Kapillær mater analysen Måler matinntak i

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Å spise er viktig; Men deregulering av matinntak fører til spiseforstyrrelser som bulimi, anoreksi eller generell tendens til å overspise pålegger koster på individ og samfunn 1, 2, 3. Målet for den foreliggende forskning er å avdekke reguleringsmekanismer av matinntak og gi en strategi for å omgå uorden formasjonen. Tallrike studier med pattedyrmodellorganismer har gitt ny innsikt i kretsene og rollen til signalanlegg i spiseforstyrrelser 4, 5, 6. Likevel, vår kunnskap om nevronale og molekylære baser bak disse lidelser er fortsatt langt fra komplett. I de siste årene har bananflue Drosophila melanogaster har blitt en verdifull modellsystem for å rakne grunn mekanistiske innsikt i reguleringen av metabolism 7, 8, 9. Kapillær mater (CAFE) assay for Drosophila melanogaster ble etablert i laboratoriet av Seymour Benzer i 2007 inspirert av en tidligere arbeid av Dethier i spyflue 10, 11. Kafeen analysen gjorde det mulig å direkte måle matinntaket i Drosophila melanogaster. I denne atferds teste systemet, fluer lever av flytende mat levert på graderte glass kapillærer plassert inne i et hetteglass. Nedgangen av kapillaren menisken indikerer tap av mat oppløsning via fordampning og matforbruk. Bestemme fordampingen av ampuller uten fluer tillater nøyaktig kvantifisering av matinntak.

Kafeen analysen er en av flere atferds paradigmer som brukes til å måle fôring i Drosophila melanogaster og forskere må velge den som passer best for deres spesifikkespørsmål. Beslutningen om å bruke en viss analyse bør vurdere følgende punkter: innholdet i maten gitt; fôring tilstand; måling av inntak eller opptak av næringsstoffer og undersøkelse matforbruk, eller som reaksjon på mat.

Kafeen analyse som beskrevet i denne rapporten er ideell for å følge mat inntak av en væske matkilde under en oppreist fôring tilstand. Alternativt matinntaket kan måles for en flue gruppe på en farget matkilde i en ampulle eller på en plate. Fluer er vanligvis drept eller bedøvet etter mating og mengden av inntatt fargestoff blir bestemt ved spektrofotometri eller visuell inspeksjon av farget magen. Fluer begynner å skille ut den inntatt mat bare 30 minutter etter inntak, derfor er denne tilnærmingen er vanskelig å benytte for analyse av kontinuerlige lengre foring Adferd 12, 13.

I motsetning fluer holdes intakt når absorberbare fargestoffs med radioaktive tracere brukes og sitt forbruk av radioisotop er scoret i en scintillasjonsteller 14, 15. Absorpsjon av radiomerkingen av fly fordøyelsessystemet gjør langsiktig mat opptak måling mulig, men kan føre til underestimering av forbruket på grunn av ikke-absorbert og utskilles tracer molekyler. En annen tilnærming til å måle respons på mat i bananflue er snabel forlengelse respons (PER), som normalt gjelder for matinntak 16. Denne elegante metoden måler den første reaksjon på en matvare stimulans, men registrerer ikke mengden av inntaket. Matinntak justeres dynamisk under fôring ved hjelp av flere etterfordøyelsestilbakemeldingssignaler som er kritiske for regulering av fôring 17, 18. Flere forsøk har blitt gjort i senere år for å halvautomatisere datainnsamling i PER assay 19, 20. Den PER blir detektert av en elektrisk pute eller en kombinasjon av elektroder og telles via datamaskinen. Ved å kombinere den PER analysen med radio-isotopopptak avslørte at denne metoden er begrenset ved lav følsomhet til å detektere mengde forings forskjeller 18. Den manuelle mating assay (mafe) 21, i hvilken en flue mates manuelt med et glasskapillar, ble nylig utviklet for å måle mat-opptak i en enkelt immobilisert fly. Den mafe assay eliminerer forstyrrelser av beite og mating initiering og har en tidsoppløsning på sekunder, og initiering av PER og matforbruk kan overvåkes uavhengig i analysen. Men på hvilken måte immobilisering av flua påvirker visse aspekter ved fôring atferd (f.eks bevegelse, motivasjon) fortsatt trenger å bli undersøkt. For gode komparative vurderinger av ulike analyser for å måle matforbruket i Drosophila meglanogaster og for å hjelpe forskere med å finne den som passer best, se rapporter fra Deshpande og Marx 13, 22.

Kafeen analysen unngår noen av ulempene ved andre analysene beskrevet ovenfor, og kombinerer enkelhet i bruk med pålitelig måling av matinntak. Her er en detaljert beskrivelse av CAFE analysen gitt og vi viser et enkelt oppsett modifikasjon for å redusere fordampning. Representative resultater, inkludert en to mat valg analysen (kort og lang sikt) og sukrose opptak av fluer er demonstrert. I diskusjonen sammenligner vi vår beskrev metoden med alternative måter å utføre den CAFE analysen, og synliggjør mulige begrensninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CAFE analysen

MERK: Analysen består av tre komponenter: en eksperimentell hetteglass, en bestemt lokk og mikrokapillærer. En plastboks med deksel brukes til å transportere de preparerte ampuller og for å kontrollere fuktigheten mer effektivt.

  1. Bruke et Drosophila melanogaster kultur plastampulle (valgfritt 8 cm høyde, 3,3 cm diameter) som et rør for analysen.
  2. Forsegl flasken med en produsert pleksiglasslokk inneholdende en O-ring (figur 1A, 1B). Load flyr ved å peke eller med en blowpipe gjennom lokket sentrale åpning (0,9 cm diameter), som også gir mulighet for luftsirkulasjon og vannforsyning, og lukke hullet med en svamp bung. Seks mindre koniske åpninger (0,4 cm øvre diameter, 0,3 cm indre diameter) omgir det sentrale hullet og passe pipettespissene av 2-20 mL volum for å holde kapillærene på plass. (Se utfyllende tall for tekniske detaljer lokket.)
    MERK: Brukav en svamp propp med åpninger for kapillærene i stedet for skreddersydde lokk brukes i vår manuskriptet er mulig. Vår tilpasset lokk gir sikker håndtering av de preparerte ampuller minimere risikoen for kapillærer falle ned.
  3. Å presentere flytende mat, bruke 5 mL mikrokapil med 1 mL merkene. Plasser kapillærer i de koniske åpninger i lokket ved å kutte av toppen av 2 - 20 ul pipettespissen og spissen settes inn i hullet (figur 1 B, merket med rød kant). For å forhindre fluer fra å unnslippe, setter en uncut 2-20 mL pipette inn i den samme åpningen.
  4. Å trygt håndtere flere preparerte ampuller, plassere dem i en plastboks med et gitter innlegg (Figur 2A).

2. Utarbeidelse av fluer

  1. Hold fluer på standard mat ved 25 ° C, 60% relativ fuktighet og en 12 h / 12 timers lys-mørke-syklus.
  2. For å kontrollere avl forhold, innføre 35 jomfruelige kvinner end 15 menn for hver forsøksgruppe i en plast kultur hetteglass (9,8 cm høyde, 4,8 cm diameter) som inneholder 50 ml fly mat. Tillat fluer å legge egg for de første 3 dagene, deretter overføre voksen flyr til ferske matvarer ampuller og la dem legge egg i to dager. Etter dette gjenta overføringen på nytt. Kast voksen flyr etter 2 dager.
  3. Som matinntak avhenger av fly størrelse, bestemme vekten av en gruppe på 100 fluer av bedøvelse 2- til 3-dagers gamle voksne fluer ved anvendelse av en CO 2 flue puten og samle dem inn i et 1,5 ml plastrør og måling med en standard laboratorieskala. Bestem våtvekt av minst fire uavhengige flue grupper sortert etter kjønn (tabell 1); bruke vekten til å beregne mL mat forbruk per mg fly. Bruk verdien til å bestemme mengden av mat som en enkel flue feeds per eksperiment og justere antall mat-fylt kapillærer tilsvarende for å unngå tømming av kapillærene ved å mate.
    1. For en 3 h assay bruk20 fluer og to fylte kapillærer. For en langsiktig eksperiment (> 3 t og opp til 9 dager), bruker en gruppe på åtte fluer med en tilførsel av fire fylt kapillærer (pålitelige resultater kan ikke oppnås med mindre enn åtte fluer under de beskrevne forhold).
  4. Separate fluer i grupper (8 eller 20 fluer) etter måler vekten under CO 2 eksponering. Overfør den gruppe til en ny mat hetteglass (inneholdende 15 ml standard mat) for å tillate utvinning av CO 2 sedasjon i 48 timer før forsøket. Bruk 4 til 6 dager gamle fluer for CAFE analysen.
  5. Som ikke-sultet vill type fluer mate bare marginalt 19, flyr 21, pre-sulte i 3 timer fôringsforsøk. Ingen faste kreves når matforbruk overvåkes over flere dager. For faste, flyr overføre 16 til 20 timer før testing ved å banke dem inn i et hetteglass som inneholder kun en 45-mm diameter brettet filterpapir fuktet med ~ 0,5 mL DDH2 O (dobbelt destillert vann), og avsluttes med en plugget CAFE analysen lokket.

3. Utarbeidelse av flytende mat

  1. Fremstille en 3 M (10%, vekt / volum) sukrose-forrådsløsning ved å fylle 102,6 g sukrose (C 12 H 22 O-11) og 100 ml DDH 2 O. Pipetter 3 ul, 33 ul, 333 ul, 3,3 ml og 6,6 ml av stamløsningen inn i et 15 ml plastrør; tilsett 2 ml mat farge (for red: Cochineal [E124]; for blå: Indigokarmin [E132]) og fyll opp til 10 ml med DDH 2 O. De resulterende konsentrasjonene er 0,001, 0,01, 0,1, 1 og 2 M sukrose .
    MERK: Maten fargestoff gjør visual menisken lettere. Men fargestoff kan ha en innvirkning på matinntaket. For å unngå en skjevhet på grunn av fargestoff dispensere mat fargestoff eller randomisert bruken av fargestoffer til maten prøvene under forsøket og grupper.
  2. For å teste for alkohol preferanse pipette 333 mL av 3 M sukrose stamløsning i et 15 ml plastrør.Tilsett 1,5 ml (2,3 ml) av 100% EtOH (etanol) og tilsett DDH 2 O opp til 10 ml for å resultere i 15% (0,25 mM) og en 23% (0,39 mM) arbeidsløsninger.
  3. Hold stamløsninger ved -20 ° C og arbeids løsninger ved 4 ° C; bruk innenfor en uke.
  4. Fyll opp til 10 kapillarer samtidig med en farget mat oppløsning, av kapillærkraft. Sett endene av kapillærene inn i det sukrose-løsning (som holder kapillarene i 45 ° vinkel til oppløsningen). Stopp hvis væsken når toppen (5 mL) mark av kapillært, og fjerne overflødig løsning på utsiden og innsiden med silkepapir.

4. Montering og gjennomføring av kapillær mater analysen

  1. Hvis fasting ikke er nødvendig, overføre eksperimentelle fluer til analysen ved å peke eller blow-rør. Sørg for å ta tre kontroll ampuller uten fluer å kvantifisere fordampning.
  2. Fjern forsiktig en pipettespiss ut (2 - 20 ul volum) som avsluttes av en av de ytre openings, og sette inn en fylt glass kapillær, bunn-enden først. Fest kapillær ved å plassere pipettespissen tilbake ved siden av kapillær. Hvis flere mat-løsninger blir testet, gjenta denne prosedyren deretter.
  3. Plasser den kapillære ender på innsiden av alle ampuller på samme nivå for å unngå skjevhet som kan oppstå hvis maten kilder ble lokalisert ved forskjellige høyder (3 - 4 cm fra lokket); holde avstand til filterpapiret for å hindre at kapillær fra å lekke ved et uhell berører filterpapiret eller forskjellige viskositeter næringskilder.
  4. Merk den øvre enden av den fargede væske ved hjelp av en tusj (mark begynnelsen). For å sikre de ulike kapillærene kan identifiseres, merke dem individuelt ved hjelp av en farge eller stripe kode.
  5. Plassere flere forberedt CAFE analyser inne i en plastboks med gitter innlegg og overføre boksen (figur 2A) til en sikker posisjon under laboratorieforhold eller i en temperatur, lys- og fuktighetskontrollerte climspiste kammer (parametere: 25 ° C, 60% relativ fuktighet, 12 h / 12 timers lys-mørke-syklus) i hele forsøksperioden (for eksempel 3 timer eller dager).
  6. Som nederste filterpapiret tørker ut om analysen blir utført i løpet av flere dager, anvende friskt vann hver 24 h via svampen propp (100 pl) for å holde luftfuktigheten konstant inne i analysen. Bruk fire separate hetteglass (8 cm høyde, 3,3 cm diameter) fylt med 30 ml DDH 2 O som fuktighet enheter og plassere dem ved siden av kafeen analyser i plastboks. Bruk et dekke for plastboks for å skape fuktighet kontrollert miljø under forsøket (figur 2A).
    MERK: Bredere variasjon oppstår under laboratorieforhold; Det er imidlertid mulig å utføre analysen CAFE ved værelsestemperatur (f.eks., i et klasserom). Bruken av en fukting enhet (filter papir, med eller uten en våt svamp bung, fylt vann ampuller og dekning for plastboks) er sterkt oppfordret til å redusere fordampning (
  7. Skift kapillærer med ferske fylte seg for langsiktige eksperimenter hver 24 time. Noter døde fluer før hver 24 timers intervall og bruke antall levende fluer å beregne forbruket per fly for neste periode. Kast de gamle kapillærene etter å måle nedgangen i menisken (se 5.1).
    MERK: Under en tre timers eksperiment vi neppe se noen døde fluer. I løpet av en 4 dager studie vi vanligvis finner 1 - 3 døde fluer.
  8. På slutten av analysen eller før du bytter kapillær, merker de lavere menisken av kapillær (mark slutten) med en tusj mens CAFE analysen er fortsatt i oppreist stilling. Kast data dersom mark slutt er ikke under den første mark (mark begynnelsen). Ikke fjern lokket, da dette kan endre seg menisken.
  9. Fjern forsiktig kapillærene fra analysen og lagre dem for datainnsamling. Sjekk om væsken inne i kapillært nådd den nedre ende hvis ikke discard dataene, som mat var ikke tilgjengelig for fluene. Samle alle kapillærer per hetteglass som en gruppe. Sett uncut pipettespisser i alle åpninger for å hindre at fluer fra å rømme. Demonter oppsett og vaske flasker, lokk og svamp spunser i en såpe bad og tørke over natten i romtemperatur for videre bruk.
    MERK: Fluer kan bli ytterligere analysert etter analysen. Bekreft mat opptak av, eller under en disseksjon mikroskop.
  10. Gjentatte eksperimenter med de samme genotype på minst tre forskjellige dager.

5. Datainnsamling og analyse

  1. Mål avstanden mellom mark begynnelsen og mark slutt på kapillær ved hjelp av en skyvelære eller en linjal. For å overføre data direkte til et regneark, kan du bruke en USB (Universal Serial Bus) tilkoblet digital caliper (figur 1E). Kast kapillærene etter målingen.
  2. Konto for kapillær størrelse for å beregne mat opptak eller fordampning. For eksempel vurdere en capIllary som er 73 mm lang og inneholder 5 ul av mat oppløsning. En 14,6 mm reduksjon i menisken reflekterer opptaket av 1 ul oppløsning. Beregn mat opptak ved hjelp av følgende formel:
    Mat opptak (mL) = målt avstand (mm) / 14,6 mm
  3. For å utelukke effekten av fordampning av matinntak, beregne mener fordamping i tre (minst) kontrollhetteglass uten fluer. Trekk fra denne gjennomsnittsverdien fra oppnådd for mat forbruk av fluene verdi.
  4. Bruk følgende formel for å bestemme totalt forbruk per fly:
    Matforbruk (mL) = (Food opptak [ul] - fordamping tap [ul]) / totalt antall fluer i hetteglasset. For langsiktig eksperimenter bruke antall fluer i live før starten av 24-timers intervall.
  5. For å ta hensyn til forskjeller i kroppsstørrelse, for eksempel mellom mannlige og kvinnelige fluer, normal matforbruk til kroppsvekt (mL mat / mg fly).
  6. Bruke statistisk programvare for dataanalyse. for normalliert distribuerte data, bruk studentens T -UNDERSØKELSER å bestemme forskjellene mellom to fly grupper, og bruke ANOVA (variansanalyse) med legg hoc Tukey Cramer tester for mer enn to grupper. I en valgsituasjonen, analysere forskjeller fra tilfeldig valg ved hjelp av en parametrisk one-sample tegn test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluer w 1118 genotype anvendes for å demonstrere hvordan analysen er utført. De w 1118 mutantene blir ofte brukt til å generere transgene linjer, og for å styre den genetiske bakgrunn av transgener som er merket med hvit-genet. Normalt, for atferdsmessige eksperimenter, blir alle transgene linjer backcrossed i fem generasjoner til den samme w 1118 lager, som brukes som en eksperimentell kontroll. Vi viser forskjellige eksperimenter: en sammenligning av fordampning tap for vår modifisert oppsett, en kortsiktig mat valg eksperiment, en langsiktig matinntak eksperiment, og et eksperiment på forskjellige sukrose fortynninger.

Fordampning spiller en avgjørende rolle i utførelsen av CAFE analysen. Vi inkluderte flere innfallsvinkler til vår analyse for å redusere fordampning: i) den sentrale svamp proppen fylles med vann hver 24 timer; ii) Addielle vannfylte ampuller innenfor transportkassen og iii) bruk av et dekke for boksen for å skape en luftfuktighet kabinett (se 4.6). Sammenligning av fordampningen mellom et oppsett uten og med ovennevnte anordninger, er en betydelig reduksjon i fordampningen sett. Selv effekten av høyere volatilitet i en etanolholdig oppløsning ikke kan oppdages ved hjelp av det nye oppsettet.

I en to-valg mat eksperiment en gruppe på 20 fluer kan mate i 3 timer. I naturlige omgivelser, frukt fluer mate fortrinnsvis på fermen frukt med alkohol 22, og det har vist seg, ved hjelp av et lignende oppsett, som fluer foretrekker gjær-sukrose løsninger med etanol i løpet av gjær-sukrose løsninger uten etanol 23. Her er to valg av mat tilbys, en 0,1 M sukrose løsning merket med rød konditorfarge og en 0,1 M sukrose løsning med 15% EtOH merket med blå mat farge (figur 1A, C). Visual examinering av buken indikerer at fluene lever av begge løsningene (figur 1D). Matforbruk pr flue er betydelig større (nesten to ganger) for sukroseløsning innehold EtOH (figur 3A).

I et følgende eksperiment, en langtidsstudie, har en gruppe på åtte fluer tilgang til tilsvarende mat kilder for 4 dager, og fluer konsumere mer av etanolholdig mat på hver dag (figur 3B). Preferansen Indeksen for etanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / totalt forbruk) forblir konstant i løpet av denne perioden (gjennomsnitt = 0,29, tabell 4). Den observerte etanol preferanse er konsistent med flere andre publikasjoner og viser at fluer kan skille mellom ulike matkilder 24, 25, 26. Den observerte etanol tiltrekning kan være et resultat av de forskjellige kalori innholdet ide tilbudte løsninger og de givende egenskaper av etanol 24. Målingen kan også brukes til å måle negative effekter av kosttilskudd. Ja og kolleger viste i den første utgivelsen av denne metoden som anvendelsen av paraquat (en oksiderende stoff) reduseres matforbruk 10.

I det neste forsøk, er vist forskjellen i matinntaket mellom kjønnene. Metabolske kravene varierer mellom mannlige og kvinnelige D. melanogaster. For eksempel, mens mannlige fluer foretrekker karbohydrater-rik mat, under eggproduksjon, en fase som krever økt proteinsyntese, kvinner foretrekker proteinrike dietter i løpet av karbohydratrike dietter 27. Sammensatte hun- og fluer ble anvendt i dette eksperimentet. For å analysere forskjeller i matinntak mellom 20 mannlige og 20 kvinnelige fluer i en 3 h fôring intervall, er en kafé analyse utført ved hjelp av en sukrose concentrasjon serien. Fem kapillærene ble gitt, med oppløsninger som strekker seg 10-3 til 2 m sukrose, og forbruket av hver løsning ble målt (figur 4A). Resultatene viste at begge kjønn foretrukket høy konsentrasjon sukrose løsninger som matkilde (figur 4A). Imidlertid hunner forbrukes betydelig mer av de to laveste konsentrasjoner av sukrose-løsninger enn hos menn (p <0,05); på den annen side, hanner forbrukes betydelig mer av de høyere konsentrasjons løsninger (p <0,001). Merk at disse dataene ikke ta hensyn til forskjeller i kroppsstørrelse. Kvinne D. melanogaster er vanligvis større og tyngre enn menn (tabell 1). Når matforbruk er normalisert til fly masse, forskjeller mellom menn og kvinner i forbruk av lav-sukrose-løsninger ikke lenger er av betydning. I sammendraget, menn bruker mer sukrose løsning enn parret kvinner, i samsvar med tidligere data, reflecting mulige forskjellige metabolske krav, næringspreferanser eller enkle forskjeller i evnen til å mate på kapillærene mellom de to kjønnene.

Figur 1
Figur 1: Drosophila melanogaster kapillær mater analysen. A) Den fôring analysen med fluer. Fuktet filterpapir gir vann på bunnen av ampullen. Fire kapillærer er gitt under forsøket (røde og blå-farget mat i motsatt kapillærer). Legg merke til at kapillarene er sikret i stilling ved hjelp av en andre pipettespissen, og ubrukte posisjoner er lukket ved hjelp av pipettespissene. En skum plugg i midten av lokket gjør at luftgjennomgang. B) Detaljert visning av lokket. Cut pipetter (2-20 ul, røde grenser) er satt inn i de koniske åpninger av ubrukte posisjoner, og en andre pipette spiss er innsatt i snitt spiss for å lukke hullet. De kuttet pipettespisser brukes til å kontrollere plassering av mikrokapil, og uklippet tips brukes til å holde kapillærene stramme. C) En D. melanogaster flue feeds på en kapillær. D) Etter fôring, er mat farge godt synlig i fly magen. E) En digital caliper blir brukt til å måle avstanden mellom merket begynnelse og markerer slutten av menisken. Dataene overføres direkte til et Excel-regneark via USB. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Effekt av Inndampning i Capillary Feeder-analysen. A) Multiple CAFE analysen plassert inneen plastboks med et gitter innlegg. For regulering av fuktigheten i løpet av eksperiment fire vannfylte ampuller (red felger) er plassert inne i rutenettet. Fordampningen kontrollene er plassert i umiddelbar nærhet til disse ampullene. Et deksel for hele oppsettet er vist i bakgrunnen. B) Sammenligning av volumet tap ved fordampning. Den midlere verdi for fordampning over 4 dager er vist. Fuktighet blir styrt ved (i) påføring av vann til den sentrale svampen propp (24 timers intervall); (Ii) tilsetning av fire vannfylte ampuller inn i gitteret; og (iii) ved hjelp av et plastdeksel for hele oppsettet. Fordampningen er vesentlig lavere dersom fuktigheten er kontrollert for begge løsninger som ble testet (*** P ≤ 0,001; N = 48). Ingen forskjeller i flyktighet mellom EtOH inneholdende og ikke inneholdende sukrose oppløsning kan detekteres med fuktigheten enheter som brukes. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.

Figur 3
Figur 3: preferanse for Etanol (EtOH) inneholder sukrose løpet Sukrose Solution. A) Mat forbruk for mannlige w 1118 fluer vises. Hanner forbruker betydelig mer av en 15% EtOH inneholdende sukrose oppløsning enn i en vanlig sukroseløsning. *** P ≤ 0,001; N = 27. b) Flies betydelig foretrekker en sukrose løsning som inneholder 23% EtOH under en 4-dagers prøveversjon. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Consumption (mL / fly og mL / mg fly) av ulike Sukrose Konsentrasjoner av mannlige og kvinnelige w 1118 fluer. A) Forbruket av forskjellige konsentrasjoner av sukrose-løsninger varierer sterkt mellom menn og kvinner. Kvinnelige fluer forbruke mer ved lavere sukrose konsentrasjoner, og mannlige fluer forbruke mer ved høyere konsentrasjoner. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 studier med 20 menn hver, N = 30 studier med 20 kvinner hver). B) Mat opptak på en massebasis. En betydelig økning i forbruket oppstår mellom mannlige og kvinnelige fluer for 0,1 til 2 M sukrose løsninger når normalisert å fly masse. *** P ≤ 0,001; N = 27 hanner, N = 30 kvinner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Kroppsvekt av mannlige og kvinnelige w 1118 fluer. Fire til fem grupper på 100 fluer ble målt, og kroppsvekt (mg / flue) ble beregnet. Middelverdier (med STDEV (standardavvik) og STERROR (standardfeil)) er vist. Middelverdier blir brukt til å normalisere matforbruk å fly masse (ul / mg fly). Klikk her for å laste ned dette regnearket.

Tabell 2
Tabell 2: Fordampning Loss (pl) i CAFE analysen. Mengden av væske tapt gjennom fordampning er vist i 4 dager. Fuktighet er kontrollert (+) eller ingent (-) som beskrevet i figur 2. Fordampning data for to forskjellige løsninger (sukrose og sukrose pluss EtOH) er vist. Middelverdier presenteres for hver dag, og i løpet av perioden (med STDEV og STERROR). Fordampningen tap av sukrose fortynninger eksperimentet er vist under separat (middelverdier). Klikk her for å laste ned dette regnearket.

Tabell 3
Tabell 3: Forbruk av 0,1 M sukrose med / uten 15% EtOH ved Mann w 1118 Fluer Fed i 3 timer. Forbruket av begge løsninger ved grupper på 20 fluer ble målt i 3 timer på 3 dager. Forbruksverdier for flue gruppene er delt på antall testede fluer å anslå mikroliter opptak per fly etter trekke fordamping tap. Gjennomsnittsverdier (med STDEV og STERROR) vises. Klikk her for å laste ned dette regnearket.

Tabell 4
Tabell 4: Forbruk av 0,1 M Sukrose med og uten 23% EtOH for fire dager etter Mann w 1118 fluer. Forbruk av begge løsninger ved grupper på 8 fluer ble målt i 24 timer i 4 dager. Preference indeks for etanol ble beregnet ved hjelp av følgende formel ([Suc + EtOH] - [Suc] / totalt forbruk). Forbruksverdier for flue gruppene er delt på antall testede fluer å anslå mL opptak per fly etter trekke fordamping tap. Middelverdier (med STDEV og STERROR) er vist for hver dag..jove.com / filer / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned dette regnearket.

Tabell 5
Tabell 5: Forbruk av fem konsentrasjoner av sukrose av mannlige og kvinnelige w 1118 fluer. Inntaket av hver løsning, og verdien for summen av sukroseinntakene, er vist. Gjennomsnittsverdiene for hver konsentrasjon er gitt nedenfor hver søyle (med STDEV og STERROR). For å beregne inntaket basert på utlegger masse (mikroliter opptak per milligram av fly), er matforbruket dividert med gjennomsnittlig vekt på mannlige eller kvinnelige fluer (fra tabell 1, er vist til høyre). Klikk her for å laste ned dette regnearket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapporten beskriver CAFE analysen i en steg-for-steg måte, med fokus på det tekniske oppsettet og sin vellykkede resultater i laboratoriet. På grunn av sin enkelhet, kan dette assay også kan brukes pedagogisk som en skole eksperiment. Eksemplene viser at analysen tillater undersøkelse av mat sensing, preferanse og forbruk i Drosophila melanogaster over korte og lengre tidsperioder (timer eller dager). Kafeen analysen har blitt brukt mye i feltet for å undersøke emner, inkludert mat og narkotikabruk, avhengighet, energi homeostase og neuronal kontroll over fôring 16, 18, 24, 25.

I CAFE analysen, må eksperimentelle fluer kunne utføre flere oppgaver for å skaffe mat, for eksempel beite, sensing og bevegelse; manglende evne til å utføre disse oppgavene kan føre til redusert forbruk. Tilaldring oppførsel avhenger i hovedsak av sult tilstand av fluer og kan økes ved å faste 19, 21. Sensing, og derved lokalisering av matkilde kan påvirkes ved evnen av flue til lukt eller smak, og kan indirekte føre til et lavere forbruk hastighet 28. Visningen av mat på slutten av en kapillær tvinger fly til å klatre ned og aktivt holder seg i en opp-ned posisjon til å mate. Å holde drikke posisjon på kapillært, må fly koordinere sin muskel sammentrekning. Nedskrivning eller hyperaktivitet av locomotion klart vil påvirke fødeopptak, som gjør locomotion mangler på grunn av aldring. I tillegg innblanding av andre fluer ved denne manøveren fører til for tidlig avslutning av matinntak. Derfor bør antallet fluer som skal brukes bestemmes før forsøket. Dette tallet bør sikre at alle fluer kan mate riktig og bør kontrollere for fly densitet i hetteglass (fra 8 opp til et maksimum på 20 fluer i vårt D. melanogaster CAFE assay hetteglass). Fôring er påvirket av den ernæringsmessige verdien av måltidet, og flyr dynamisk justere sitt inntak tilsvarende 24, 29. Det ble vist at mutanter som mangler signalstoffet oktopamin har normale PER responspoengsummer, men på samme tid viser en betydelig reduksjon i matinntak 14. Videre under fôring, motivasjon til å fortsette å spise avtar og fører til oppsigelse av atferd.

De ovennevnte betraktninger gjelder ikke bare til CAFE analysen, innflytelse de fôring atferd målt i andre testsystemer også. Derfor må den evne fluer for å utføre analysen, tas i betraktning ved måling av matinntak. Selv om det ikke er teknisk utfordrende, har CAFE analysen noen potensielle praktiske ulemper. Nedgangen av meniskeninne i kapillært avhenger av fordampning tap og matinntak ved fluene. Høy fordampning er problematisk når det gjelder signal til støyforhold og bør derfor reduseres til et minimum. Vi har anvendt flere andre fremgangsmåter og anordninger for å styre fuktigheten i løpet av forsøksperioden (se 4.6). Dette tilbehøret har hjulpet oss til å redusere fordampning betydelig og selv elimineres effekten av ulik volatilitet av mat kilder vi brukte. Ikke desto mindre, hvis ingen klimakammeret er tilgjengelig analysen kan utføres ved romtemperatur (for eksempel i et klasserom) med høyere fordampning verdier som en ulempe.

Som nevnt i protokollen, endene av kapillærene trenger å være plassert på samme nivå inne i ampullen for å unngå skjevhet i flue valg på grunn av forskjellige avstander til matkilde. For å oppnå dette er den kapillære posisjon fiksert med en andre pipettespiss. Lengden av kapillaren synes ikke å være et kriterium for foring i villtypen flyr 10. Eventuelt spill av væsken kan undergrave nøyaktig avlesning av mat forbruk (se 4.3 og 4.9); et vibrasjonsfritt miljø hindrer søl. Partikler i oppløsningen blokken kapillær strømning og forhindre matforbruk. Mat oppløsning, spesielt hvis den inneholder gjær, må være fullstendig oppløst for å unngå en slik blokkering. Anvendelsen av vannløselige gjærekstrakt kan overvinne dette problem, men som en ufullstendig næringskilde, kan det føre til ytterligere trenings kostnader. Mat tilgjengelighet må evalueres før og etter forsøket. Den eneste fly data som skal inkluderes i analysen er den som oppnås hvor tilgang til mat var til stede under hele forsøket (se 4.9). Den opp-ned foringsstilling er en kritisk funksjon av forsøket. Under naturlige forhold, er dette fôring posisjon ikke ukjent for fly, som frukt henger ned fra trærne, og de kan klatre ned en råtten frukt. Dette støttes av eksperimenter Comparing måltid størrelser av fluer fôring i en opp-ned posisjon i CAFE analyse for å (i) en horisontal spise stilling immobilisert fluer i mafe analysen og (ii) en høyre-side-up mate posisjon ved hjelp av radiomerket mat 13, 21 . Selv om opp-ned mat displayet ikke ut til å være et problem for de flyr, kan det påvirke sammensetningen av maten inne i kapillært. Suspenderte kosttilskudd som gjærceller kunne synke via tyngdekraften til bunnen av kapillaren og derfor kan være mer konsentrert på bunnen eller kan koble kapillaren. Dette ville påvirke fly oppførsel og dermed resultatene. Sikre at komponentene i mateløsning er helt oppløst, og ofte introdusere nye kapillærer under langvarige eksperimenter, minimerer dette påvirker matinntaket.

Bruken av CAFE analysen beskrevet her tillater måling av matinntaket i en flue gruppe over tid spenner fratimer eller dager. Dersom det kreves mer detaljerte analyser (f.eks., Oppførselen til en enkel flue eller oppførsel i størrelsesorden minutter), andre mate analyser, slik som mafe analysen, er mer hensiktsmessig. Det kan være mulig for antallet fluer som skal reduseres ytterligere ved hjelp av et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og en enkelt kapillær 30.

Antallet forsøk som brukes for å oppnå de representative resultater varierer fra 15 til 27, i overensstemmelse med forsøk beskrevet i litteraturen, 17, 24. Analysen kan utføres i en klassisk blind måte som utelukker mulig skjevhet fra experimenter, og det er vanligvis gjentas minst fire til fem ganger på hver av flere dager. Data innhentet med CAFE analysen kan normalisert til kroppsvekt for å ta hensyn til forskjeller i fôring atferd relatert til kroppsstørrelse. Resultatene oppnådd med dette assay resultatene er robuste og reproduserbare, slik at denhar blitt introdusert med hell i praktiske kurs for hovedfagsstudenter.

Kafeen analysen er mye brukt innen metabolske og smak forskning i Drosophila melanogaster; den har flere anvendelser i testing rollen som kosttilskudd og / eller legemidler på mating oppførsel, og den kan brukes til å undersøke responsen dose til en bestemt matkilde 24. I kombinasjon med den bemerkelsesverdige forskjellige teknikker som brukes til å manipulere neuronal kretsene i D. melanogaster, gjør denne analysen også forskere å undersøke rollen til armeringssystem i mating oppførsel 12, 17, 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3, (4), 244-250 (2002).
  2. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
  3. PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
  4. Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
  5. Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
  6. Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
  7. Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65, (2), 132-137 (2009).
  8. Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
  9. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
  10. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (20), 8253-8256 (2007).
  11. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
  12. Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
  13. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11, (5), 535-540 (2014).
  14. Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
  15. Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
  16. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4, (6), e6063 (2009).
  17. Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
  18. Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
  19. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9, (6), e101107 (2014).
  20. Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
  21. Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
  22. Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12, (7), 609-612 (2015).
  23. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
  24. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19, (24), 2126-2132 (2009).
  25. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (7), 2498-2503 (2008).
  26. Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36, (11), 1903-1912 (2012).
  27. Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20, (11), 1006-1011 (2010).
  28. Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, (33), 14833-14838 (2010).
  29. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  30. Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9, (6), e99732 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics