Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Biology
 

Summary

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

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Abstract

Introduction

Mitochondria erfüllen eine wichtige Rolle in der zellulären Energiestoffwechsel, insbesondere von Sauerstoff unter Verwendung von Adenosintriphosphat (ATP) zu erzeugen. Sie werden in den Zelltod und in verschiedenen menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) kombiniert entlang der Elektronentransportkette mit Sauerstoffverbrauch und die ATP-Synthese Elektronentransport. Die mitochondriale Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus ist , bei der Umwandlung von Proteinen, Kohlenhydraten und Fetten in energiereiche Verbindungen , wie Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und Flavin - Adenin - Dinukleotid (FADH 2) beteiligt. Elektronen des NADH und FADH 2 werden dann an die Atemelektronentransportkette Protein - Komplexe überführt (I bis IV) in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert. Darüber hinaus wurden zwei weitere Redoxreaktionswege können Elektronen übertragen Transportkette Elektronen: i) die mitochondriale Elektronenübertragungs Flavoprotein (ETF), die auf der Matrix Fläche des inneren Mito befindetchondriale Membran und liefert Elektronen aus Fettsäure β-Oxidation; und ii) die mitochondriale Glycerophosphat-Dehydrogenase, die Glycerophosphat zu Dihydroxyacetonphosphat und speist Elektronen an der mitochondrialen Elektronentransportkette oxydiert. Komplex IV (das ultimative Elektronenakzeptor) überträgt die Elektronen auf ein Sauerstoffmolekül, Sauerstoff zu zwei Molekülen Wasser umwandelt. Bewegen der Elektronen von respiratorischen Elektronentransportkette Komplex I bis IV ist gekoppelt mit Protonenfluss aus der mitochondrialen Matrix in die Intermembranraum, die einen elektrochemischen Gradienten über der mitochondrialen inneren Membran herstellt. Danach pendelt mitochondrialen Komplex V (ATP-Synthase) die Wasserstoffionen wieder in die mitochondriale Matrix und synthetisiert ATP-Moleküle. OXPHOS Funktion kann in vivo und in vitro unter Verwendung verschiedener Techniken und verschiedene mitochondriale Atmung Zustände beurteilt werden kann , erhalten werden. In isolierten Mitochondrien der folgende den Resry Zustände gemessen werden: i) die basale mitochondriale Atmung (Zustand 1), ii) Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von spezifischen Substraten der mitochondrialen Atmungskette Komplexe (Zustand 2), iii) maximale mitochondrialen Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von sättigenden Konzentrationen von Adenosindiphosphat (ADP) (Zustand 3) und iv) Ruheatmung nach ADP Verbrauch (umgerechnet auf ATP) (Zustand 4). In intakten Zellen können die folgenden Atmungszustände gemessen werden: i) basalen zellulären Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von endogenen Substraten und ADP, ii) basalen zellulären Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Oligomycin (Oligomycin-insensitive Atmung) und Oligomycin empfindlichen Atmung (ATP Umsatz), iii) FCCP ungekoppelten Atmung und iv) nicht-mitochondrialen Atmung nach der Zugabe von Antimycin A und Rotenon. In permeabilisierten Zellen können spezifische Substrate der Elektronentransportkette Komplexe und ADP hinzugefügt werden und die maximale komplexe abhängigen s Atmungsratenuch als komplexe I-, II- und IV-abhängige können Atemfrequenz gemessen werden.

Messungen der Zellatmung liefern wichtige Einblicke in mitochondrialen Atmungskapazität spezifischen Komplexe I-IV, mitochondriale Integrität und Energiestoffwechsels 1, 2, 3. Eines der Geräte , die Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit hoher Genauigkeit, Auflösung und Empfindlichkeit ermöglichen die hochauflösende Oxygraph 4. Die hochauflösende Oxygraph Gerät enthält zwei Kammern mit Injektionsöffnungen und jede Kammer mit einem polarographischen Sauerstoffsensor ausgestattet. Cellular oder isolierte Mitochondrien-Suspensionen werden kontinuierlich in der respirometer gerührt. Um die Funktion der Mitochondrien, Substrate und Inhibitoren für mitochondriale komplexe Tätigkeit beurteilen können nach Standardprotokollen hinzugefügt werden. Substrate und Inhibitoren können durch Injektion int titriert werdeno die Kammern des Oxygraph und Sauerstoffverbrauch Raten werden mit einer Software berechnet und als Picomol pro Sekunde Anzahl der Zellen. Hochauflösende Respirometrie bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen und üblichen polarographischen Sauerstoffelektrodeneinrichtungen einschließlich der erhöhten Empfindlichkeit und der Fähigkeit, mit einer kleinen Anzahl von biologischen Proben wie intakten oder permeabilisierten Zellen zu arbeiten. Zusätzlich enthält jede Vorrichtung zwei Kammern, und Atemfrequenzen gleichzeitig für Vergleiche der Sauerstoffkonzentration aufgezeichnet. Das hochauflösende Oxygraph hat auch den Vorteil einer verringerten Austreten von Sauerstoff aus den Vorrichtungskammern im Vergleich zu herkömmlichen polarographischen Sauerstoffelektrode Geräte. Ein anderes Gerät vor kurzem Verbrauch zu messen zellulären Sauerstoff entwickelt ist der 96-Well - extrazellulären Fluss Analysator 5. Die extrazelluläre Fluss-Analysator wird mit Fluoreszenz ausgestattet anstelle von polarographischen Sensoren. Die Vorteile der extrazellulärenFlußmittel Analysators verglichen mit dem hochauflösenden Oxygraph sind i) es ist eine weitgehend automatisierte Vorrichtung, ii) es ist möglich, den Sauerstoffverbrauch in 24- und 96-Well-Platten für die Hochdurchsatz-Screening zu messen und erfordert daher geringere Mengen an biologischen Proben, und iii) zusätzliche Messung von zellulären glycolytic Fluss möglich ist. Die Nachteile des extrazellulären Flux Analyzer im Vergleich zum hochauflösenden Oxygraph sind i) die hohen Kosten des Gerätes und der Verbrauchsmaterialien wie fluoreszierende Platten, die sind nicht wiederverwendbar sind, und ii) nur vier Verbindungen pro Test / gut sind injizierbare daher ist das System für das Substrat-Entkoppler-Inhibitor Titration Protokolle nicht durchführbar.

In der vorliegenden Studie verwenden wir hochauflösende Respirometrie mitochondriale Atmung zu bestimmen. Für zellulare Sauerstoffverbrauch Experimente werden die Zellen permeabilisiert den Eintritt von exogenen ADP und oxidierbaren mitochondrialen Substrate zum Zuführen von Elektronen in complexe zu ermöglichens des Atmungssystems. Dieser Ansatz ermöglicht die Zerlegung der einzelnen mitochondrialen Komplexe Atemkapazitäten, die einen deutlichen Vorteil im Vergleich zu intakten Zellen (viele Substrate sind zell impermeant). Jedoch Zellmembranpermeabilisierung wird die Barriere zwischen dem Cytosol und extrazellulären Raum und Medium (Auswaschen der cytosolischen Solute) und der Zusammensetzung des intrazellulären Raum stören wird mit dem extrazellulären Medium äquilibriert. Einer der Nachteile von permeabilisierten Zellen über intakten Zellen ist, dass der mitochondrialen Außenmembran beschädigt werden können, wenn große Mengen an Detergens während Zellpermeabilisierung eingesetzt werden. In intakten Zellen können basal, an- und abgekoppelt Atmung von intakten Zellen gemessen werden. Dieses Verfahren wertet Sauerstoffverbrauch von intakten Zellen ohne Zugabe von exogenen Substraten und ADP, die Atmungsfunktion in der integrierten Zelle wiedergeben und auch Informationen über die maximale mitochondrialen Elektronen transpo Bereitstellenrt Kapazität 6, 7. Einer der Vorteile von intakten Zellen über permeabilisierten Zellen, die zelluläre Umgebung nicht gestört wird und Mitochondrien sind in Kontakt mit den gesamten Komponenten der Zellen. Um die zelluläre Plasmamembran, Detergenzien wie Digitonin permeabilisieren haben 8 verwendet. Jedoch kann mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigt werden, wenn überschüssige Mengen an Digitonin eingesetzt werden. Um diese mitochondrialen Außenmembran-Integrität zu bestätigen ist nicht in permeabilisierten Zellen beeinträchtigt wird Digitonin-Titration durchgeführt, um die optimale Konzentration für zellulare Permeabilisierung zu bestimmen. Für diese Experimente werden die Zellen in Medium resuspendiert und Atmungs Digitonin Konzentration wird durch Respirometrie in Gegenwart von Substraten und mitochondriale ADP titriert und Atmungsraten gemessen werden. Respiration von intakten, nicht-permeabilisierten Zellen nicht in Gegenwart von mitocho stimuliertendrial Substrate und ADP. Allerdings nachfolgende schrittweise Digitonin Titration allmähliche Permeabilisierung der Plasmamembranen und optimale Digitonin Konzentration erhalten würde ergeben wird. Dies wird durch die Zunahme der Atmung bis zur vollen Permeabilisierung gezeigt. Mitochondriale Qualität und der äußeren Membran Integrität kann durch Zugabe von exogenen Cytochrom - c - 2, 9 überprüft werden. Cytochrom c ist ein 12 kDa Elektron tragende Protein der mitochondrialen Elektronentransportkette 10, 11, 12. Es ist in der mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert und wird in den Sauerstoffverbrauch, Trage Elektronen von Komplex III-Komplex IV beteiligt. Sobald der mitochondrialen Außenmembran beschädigt ist, wird Cytochrom c freigesetzt und mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs reduziert wird. Nach der Zugabe von exogenen Cytochrom c ist jede Augmentation in die mitochondriale Atmung eines indikativenmitochondrialen Außenmembran gestört.

In permeabilisierten Zellen, Substrate und Inhibitoren der mitochondrialen Komplex - Aktivität zugesetzt werden , nach verschiedenen Protokollen 3, 9. Beispielsweise um die mitochondriale Komplex-driven Atmungsraten zu untersuchen, kann das folgende Protokoll verwendet werden. Nach der Permeabilisierung der Zellen wird zunächst Komplex I durch die Substrate Malat und Glutamat stimuliert, die NADH als Substrat zu der Atmungskette erzeugen und die Aktivierung von komplexen I. provozieren Danach wird ADP für die Umwandlung in ATP hinzugefügt (Zustand 3 aktive Komplex I-abhängige Atmung). Nachdem ein stabiles Signal erreicht wird, Rotenon (mitochondriale Komplex I - Inhibitor) verabreicht Komplex I zu hemmen Rotenon 2 von Succinat zu FADH gefolgt ist und komplexe II (Zustand 3, aktive Komplex II-abhängige Atmung) zu aktivieren. Um komplexe IV abhängige Atmung, erste Komplex III zu messen-abhängigen Atmung wird durch Zugabe von Antimycin A (mitochondriale Komplex III-Inhibitor) gehemmt. Danach Komplex IV abhängige Atmung wird durch Verabreichung von Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) stimuliert. TMPD durch Subtrahieren Atmungsraten in dem Atmungspuffer daher die maximale Komplex IV abhängigen Atmungsrate (Zustand 3) berechnet automatisch oxidieren vor und nach der Zugabe von Natriumazid, einem Inhibitor der mitochondrialen Komplex IV. Die Atmungs Experimente können in zwei Kammern eines Oxygraph in parallel-on durchgeführt werden, dienen als Kontrolle (nicht-stimulierte Zellen), die andere mit den stimulierten Zellen. Offensichtlich können die Zellen auf verschiedene Weise vorbehandelt werden, beispielsweise mit Medikamenten mitochondrialen Funktionen beeinflussen, bevor ihre Sauerstoffverbrauch in der Oxygraph Kammer gemessen wird. Dieses Protokoll ermöglicht funktionelle Untersuchung der einzelnen mitochondrialen Atmungskette Komplexe. Zusätzlich kann eine maximale ADP-stimulierte messenAtmung (Zustand 3) von permeabilisierten Zellen, exogene Fettsäure in Form von Palmitat verwendet wird. (: 1-Molverhältnis Palmitat: BSA 6) In diesem Protokoll konzentrierte Vorräte an Natriumpalmitat sind mit ultra Fettsäure freies Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. Danach ersten Zellen mit Digitonin und mitochondriale Atmung permeabilisiert werden, wird durch die Zugabe von Carnitin beurteilt und Palmitate durch Zugabe von ADP (Zustand 3, maximal Atmung) gefolgt. Dann Oligomycin zugegeben Zustand 4 (Stand 4o) und Atemkontrollverhältnis (RCR-Wert) zu imitieren, wird als Zustand 3 / Zustand 4o berechnet. β-Oxidation fördert Herstellung von Acetyl - CoA (die in der TCA - Zyklus eintritt) und die Erzeugung von FADH 2 und NADH, die Elektronen von dem auf die Elektronentransportkette durch Elektronentransferierendes Flavoprotein und β-Hydroxyacyl-CoA - Dehydrogenase geben werden. Mitochondrien sind in der Mitte des Fettsäurestoffwechsels und beschrieben Palmitat-BSA-Protokoll von den Forschern verwendet werden kann Fett untersuchenty Säureoxidation. In intakten Zellen, Aktivatoren und Inhibitoren der mitochondrialen Komplex - Aktivität werden nach einem anderen Protokoll hinzugefügt 6, 9. Für diese Experimente ersten Sauerstoffverbrauch von nicht-permeabilisierten Zellen in Abwesenheit von exogenen Substraten gemessen (Atmungsrate phosphorylieren). Dann wird die nicht-Phosphorylierungsmittel Atmungsrate nach der Zugabe von Oligomycin gemessen wird, die ein Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase ist. Danach wird das Cyanid protonophore carbonyl p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in verschiedenen Konzentrationen verabreicht und die maximale mitochondrialen ungekoppelten Atmungsrate gemessen wird. Protonophoren wie FCCP kann eine Steigerung in Protonendurchlässigkeit der inneren Membran, so dass passive Bewegung von Protonen induzieren die chemiosmotic Gradienten abzuleiten. Eine Erhöhung der Protonen Permeabilität abkoppelt oxidativen Atmung (kein ATP-Produktion) und induziert eine Erhöhung oxygen Verbrauch. Danach werden Rotenon und Antimycin A hinzugefügt mitochondriale Atmung zu hemmen, und nicht-mitochondriale Atmung wird von allen anderen Atmungsraten subtrahiert.

Die Sauerstoffverbrauchsraten können als IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 Zellen] (Sauerstofffluss pro Million Zellen) ausgedrückt werden , die durch Teilen volumenspezifische Sauerstofffluss (in der geschlossenen Sauerstoffkammer), JV, O berechnet 2 [pmol x sec -1 x ml -1] von Zellkonzentration in der Zellkammer (Anzahl der Zellen pro Volumen [10 6 Zellen ∙ ml 1]) 15. Zell-Masse spezifische Sauerstofffluss, JO 2 [pmol x sec -1 x mg -1] ist Fluss pro Zelle, IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 Zellen], dividiert durch die Masse pro Zelle [mg ∙ 10 6 Zellen]; oder volumenspezifische Fluss, JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1], durch Masse pro vol geteiltume [mg ∙ ml 1]. 2 JO ist der Sauerstofffluss pro Zellprotein, Trockengewicht oder Zellvolumen.

In der vorliegenden Studie hochauflösenden Respirometrie verwenden, beschreiben wir Protokolle i) eine optimale Digitonin Konzentration für die vollständige zelluläre Plasmamembran Permeabilisierung (Digitonin Titrationsassay), ii) die mitochondriale Außenmembran Integrität mit exogenen Cytochrom c, iii) die mitochondriale Atmungskette Komplexe I zu bestimmen, , II und IV maximale Atmungsraten in Digitonin-permeabilisierten HepG2-Zellen in Gegenwart von exogenem ADP und der mitochondrialen Atmungskette Substrate und iv) basal, gekoppelt und maximal ungekoppelten Atmung (maximale Elektronentransportkapazität) von intakten Zellen ohne Zugabe von exogenen Substraten und ADP, Wiedergeben der Atmungsfunktion in der integrierten Zelle.

Protocol

1. Zellkultur

  1. Kultur menschlicher Hepatomzellen HepG2 - Zelle 6 in 25 cm 2 Zellkulturflaschen in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in einem Inkubator (5% CO 2, 95% Luft) (Aussaatdichte: 1 x 10 6 Zellen pro 25 cm 2 Zellkulturflasche, Inkubationszeit in dem 37 ° C Inkubator 48 h, Zelldichte bei Konfluenz: 4-5 x 10 6 Zellen pro 25 cm 2 Zellkulturflasche).
  2. Führen Sie die Experimente, wenn die Zellen 90% bis 95% konfluent sind.

2. Hochauflösende Respirationstest Kalibrierung von Polarographische Sauerstoffsensoren

  1. Pipette 2,1 ml Atmungspuffer in eine Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 Stunde, bis eine stabile Sauerstofffluss Signalder polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird.
    HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer messen Sauerstoffkonzentration und Berechnung des Sauerstoffverbrauchs (Fluss) in jeder Kammer. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt.
  2. Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers 14.
    HINWEIS: Die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren in Atmung Medien und Sauerstoffkonzentration in den Medien bei Luftsättigung experimentellen Temperatur nur einmal täglich am Morgen durchgeführt wird. Anschließend können die Medien aus den Kammern und Zellen in einem frischen Atmung Medien resuspendiert werden zu einer Oxygraph Kammer gegeben und Atemfrequenz gemessen werden. Nach dem ersten Versuch kann die Kammer gewaschen und weitere Reihe von Experimenten in t durchgeführt werden kanner derselben Kammer ohne weitere Kalibrierung.

3. Trypsinisierung von adhärenten Zellen, Zellzählung

  1. Am Tag des Experiments absaugen DMEM von der 25 cm 2 Zellkulturflasche.
  2. Spülen der Zellkultur-Monoschicht in der Kulturflasche mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Pipette 0,5 ml 25 mg / ml Trypsinlösung (vorgewärmt auf 37 ° C in einem 37 ° C Wasserbad) in die Zellschicht in dem Kulturkolben und Inkubation für 5 min bei 37 ° C in einem Inkubator (5% CO 2 Luft, 95%).
  4. Pipette 5 ml DMEM 10% FBS in die abgelösten Zellen in der Zellkulturflasche enthält und die Zellen durch Pipettieren suspendieren.
  5. Transfer-Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 xg bei Raumtemperatur und dekantiert den Überstand resuspendiert.
  6. Zellpellet in 1 ml Atmungspuffer 13 (T können 1).
  7. i> Zähle die Zellen mit einem Zellzähler verwenden und sie in dem Atmungspuffer auf eine endgültige Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Da die Zellatmung Raten auf die Zellzahl normalisiert werden, um die Zellen mit einer genauen und präzisen Zellzähler zählen.

4. Hochauflösende Respirationstest

  1. Nach Luftkalibrierung (täglich nur einmal durchgeführt, 2,1-2,2 Stufen), aus einer Kammer des Oxygraph die Atmungs Medium absaugen und aus dem Schritt 3.7 der Kammer 2.1 ml der Zellsuspension (1 x 10 6 Zellen / ml) hinzufügen.
  2. Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens.
  3. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
    HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss-Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyses = "xref"> 14.
  4. Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Protokolle verwenden.

5. Digitonin Titration in intakten Zellen durch Respirationstest

  1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 6 / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
  2. Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 5-10 min aufgezeichnet, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird .
    Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden. Die Zugabe von Rotenon ist optional (es verhindert Reverse-Elektronenfluss) und kann für Digitonin Titrationsexperimenten weggelassen werden, sieheSchritt 6.3.
  3. Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  5. Injizieren 2 ul 2 mM Digitonin (2 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 2-5 min, bis eine stabile Sauerstoffsignal erreicht wird.
  6. injizieren Wieder 2 ul 2 mM Digitonin in die Oxygraph Kammer und aufzeichnen für 2-5 min Zellatmung, bis ein stabiler Sauerstoffsignal erreicht wird.
    HINWEIS: Die schrittweise Zugabe von Digitonin zu den Zellen wird eine Erhöhung der zellulären Sauerstoffverbrauch und den Sauerstoffflusssignal erhöht induzieren.
  7. Weiterhin 2-4 & mgr; l 2 mM Digitonin schrittweise (2-4 uM jede Stufe) in die Kammer eingespritzt wird. Nach jedem Schritt erfassen die Zellatmung für 2-5 min bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
    HINWEIS: Stoppen Sie die Injektion Digitonin, wenn der Sauerstoffflusssignal einen maximalen Pegel und weitere Injektionen von Digitonin erreicht nicht erhöhen die Atmungsrate. Die Leser sollten optimal Digitonin Konzentration in ihren Labors bestimmen ihren Reagenzien und Verwendung erhalten optimale Digitonin-Konzentration in den Schritten 6.2 und 7.2 der folgenden Protokolle für ihre Experimente.

6. Auswertung der mitochondrialen Außenmembran Integrität: Cytochrome C

  1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 6 / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
  2. Injizieren 2 ul 8 mM Digitonin (8 uM) in die Oxygraph Kammer mit der Zellsuspension (1 x 10 6 / ml) und Permeabilisierung der Zellen für 5 min.
  3. Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph aufzuzeichnen zellulare respiratIon für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
    HINWEIS: Die Zugabe von ADP zu den Zellen wird komplexen I stimulieren und eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs induzieren und Sauerstoff Flußsignal erhöhen und zu stabilisieren.
  5. Injizieren Sie 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  6. Schließlich injizieren 1 ul 4 mg / ml Oligomycin (2 ug / ml) und die Zellatmung erfassen, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.

7. Maximal ADP-stimulierte Respiration (State 3) von permeabilisierten HepG2-Zellen

  1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 6 / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
  2. Injizieren 2 ul 8 mM Digitonin (8 & mgr; M) in die Kammer Oxygraph die Zellsuspension enthält, und Permeabilisierung der Zellen für 5 min.
  3. Injizieren von 12,5 & mgr; l von 0,8 M von Malat (5 mM) und 10 ul 2 M von Glutamat (10 mM) in die Kammer Oxygraph. Nehmen Sie die Zellatmung, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal erhöht und stabilisiert.
    HINWEIS: Die Zugabe von ADP zu den Zellen eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht induzieren.
  5. Injizieren Sie 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM) "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.
  6. Danach injizieren 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt aufzeichnenund stabilisiert.
  7. Dann injizieren 2 ul 5 mM A (5 uM) "VORSICHT" in die Oxygraph Kammer Antimycin und die Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert sich aufzunehmen.
  8. Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM) und unmittelbar nach der 2,5 & mgr; l von 0,2 mM TMPD (0,25 mM) in die Kammer zu injizieren und Oxygraph Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal erhöht und stabilisiert aufzuzeichnen.
  9. injizieren schließlich 10 ul 1 M Natriumazid (5 mM) "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.

8. Sauerstoffverbrauch intakter Zellen

  1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 6 / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
  2. Injizieren 1 ul 4 mg / ml Oligomycin (2 ug / ml) in die Kammer Oxygraph enthaltenden Zellsuspension eind Aufzeichnung der Zellatmung, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  3. Danach injizieren 1 ul 0,2 mM FCCP (0,1 uM) "VORSICHT" in die Oxygraph Kammer und die Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal erhöht aufzeichnen und stabilisiert.
  4. Injizieren 3 ul 0,2 mM FCCP (0,4 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal weiter ansteigt und stabilisiert.
  5. Titrieren FCCP in 0,1 bis 0,3 uM Schritten von 1-3 & mgr; l von 0,2 bis 1 mM FCCP Injektion (0,1 bis 2 & mgr; M Endkonzentration in der Kammer) in die Kammer, bis das Oxygraph Sauerstofffluß Signal erreicht ihren maximalen Niveaus und keine weiteren Erhöhungen und dann beginnt rückläufig.
    HINWEIS: Stoppen Sie FCCP Injektion, wenn der Sauerstoffsignal ein maximales Niveau erreicht und beginnt rückläufig.
  6. Dann injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 & mgr; M) und 2 ul 5 mM A (5 uM) Antimycin in die Kammer. Nehmen Sie die Atmung bis ter Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.

Representative Results

Bestimmung der optimalen Digitonin Konzentration für Cellular Permeabilisierungs: Digitonin Titrationsexperiment

Digitonin Titration wird durchgeführt, um die optimale Konzentration für die Permeabilisierung von HepG2-Zellen zu bestimmen. Für diese Experimente wurden Digitonin in intakten Zellen in Gegenwart von Rotenon, Succinat (mitochondriale Komplex II Substrat) und einer sättigenden Menge an ADP titriert (Komplex II-abhängigen Zustand 3 zu induzieren) und Atemfrequenz zu Beginn der Studie gemessen werden und nach jedem Titration (1A und 1B). Das Ergebnis dieses Experiments zeigt, dass in Abwesenheit von Digitonin, Zellatmung ist sehr gering und die Atmung von intakten, nicht-permeabilisierten Zellen in Gegenwart von mitochondrialer Substrat und ADP nicht stimuliert. Jedoch bei schrittweise Zugabe von Digitonin, die zelluläre Plasmamembran permeabilisiert und mitochondrial Atmung (Komplex II-abhängigen Zustand 3) erhöht sich auf volle Permeabilisierung, wenn Succinat und ADP in die Zellen eindringen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einer Permeabilisierung Digitonin Konzentration von 8-12 & mgr; M für die ADP-stimulierte Atmung von HepG2-Zellen optimal ist. Jedoch kann mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigt werden, wenn überschüssige Mengen an Digitonin eingesetzt werden. Wie in Figur 1 gezeigt, induzierte übermßige Mengen an Digitonin eine Verringerung Komplex II-abhängige Atmungszustand 3 mitochondrialen Außenmembran Integrität anzeigt kompromittiert.

In den vorliegenden und folgenden Protokolle, die alle die Sauerstoffverbrauchsraten werden als IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 Zellen] ausgedrückt (Sauerstofffluss pro Million Zellen) , die durch Teilen volumenspezifische Sauerstofffluss berechnet (in der geschlossenen Sauerstoffkammer), JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1] von Zellkonzentrat Ionen in der Zellenkammer (Anzahl der Zellen pro Volumen [10 x 6 Zellen ml -1]) 15.

Abbildung 1
Abbildung 1: Digitonin Titration die optimale Konzentration für die Permeabilisierung von HepG2 - Zellen zu bestimmen. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration; die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als Zellen, die die verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sec x Anzahl der Zellen) ausgedrückt. (A) Tracings von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Digitonin, ADP und Succinat als Substrat für mitochondriale Komplex II-abhängige Atmung (1 Versuch). (B) Die mitochondriale Atmungsraten von 4 einzelnen Experimenten dargestellt , als ± SD bedeutet.laden / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Auswertung der mitochondrialen Außenmembranintegrität mittels einer optimalen Digitonin Konzentration

Um die Wirkung der optimalen Digitonin Konzentration (8 uM) auf der äußeren mitochondrialen Membranintegrität auszuwerten, Zellen werden permeabilisiert mit Digitonin und mitochondriale Integrität der äußeren Membran durch Messung der mitochondrialen Atmung nach der anschließenden Zugabe von Succinat (mitochondriale Komplex II abhängigen Ruhezustand 2 getestet Respiration in Abwesenheit von ADP), ADP (ADP stimuliert Komplex II-abhängigen Zustand 3 Atmung) und Cytochrom c (ADP-Komplex stimuliert II-abhängigen Zustand 3 Atmung in Gegenwart von Cytochrom-c), durch die Zugabe von Oligomycin gefolgt (einen Inhibitor der ATP - Synthase) Zustand nachzuahmen 4. Wie in Figur 2 gezeigt

Figur 2
Abbildung 2: Cytochrome c erhöht nicht die Atmung der mit Digitonin (8 uM) behandelten Zellen. Repräsentative Atmungs Spuren für die Cytochrom-c-Test unter Verwendung von hochauflösenden Respirometrie. Zellen werden mit 8 uM Digitonin und mitochondrialen Außenmembran Integrität permeabilisiert durch Messung der Atemfrequenz nach der anschließenden Zugabe von 10 mM Succinat (Zustand 2), 2,5 mM ADP (Zustand 3) und 10 uM Cytochrom c (Zustand 3 in Gegenwart getestet Cytochrom c), gefolgt von der Zugabe von 2 pg / ml Oligomycin Zustand 4. die Atemfrequenz nachahmen als pmol / (sec ausgedrückt x million Zellen). CII: Komplex II. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Auswertung der mitochondrialen Außenmembranintegrität eine hohe Konzentration von Digitonin Verwendung

Um zu zeigen, dass eine sehr hohe Konzentration von Digitonin mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen können, führten wir ein Experiment eine hohe Dosis von Digitonin verwenden. Für dieses Experiment werden permeabilisierten Zellen mit 40 & mgr; M Digitonin anstelle von 8 uM und mitochondrialen Außenmembran Integrität durch Messung der mitochondrialen Atmung nach der anschließenden Zugabe von Succinat getestet (mitochondriale Komplex II-abhängigen Zustand 2 Atmung in Abwesenheit von ADP ruhend) ADP und Cytochrom c (ADP-Komplex II-abhängigen Zustand 3 Atmung stimuliert) (ADP stimuliert Komplex II-dependent Zustand 3 Atmung in Gegenwart von Cytochrom - c), durch die Zugabe von Oligomycin gefolgt Zustand 4 in Gegenwart von Oligomycin (Abbildung 3) nachahmen. Das Ergebnis dieses Experiments zeigt, dass Cytochrom c verbessert Atmung der mit einer hohen Dosis von Digitonin behandelten Zellen, was einen Verlust von Cytochrom c aus der mitochondrialen Außenmembran anzeigt kompromittiert mitochondrialen Außenmembran Integrität anzeigt.

Figur 3
Abbildung 3: Hohe Dosis von Digitonin (40 uM) kompromittiert mitochondrialen Außenmembran Integrität. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Succinat als Substrat. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration; die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als Zellen, die die verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird ausgedrückt alspmol / (sec x Anzahl der Zellen). Anschließende Zugabe von 40 & mgr; M Digitonin, Succinat (10 mM), ADP (2,5 mM), Cytochrom c (10 uM) und Oligomycin (2 ug / ml) angegeben. CII: Komplex II. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Maximal Respiration (State 3) von permeabilisierten HepG2 Zellen ADP-stimulierten, unter Verwendung von überschüssigem exogene Substrate

Komplexe I-, II- und IV-abhängige maximale ADP-stimulierte Atmung (Zustand 3) von permeabilisierten HepG2 - Zellen (1 × 10 6 Zellen / ml) erfolgreich gemessen überschüssige exogene Substrate (Abbildung 4). Für dieses Experiment werden die Zellen mit Digitonin und mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsraten gemessen nach der anschließenden Zugabe von Substraten und Inhibitoren, wie beschrieben in permeabilisierten

Abbildung 4
Abbildung 4: Erfolgreiche Messung der maximalen ADP-stimulierte Atmung (Zustand 3) von permeabilisierten HepG2 - Zellen. Die Atemfrequenz wird als pmol / (sec x Millionen Zellen) ausgedrückt. Die Zellen werden permeabilisiert mit 8 uM Digitonin und mitochondrialen Atmungsraten werden nach der anschließenden Zugabe von Glutamat und Malat (Zustand 3, Komplex I) gemessen, Rotenon Komplex I zu hemmen, Succinat (Zustand 3, Komplex II), A Antimycin Komplex III zu hemmen und Ascorbat / TMPD und Natriumazid Komplex IV zu inhibieren. Komplex IV Atmung (Zustand 3)wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. CI: Komplex I, CII: Komplex II, CIV: Komplex IV. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Erfolglos Messung der Maximal ADP-stimulierte Respiration (State 3) von permeabilisierten HepG2-Zellen

Komplexe I-, II- und IV-abhängige maximale ADP-stimulierte Atmung (Zustand 3) der permeabilisierten HepG2 - Zellen (1 x 10 6 Zellen / ml) nicht erfolgreich gemessen überschüssigem exogenen Substraten (Abbildung 5). Für dieses Experiment werden die Zellen mit Digitonin und mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsraten gemessen nach der anschließenden Zugabe von Substraten und Inhibitoren permeabilisiert , wie in Figur 5 beschrieben. Wie in 5 gezeigt 4 gezeigt ist . Eine mögliche Erklärung für reduzierte Atemniveaus ist die Verunreinigung von Oxygraph Kammern mit mitochondrialen Inhibitoren aus früheren Experimenten. Mitochondrial-Inhibitoren wie Antimycin und Rotenon sind in Ethanol löslich ist und an die Oxygraph Kammern und Stoppern haften können. Daher Oxygraph Kammern und Stopfen sollten weitgehend nach jedem Experiment gewaschen werden.

Abbildung 5
Abbildung 5: Erfolglose Messung der maximalen ADP-stimulierte Atmung (Zustand 3) von permeabilisierten HepG2 - Zellen. Repräsentative Atmungs Spuren eines erfolglosen Versuch von komplexen I-, II- und IV-driven maximale ADP-stimulierte Atmung (Zustand 3) von permeabilisierten HepG2-Zellen unter Verwendung von hochauflösenden Respirometrie. Die Atemfrequenz wird ausgedrückt alspmol / (sec x Million Zellen). Die Zellen werden permeabilisiert mit 8 uM Digitonin und mitochondrialen Atmungsraten werden nach der anschließenden Zugabe von Glutamat und Malat (Zustand 3, Komplex I) gemessen, Rotenon Komplex I zu hemmen, Succinat (Zustand 3, Komplex II), A Antimycin Komplex III zu hemmen und Ascorbat / TMPD und Natriumazid Komplex IV zu inhibieren. Komplex IV Atmung (Zustand 3) wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

An- und abgekoppelt Respiration intakter Zellen

HepG2 - Zellen 'basal Sauerstoffverbrauch wird in Gegenwart von Oligomycin (Oligomycin-insensitive Atmung) und sequentielle Zugabe von FCCP (Abbildung 6) gemessen. Basal zelluläre Respirationsrate darstellt Sauerstoffverbrauch von intaktem HepG2-Zellen in der Gegenwart von endogenen zellulären Substraten und kann in Reaktion auf zelluläre ATP Bedarf verändern. Oligomycin unempfindlichen Atmungsrate repräsentiert die Zellatmung und Oligomycin empfindlichen Atemfrequenz auslaufen, die zelluläre ATP Umsatz darstellt und wird berechnet, indem die Oligomycin unempfindlichen Atmungsrate von basalen endogenen Atmungsrate subtrahiert wird. Die chemische Entkopplers FCCP sequentiell in unterschiedlichen Konzentrationen und maximal ungekoppelten Atmung aufgenommen zugegeben. Die maximale mitochondrialen abgekoppelt Atmungsrate (maximale Elektronentransportsystem Kapazität) für diesen experimentellen Bedingungen wird bei 0,9-1,2 uM FCCP erhalten. Die Ergebnisse zeigen eine zweiphasige Aktivität von FCCP in intakten HepG2-Zellen. Daher ist für jede experimentelle Bedingung wird FCCP titriert maximal ungekoppelten Atmungsrate zu erhalten. Die entkoppelten Atemsteuerquote (uRCR) wird berechnet, indem der FCCP Dividierenungekoppelten Atmungsrate durch die Atmungsrate in Gegenwart von Oligomycin. Oligomycin empfindliche Atmung (ATP Umsatz) wird durch Subtraktion Oligomycin unempfindlichen Atmungsrate von basalen endogenen Atmung berechnet. Die Kopplungseffizienz, die den Anteil der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch darstellt verwendet ATP zu synthetisieren, indem man die Oligomycin empfindlichen Atemfrequenz durch die Basalatmung Rate berechnet wird. Am Ende des Experiments werden erhalten nicht-mitochondrialen Atmungsrate, mitochondrialen Elektronentransportkette Inhibitoren zugesetzt und nicht-mitochondrialen Atmungsrate von allen Ergebnissen subtrahiert. Für das Experiment in 6 gezeigt ist , ist die nicht-mitochondrialen Atmungsrate 26 pmol / (sec x Million Zellen), die Basalatmung Rate beträgt 48 pmol / (sec x Millionen Zellen), Oligomycin unempfindlichen Atmungsrate 7 pmol / (sec x Millionen Zellen), Oligomycin empfindliche Atmung (ATP Umsatz) 41 pmol / (sec x Million Zellen) und coupling Wirkungsgrad 0,85.

Figur 6
Abbildung 6: an- und abgekoppelt Atmung von intakten Zellen. Representative Atmungsspuren 'HepG2 Zellen basal Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Oligomycin gemessen (Oligomycin-insensitive Atmung) und sequentielle Zugabe von FCCP unter Verwendung hochauflösender Respirometrie. Danach wird, sobald ein stabiles Signal erreicht wird, die Atmung wird mit der Zugabe von Rotenon und Antimycin A inhibiert und die restlichen Hintergrund Atmung (non-mitochondriale Atmung) von allen Ergebnissen subtrahiert. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sec x Anzahl der Zellen) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Respiration Puffer 13
Chemisch Konzentration
Sucrose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl 2 3,0 mM
KCl 80 mM
K-Lactobionat 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
Taurin 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1,0 g / L
pH-Wert 7.1

Tabelle 1: Die Zusammensetzung des Atmungspuffer.

Discussion

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war hochauflösende Respirometrie zu verwenden, um die mitochondriale Atmungskette Komplexe "(I-IV) Atemfrequenz, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und der mitochondrialen Außenmembran Integrität messen.

Es gibt einige wichtige Schritte im Rahmen der vorliegenden Protokoll. Zuerst werden zellulare Sauerstoffverbrauchsraten der Regel auf die Anzahl der Zellen normiert (pmol / [sec x Anzahl der Zellen]). Deshalb wird vor der zellulären Sauerstoffverbrauch überwachen, ist es wichtig, eine Vorrichtung zu verwenden, die genaue und zuverlässige Messungen der Anzahl von Zellen ermöglicht. Im vorliegenden Protokoll eine automatisierte Zellzähler verwendet worden ist (Schritt 3.7 des Protokolls und Tabelle der Materialien). Ein zweiter kritischer Schritt, vor allem in permeabilisierten Zellen, ist die Wahl des Atmungspuffer in dem permeabilisierten Zellen resuspendiert (Schritt 3.6 des Protokolls). Da zelluläre Permeabilisierung kann den Verlust von intracellula induzierenr Ionen, ist es sehr wichtig, dass das Medium während der Permeabilisierung verwendet mit intrazellulären Umgebung kompatibel ist. Daher sollte Atmungspuffer eine Zusammensetzung und Osmolarität enthalten , die sowohl die intrazelluläre und die extrazelluläre Umgebung (Tabelle 1) 13 reflektiert. Darüber hinaus ist für eine optimale und effektive Zell Permeabilisierung ist es entscheidend Konzentration zu titrieren Digitonin nicht nur für jede Zelle, sondern auch für jede Zelldichte, seine optimale und niedrigste wirksame Konzentration zu identifizieren. Wenn Digitonin Konzentration zu niedrig ist, wird nicht die Zellen permeabilisiert werden. Im Gegensatz dazu ist der Exposition der Zellen, um große Mengen von Digitonin die mitochondrialen Außenmembran beschädigen. Daher ist ein weiterer wichtiger Punkt der mitochondrialen Außenmembran-Integrität zu untersuchen. Um zellulären Atmungsfähigkeit nicht zu unterschätzen, ist es auch wichtig, dass Respirometrie Experimente bei einer physiologischen Temperatur durchgeführt werden (37 ° C). Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Verwendung von Mengen an ADP aufgrund der Diffusionsbegrenzungs von ADP im Vergleich zu Sauerstoff in permeabilisierten Zellen und ausreichende Substratniveaus zu erhalten maximalen Atemfluss zu sättigen. In einigen Experimenten in permeabilisierten Zellen, kann es, dass die Zugabe von exogenen Substrate passieren und ADP zu einer erheblichen Steigerung nicht in der Rate der Atmung führen. Dies kann durch verschiedene Faktoren verursacht werden. Beispielsweise die Verwendung von hohen Konzentrationen von Digitonin um die Zellen zu permeabilisieren kann den mitochondrialen Außenmembran beschädigen. Daher sollte man titrieren Digitonin, um die optimale Konzentration für jeden Zelltyp und der Dichte zu bestimmen. Ferner Reinheit von Digitonin ist auch sehr kritisch, und im Handel erhältlich sollten ihre optimalen Konzentrationen für zellulare Permeabilisierung zu titrierenden Digitonin signifikant in Reinheit und neue Chargen von gekauften Digitonin variieren bestimmen. Darüber hinaus gibt es mehrere Arten von zellulären Plasmamembran porenbildendeWirkstoffe mit unterschiedlichen Eigenschaften. Zum Beispiel ist ein Saponin milder Reinigungsmittel als Digitonin und abhängig vom Zelltyp, eine geeignete Zelle Permeabilisierung Reagenz ausgewählt werden sollte.

Die meisten Inhibitoren der mitochondrialen Funktion in Respirometrie Assays verwendet, wie Rotenon Antimycin A, löslich sind nur in Ethanol und halten Sie sich an den Oxygraph Kammern und Stoppern, die Hemmung der Zellatmung. Zur Vermeidung dieses Problems, Oxygraph Kammern und Stoppern müssen extensiv mit 95% Ethanol nach jedem Assay gewaschen werden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass für beide intakt und permeabilisierten Zellatmung Assays, Zelldichte, die Art und Zellkultur Einmündung Atemfrequenz beeinflussen können. Beispielsweise mit HepG2-Zellen, verwenden wir normalerweise eine Zelldichte von 1 bis 2 Millionen Zellen pro Kammer. sehr geringe Zelldichte während der Respirometrie Verwendung kann zu einem sehr schwachen Signal. Wir beobachteten auch, dass die Zellkultur Konfluenz die Atemfrequenz beeinflussen können. Für EXAmple, wenn HepG2-Zellen sind sehr konfluent gewachsen (mehr als 100%), verbrauchen sie viel weniger Sauerstoff.

Um eine stabile und reproduzierbare Sauerstofffluss während der Experimente erhalten, ein weiterer wichtiger Punkt ist die Wartung der hochauflösenden Respirometrie Instrument- dh regelmäßigen Austausch von polarographischen Sauerstoffsensormembranen und instrumentalen Hintergrund korrigiert. Für Experimente mit dem Entkoppler FCCP kann es, dass die Zugabe von FCCP zu den Zellen sein, nicht stimulieren die Zellatmung und maximaler Fluß nicht erhalten wird, sondern die Zellatmung gehemmt wird. Die Hemmung der zellulären Sauerstoffverbrauch bei der Zugabe von FCCP kann darauf hindeuten, dass FCCP Konzentration nicht optimal war und war zu hoch. Für diese Experimente wurden für jeden Test, ist es wichtig, sorgfältig FCCP Konzentration titrieren maximalen Fluß zu erhalten.

Eine Einschränkung von hochauflösenden Respirometrie ist, dass High-Throughput-Screening, die Einrichtung vonDosis-Wirkungskurven und Zeitverlaufsexperimente für begrenzte Mengen von biologischen Proben sind nicht durchführbar. Für diese Tests kann man andere Instrumente, wie beispielsweise die extrazelluläre Fluss-Analysator verwendet werden. Weitere Einschränkungen sind i) die Vorrichtung nicht automatisiert und erfordert die ständige Anwesenheit einer Bedienungsperson, ii) es ist zeitaufwendig, iii) es nur zwei Kammern hat und nur zwei Assays können gleichzeitig ausgeführt werden, iv) die Wartung des Instruments , erfordert viel Zeit und v) die Kammern nicht den einmaligen Gebrauch und kann mit Inhibitoren kontaminiert werden, wie die Membranen und Kalibrierungen zu verändern. Die Vorteile der hohen Auflösung gegenüber herkömmlichen Oxygraph polarographischen Sauerstoffelektrode Geräte sind i) eine höhere Empfindlichkeit, ii) einer kleineren Anzahl von biologischen Proben erforderlich, iii) Atemfrequenzen gleichzeitig in zwei Kammern gemessen werden kann, und iv) die Vorrichtung hat Sauerstoffleck verringert. Einige Vorteile der hochauflösenden Oxygraph über den extrazellulären Flußmittel Analysators i) geringere Kosten desGerät und Verbrauchsmaterialien und ii) Machbarkeit von Substrat-Entkoppler-Inhibitor Titration Protokolle.

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach dieser Technik zu meistern sind gleichzeitige Messungen der Zellatmung, mitochondriales Membranpotential, H 2 O 2, ATP und Calciumspiegel optischen Sensoren in der gleichen Kammer verwendet wird .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

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References

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