एक Autoimmune मधुमेह मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण के लिए Antigen-विशिष्ट प्राथमिक माउस Cytotoxic टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता पीढ़ी

यह प्रोटोकॉल आपको बड़ी संख्या में कार्यात्मक एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने की अनुमति देता है जो ऑटोइम्यून रोगों के इलाज में वांछित सुरक्षित दृष्टिकोण हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह आपको एक अत्यधिक कुशल ट्रांसडक्शन प्रक्रिया और बड़ी संख्या में कार्यात्मक टी कोशिकाओं के साथ प्रदान करता है। इस तकनीक को टाइप 1 डायबिटीज और अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के इलाज के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसमें एंटीजन को जाना जाता है।

इसके अलावा, कार टी कोशिकाओं कैंसर के कुछ प्रकार के लिए एक आशाजनक उपचार हो सकता है । इस विधि का उपयोग अन्य सीएआरएस को व्यक्त करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि अच्छी स्वीकार्य तकनीक हो, पूरे प्रोटोकॉल को पढ़ें और पूरे प्रयोग को पहले से प्लान करें।

इस दो सप्ताह के लंबे प्रोटोकॉल में मिनी-स्टेप्स शामिल हैं और सफलता प्रत्येक चरण के उचित प्रदर्शन पर निर्भर है। शिक्षार्थियों के लिए सही ढंग से पालन करने के लिए इस विधि के दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण हैं। पांडुलिपि में वर्णित ट्रांसफैक्शन के लिए फीनिक्स कोशिकाओं को तैयार करें।

यह अच्छा अभ्यास के लिए पक्ष की दीवार जहां माध्यम जोड़ा जाएगा और बंद कोशिकाओं को उड़ाने को कम करने के लिए हटा दिया निशान है । दिन शून्य कोशिकाओं से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और उन्हें पीबीएस के पांच मिलीलीटर से धोएं। ध्यान से कम सीरम मध्यम ड्रॉपवाइज के सात मिलीलीटर प्लेट की साइड दीवार में जोड़ें और कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।

कम सीरम माध्यम के 1.5 मिलीलीटर दो 14 मिलीमीटर दौर नीचे पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में जोड़ें। एक ट्यूब में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 40 माइक्रोमीटर और 15 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी रीडायरेक्टेड कार प्लाज्मिड के साथ-साथ पांच माइक्रोग्राम पैकेजिंग प्लाज्मिड को दूसरे में जोड़ें। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें और फिर प्लाज्मिड ट्यूब में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट जोड़ें।

धीरे-धीरे समाधान को तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं और इसे कम से कम 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इस मिश्रण के तीन मिलीलीटर फीनिक्स कोशिकाओं में जोड़ें और उन्हें एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें। चार से पांच घंटे के बाद कोशिकाओं के लिए FCS के एक मिलीलीटर जोड़ने और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति ।

अगले दिन, कोशिकाओं से सुपरनेट को हटा दें और ताजा प्रीवार्म्ड कल्चर माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें। दो दिन फीनिक्स कोशिकाओं से माध्यम युक्त वायरस का संग्रह और अवशिष्ट सेल मलबे को दूर करने के लिए इसे छानने के द्वारा वायरस फसल । 200 अंतरराष्ट्रीय इकाइयों प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए वायरस में पुनः संयोजन मानव आईएल-2 स्टॉक जोड़ें और ट्रांसडक्शन के लिए तुरंत इसका उपयोग करें।

फीनिक्स कोशिकाओं के लिए ताजा माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें और उन्हें इनक्यूबेटर में रात भर रखें। एक दूसरे ट्रांसडक्शन के लिए अगले दिन वायरस संग्रह दोहराएं और कोशिकाओं को त्यागें। मुरीन सीडी 8 टी कोशिकाओं को बोने से एक दिन पहले, एंटी-माउस सीडी 3 और सीडी 28 एंटीबॉडी के मिश्रण का एक मिलीलीटर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।

शून्य दिन पर, फसल माउस तिल्ली और उन्हें बर्फ पर एक सेल संस्कृति पकवान में पीबीएस के 10 मिलीलीटर में भिगोने सेल छलनी पर डाल दिया। एक सेल संस्कृति हुड में, प्रत्येक तिल्ली को तीन से पांच टुकड़ों में काटें और तार जाल के माध्यम से ऊतक को दबाने के लिए एक सिरिंज के बाँझ प्लंजर का उपयोग करें। धीरे-धीरे एक से चार पतला लाल कोशिका लाइसिस बफर में स्प्लेनोसाइट्स को फिर से खर्च करके लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करें फिर सेल काउंटिंग के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर को पतला करें।

और सात मिनट के लिए 350 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं के बाकी गोली। सीडी 8 टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए माउस सीडी 8 टी सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करें और आठवीं कोशिकाओं को प्रति एक बार 10 गुना बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 माइक्रोलीटर के साथ बफर के 400 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को निलंबित करें। कोशिका निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं और एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए अनुमति देने के लिए इसे चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

इसके बाद आठवीं कोशिकाओं में प्रति एक बार 10 में लेबलिंग बफर के ३०० माइक्रोलीटर और एंटी-बायोटिन माइक्रोबीएड के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । चार डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें। इस बीच, विभाजक पर एक जुदाई कॉलम की स्थापना की और लेबलिंग बफर के तीन मिलीलीटर के साथ इसे धो लें।

एक कॉलम के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोमीटर सेल छन्नी रखो और जुदाई कॉलम में छलनी के माध्यम से मनका और सेल मिश्रण के एक मिलीलीटर पारित करें। एक पूर्वपछिया 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह को इकट्ठा करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम धोएं, एक ही ट्यूब में बहिस्त्राव एकत्र करें। कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें पांच मिनट के लिए 350 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा एकत्र करें।

उन्हें टी सेल माध्यम और अपकेंद्रित्र के दो मिलीलीटर के साथ फिर से धोएं। फिर उन्हें प्रीवार्मेड टी सेल मीडियम में 250, 000 से 500, 000 सेल प्रति मिलीलीटर की सांद्रता पर रीस्बल करें। पहले से तैयार सीडी 3 और CD28 एंटीबॉडी कोटेड प्लेटों को बाँझ पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं और प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के दो मिलीलीटर जोड़ें।

कोशिकाओं को समान रूप से बांटने के लिए एक घूमता हुआ गति का उपयोग करें। एक नियंत्रण के रूप में, प्लेट की एक ही गैर लेपित अच्छी तरह से सीडी 8 टी कोशिकाओं की एक ही संख्या में थाली और ४८ घंटे के लिए एक 10% कार्बन डाइऑक्साइड गैस टैंक इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट । पहले दिन, मानव फाइब्रोनेक्टिन टुकड़ा लेपित प्लेटें तैयार करें, 24-अच्छी प्लेट के कुओं में फाइब्रोनेक्टिन के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर और इसे रात में चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें।

अगले दिन, फाइब्रोनेक्टिन समाधान को हटा दें और प्रति अच्छी तरह 2% बीएसए और पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट और बाँझ PBS के एक मिलीलीटर के साथ इलाज कुओं धोने । वॉश सॉल्यूशन निकालने के बाद प्लेट का इस्तेमाल करने की तैयारी है।

ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके सक्रिय सीडी 8 टी कोशिकाओं की गणना करें। उन्हें अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र करें। और उन्हें प्रति मिलीलीटर प्रति र्वर्तन के लिए पांच मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं पर पुनर्व्यवसंस्एपित करें।

फाइब्रोनेक्टिन कोटेड प्लेट के प्रत्येक कुएं में सक्रिय सीडी 8 सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर पहले से तैयार वायरस के दो मिलीलीटर में 1.5 जोड़ें जिसमें मध्यम होता है और कोशिकाओं को समान रूप से तिरस्कृत करने के लिए घूमता गति का उपयोग करके मिश्रण करें। एक ज़िपलोक बैग में प्लेट को सील करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 2, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें।

सेंट्रलाइज से प्लेट निकालें और इसे बायोलॉजिकल सेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं । प्लास्टिक बैग को सावधानी से हटा दें और सुनिश्चित करें कि प्लेट के बाहर मध्यम से दूषित न हो। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।

चार घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं से माध्यम के एक मिलीलीटर को हटा दें, इसे प्रीवार्म्ड पूर्ण टी सेल माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ बदलें और प्लेट को वापस इनक्यूबेटर में रखें। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू एक उच्च टाइटर वायरस, स्वस्थ सक्रिय टी कोशिकाएं और उपयुक्त लेनदेन विधि हैं। कोशिकाओं को पीई आकार सात संयुग्मित विरोधी CD8, AF647 संयुग्मित विरोधी सीडी 3, और BV 421 के साथ सह-दाग थे प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए विरोधी CD28।

लगभग, सीडी 8 टी कोशिकाओं का 70% सह-व्यक्त जीएफपी जो कार अभिव्यक्ति को इंगित करता है। उन्होंने सीडी28 और सीडी 3 को भी सह-व्यक्त किया । महत्वपूर्ण बात, परीक्षण GFP सकारात्मक कोशिकाओं के सभी भी सह मैं के साथ दाग-Ag7 इंसुलिन BR3 tetramers जो सेल की सतह पर कार की अभिव्यक्ति इंगित करता है, लेकिन नियंत्रण tetramer के साथ नहीं ।

इसके अलावा, सॉर्ट किए गए परीक्षण और नियंत्रण कार टी कोशिकाओं प्रत्येक ने अपने कॉग्नेट लिगांड को व्यक्त करने वाली लक्षित कोशिकाओं के साथ coculture के बाद ही इंटरफेरॉन गामा के उच्च स्तर को स्रावित किया जो इस बात की पुष्टि करता है कि ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं में एक सीडी8 प्रभावक टी सेल फेनोटाइप है जो माता-पिता एंटीबॉडी के लक्ष्य की ओर निर्देशित है। वायरस उत्पादक कोशिकाओं का लेनदेन, प्राथमिक सीडी 8 टी कोशिकाओं का अलगाव, और इन टी कोशिकाओं की सक्रियता इस प्रयोग का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। स्वस्थ सक्रिय टी कोशिकाओं और उचित अभिकर् में के साथ इन टी कोशिकाओं के लेनदेन होने अनुकूल परिणाम सुनिश्चित करता है।

इस विधि का उपयोग अन्य टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है लेकिन इसे विशिष्ट टी सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल एंटीजन-विशिष्ट चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल थेरेपी के साथ टाइप 1 मधुमेह की रोकथाम का मार्ग प्रशस्त करता है।