग उठाने के लिए संदंश का प्रयोग करें और त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए सीकम या आंतों की दीवार पंचर से बचने के लिए देखभाल कर रही है । इस कटौती को आंशिक रूप से पेरिटोनियल गुहा को उजागर करने के लिए बढ़ाएं, फिर दोनों तरफ प्रारंभिक चीरा के बिंदु पर शुरू करने और ऊपर और बाद में विस्तार करने के लिए एक कटौती करें। इन फ्लैप्स को बाद में खींचें और पेरिटोनियल गुहा को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए उन्हें विच्छेदन सतह पर पिन करें।

पेट से बेहतर कटौती करने के लिए और बड़ी आंत के डिस्टल क्षेत्र में आंत सामग्री की सबसे बड़ी मात्रा का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए कैंची का उपयोग करते समय संदंश के साथ जीआई पथ निकालें। जीआई ट्रैक्ट को हटाते समय, व्यक्तिगत घटकों को टूटने से बचने का ध्यान रखें। पेट, छोटी आंत, सीकम और बड़ी आंत को उनके समीपस्थ और डिस्टल सिरों पर अलग करें।

प्रत्येक खंड से आंत सामग्री के संग्रह के लिए, डिस्टल अंत में एक ही चीरा बनाएं, फिर मैन्युअल रूप से आंत की सामग्री को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में संदंश के साथ निष्कासित करें। पूर्व वीवो परख के लिए नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक YPD आगर प्लेट पर C.albicans SC5314 की एक ताजा संस्कृति लकीर और यह 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।

अगले दिन, दो या तीन मध्यम आकार की व्यक्तिगत कॉलोनियों को चुनें और उन्हें पीबीएस के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। फ्रीजर से जमे हुए आंत सामग्री को पुनः प्राप्त करें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर गल लें। एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में आंत सामग्री के लगभग 150 मिलीग्राम स्थानांतरित करें और उन्हें पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर के साथ फिर से खर्च करें।

भंवर आंत सामग्री को समरूप बनाने के लिए 30 सेकंड के लिए उच्च गति पर नमूना और यह लगभग एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं । तीन मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर समरूपता अपकेंद्रित्र, तो किसी भी मलबे हस्तांतरण नहीं करने के लिए ध्यान रखते हुए एक नई १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । अपकेंद्रित्र को दोहराने के बाद, सी एल्बिकान इनोकुलम के 10 माइक्रोलीटर को सुपरनैंट में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और नमूना को चार से पांच घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

C.albicans पर बहिर्जात मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, आंत सामग्री और पीबीएस मिश्रण में मेटाबोलाइट्स की वांछित एकाग्रता जोड़ें, फिर 30 सेकंड के लिए उच्च गति से नमूना भंवर, यह 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं, और अपकेंद्रित्र और टीका के रूप में पहले वर्णित प्रदर्शन करते हैं । दो मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर कवक सेल संस्कृति को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्यागें। 2% पीएफए के 100 माइक्रोलीटर में नमूनों को 15 मिनट के लिए ठीक करें, फिर अपकेंद्री दोहराएं और सुपरनेट को त्यागें।

पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ दो बार नमूनों को धोएं, फिर 30 मिनट के लिए पॉलीक्लोनल सी एल्बिकान एंटीबॉडी के साथ पीबीएस के १०० माइक्रोलीटर में कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें । इनक्यूबेशन के बाद, फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए मंद प्रकाश में काम करते हुए पीबीएस के साथ तीन बार और नमूना धोएं। एक अंधेरे कमरे में, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें जिसमें एंटी-रैबिट आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 488 एंटीबॉडी एक से 500 कमजोर पड़ने पर होता है।

पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार नमूना धोने के बाद, इसे पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में फिर से खर्च करें और इमेजिंग के लिए इसे 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें। 20X और 40X उद्देश्य लेंस और एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिल्टर का उपयोग कर एक फ्लोरेसेंस इमेजिंग माइक्रोस्कोप के साथ कवक कोशिकाओं छवि । जब C.albicans पेट, छोटी आंतों और अनुपचारित नियंत्रण और एंटीबायोटिक इलाज चूहों की बड़ी आंतों से लिया आंत समरूप अर्क में पूर्व वीवो हो जाता है, यह आम तौर पर एक खमीर आकृति विज्ञान के साथ विकसित करता है ।

हालांकि, जब एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से सीकल निकालने में उगाया जाता है, तो सी एल्बिकन आसानी से मॉर्मोजेनेसिस से गुजरता है जिसके परिणामस्वरूप खमीर और हाइफेट रूप होते हैं। यह इंगित करता है कि एंटीबायोटिक उपचार सीकल वातावरण में परिवर्तन का कारण बनता है, जो सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करता है। एंटीबायोटिक-इलाज चूहों के सेकल समरूप में ग्लूकोज के एक्सोजेनस इसके अलावा एक बड़े पैमाने पर हाइफल विकास पूर्व वीवो दिखाया गया।

इन परिणामों से पता चलता है कि एंटीबायोटिक-इलाज चूहों के सीकल समरूप में वापस आंत मेटाबोलाइट्स के अलावा अलग सी एल्बिकान के मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि आंत सामग्री के कमजोर पड़ने का अनुकूलन मलबे के संग्रह के बिना आंत मेटाबोलाइट्स का पर्याप्त संग्रह सुनिश्चित करता है। दो से एक मीडिया-टू-आंत सामग्री कमजोर पड़ने से अधिक न करें और यदि संभव हो तो कम कमजोर पड़ने का लक्ष्य रखें।

इस तकनीक का उपयोग अब यह पता लगाने के लिए किया जा रहा है कि आंत प्रभाव हाइफाल विकास में विशिष्ट मेटाबोलाइट्स कैसे होते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को फंगल रोगजनकों पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है।