Kapillären Feeder analysen mäter matkonsumtionen i

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Äta är viktigt; Men kostar avreglering av födointag leder till ätstörningar, såsom bulimi, anorexi eller den allmänna tendensen att äta för mycket ålägger på individen och samhället en, två, tre. Målet med föreliggande forskning är att avslöja regler hos födointag och att tillhandahålla en metod för att kringgå störning bildning. Ett stort antal studier som använder däggdjursmodellorganismer har gett nya insikter i kretsen och den roll som signalsystem i ätstörningar 4, 5, 6. Ändå vår kunskap om neuronala och molekylära grunderna bakom dessa sjukdomar är långt ifrån komplett. Under de senaste åren, bananflugan Drosophila melanogaster har blivit ett värdefullt modellsystem för att reda ut grundläggande mekanistiska insikter i regleringen av metabolism 7, 8, 9. Den kapillära Feeder (CAFE) analys för Drosophila melanogaster ades i labbet av Seymour Benzer 2007 inspirerad av ett tidigare arbete av Dethier i spyfluga 10, 11. CAFE-analysen gjort det möjligt att direkt mäta födointaget i Drosophila melanogaster. I detta beteende testsystem, flugor foder på flytande livsmedel som tillhandahålls i graderade glas kapillärer placerade inuti en flaska. Nedgången i den kapillära menisken indikerar förlust av mat lösning genom avdunstning och livsmedelskonsumtion. Bestämning avdunstningshastigheten från injektionsflaskor utan flugor medger noggrann kvantifiering av födointag.

CAFE-analysen är ett av flera beteendeparadigm som används för att mäta utfodring i Drosophila melanogaster och forskare måste välja den mest lämpliga för deras specifikafråga. Beslutet att använda en viss analys bör överväga följande punkter: den typ av livsmedel som tillhandahålls; matnings tillstånd; mätningen av intag eller upptag av näringsämnen och utredning livsmedelskonsumtion eller svar till mat.

CAFE-analysen som beskrivs i denna rapport är idealisk för att följa födointag av en flytande föda under en upprätt matnings tillstånd. Alternativt födointaget kan mätas för en fluga grupp på en färgad näringskälla i en injektionsflaska eller på en skylt. Flugor är normalt dödas eller bedövades efter matning och mängden av intagen färgämne bestäms genom spektrometri eller visuell inspektion av det färgade buken. Flugor börjar utsöndra den intagna maten endast 30 minuter efter intag, denna metod är därför svårt att använda för analys av kontinuerliga längre utfodring beteenden 12, 13.

I motsats flugor hålls intakt när absorber färgämnes med radioaktiva spårämnen används och deras konsumtion av radioisotop görs i en scintillationsräknare 14, 15. Absorption av den radioaktiva märkningen av flugan matsmältningssystemet gör långsiktiga livsmedelsupptag mätning möjligt, men kan leda till en underskattning av konsumtion på grund av icke-absorberade och utsöndrade spårmolekyler. Ett annat sätt att mäta svar på mat i Drosophila melanogaster är snabel förlängningen svar (PER), vilket normalt inträffar för födointag 16. Denna eleganta metod mäter det första svaret på en livsmedels stimulans men inte redovisar mängden intaget. Födointag dynamiskt justeras under matning med hjälp av flera efter matsmältningsåterkopplingssignaler som är kritiska för reglering av matningen 17, 18. Flera försök har gjorts under de senaste åren till samling halv automatisera uppgifter i PER-analysen 19, 20. PER detekteras av en elektrisk dyna eller en kombination av elektroder och räknades via dator. Kombinera per analys med radioisotopupptaget visade att denna analys begränsas av låg känslighet för detektering av mängden utfodring skillnader 18. Den manuella matningsanalys (Mafe) 21, i vilken en fluga matas manuellt med en glaskapillär, har nyligen utvecklats för att mäta mat upptag i en enda immobiliserade fluga. Den Mafe analysen eliminerar interferens av födosök och utfodring initiering och har en tidsupplösning av några sekunder, och initiering av PER och matkonsumtion kan övervakas oberoende i analysen. Men det sätt på vilket immobilisering av flugan påverkar vissa aspekter av ätbeteende (t.ex. förflyttning, motivation) måste fortfarande utredas. För utmärkta jämförande recensioner av olika analyser för att mäta livsmedelskonsumtion i Drosophila melanogaster och för att hjälpa forskare att hitta den mest lämpliga, se rapporter från Deshpande och Marx 13, 22.

CAFE assay undviker en del av nackdelarna med andra analyser beskrivna ovan och kombinerar enkelhet i användning med tillförlitlig mätning av födointag. Här är en detaljerad beskrivning av CAFE-analysen tillhandahålls och vi visar en enkel installation modifiering för att minska avdunstningen. Representativa resultat, inklusive en två livsmedels val analys (kort och lång sikt) och sackaros upptaget av flugor demonstreras. I diskussionen jämföra vi vår beskrivna metoden med alternativa sätt att utföra CAFE analysen och markera eventuella begränsningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CAFE-analys

OBS: Analysen består av tre delar: en experimentell injektionsflaska, en specifik lock och mikro kapillärer. En plastlåda med lock används för att transportera de preparerade ampuller och för att styra fuktigheten mer effektivt.

  1. Använda en Drosophila melanogaster odlingsplastampull (valfritt 8 cm höjd, 3,3 cm i diameter) som ett rör för analysen.
  2. Försegla flaskan med en tillverkad plexiglaslock innehållande en O-ring (figurerna 1A, 1B). Belastning flyger genom att knacka eller med en blåsröret genom lockets centrala öppning (0,9 cm diameter), som också gör det möjligt för luftcirkulation och vattenförsörjning, och stänga hålet med en svamp propp. Sex mindre koniska öppningar (0,4 cm övre diameter, 0,3 cm inre diameter) omger det centrala hålet och montera pipettspetsar av 2-20 mikroliter volym för att hålla kapillärerna på plats. (Se kompletterande siffror för tekniska detaljer i locket.)
    ANMÄRKNING: Användningav en svamp propp med öppningar för kapillärerna istället för skräddarsydda lock används i vårt manuskript är möjlig. Vår skräddarsydda lock möjliggör säker hantering av de preparerade flaskor minimerar risken för kapillärer falla ner.
  3. Att presentera flytande livsmedel, använder 5 mikroliter mikrokapillärer med 1 mikroliter märken. Placera kapillärerna i den koniska öppningar i locket genom att skära av toppen av en 2-20 mikroliter pipettspets och sticka in spetsen i hålet (Figur 1B, märkt med röd kant). För att förhindra att flugor från att fly, sätta en oklippt 2-20 mikroliter pipettspetsen i samma öppning.
  4. För att på ett säkert sätt hantera flera förberedda flaskor, placera dem i en plastlåda med en inrutade inlägg (figur 2A).

2. Beredning av flugor

  1. Håll flugor på vanliga livsmedel vid 25 ° C, 60% relativ fuktighet och en 12 h / 12 h ljus-mörker-cykel.
  2. För att kontrollera uppfödningsförhållanden, införa 35 jungfru honor end 15 hanar för varje försöksgrupp i en plastodlingsflaska (9,8 cm höjd, 4,8 cm i diameter) som innehåller 50 ml flyga mat. Låt flugor för att lägga ägg under de 3 första dagarna, sedan överföra vuxna flyger till färska livsmedel flaskor och låta dem lägga ägg under två dagar. Efter detta upprepa överföringen igen. Släng vuxna flugor efter 2 dagar.
  3. Som födointag är beroende av farten storlek, fastställa vikten av en grupp av 100 flugor genom anestetisering 2- till 3-dagar gamla vuxna flugor med hjälp av en CO 2 fluga pad och samla dem i en 1,5 ml plaströr och mätning med en standard laboratorieskala. Bestämma våtvikt av minst fyra oberoende gylf grupper sorterade efter kön (tabell 1); Använd vikt för att beräkna mikroliter livsmedelskonsumtion per mg fluga. Använda värdet för att bestämma mängden mat som en enda fluga flöden per experiment och justera antalet livsmedelsfyllda kapillärer i enlighet med att undvika tömning av kapillärerna genom att mata.
    1. För en 3 h-analys, användning20 flugor och två fyllda kapillärer. För en långsiktig experiment (> 3 timmar och upp till 9 dagar), använd en grupp av åtta flugor med en leverans av fyra fyllda kapillärer (tillförlitliga resultat kan inte uppnås med mindre än åtta flugor under de beskrivna förhållanden).
  4. Separata flugor i grupper (8 eller 20 flugor) efter vägning under CO 2 exponering. Överför gruppen till en ny flaska mat (som innehåller 15 ml vanliga livsmedel) för att tillåta återhämtning från CO2 sedering under 48 h före experimentet. Använd 4 till 6 dagar gamla flugor för CAFE-analysen.
  5. Som vildtyp flugor icke svalt foder endast marginellt 19, flyger 21, pre-svälta för 3 h utfodringsexperiment. Ingen fasta krävs när livsmedelskonsumtion övervakas under flera dagar. För fasta, flugor överföring 16 till 20 timmar före testning genom att försiktigt knacka in dem i en flaska innehållande endast en 45-mm diameter vikta filterpapper fuktat med ~ 0,5 ml DDH2 O (dubbeldestillerat vatten), och nära med en ansluten CAFE analys lock.

3. Framställning av flytande livsmedel

  1. Förbered en 3 M (10%, vikt / volym) sackaros stamlösning genom att fylla 102,6 g sackaros (C 12 H 22 O 11) till 100 ml DDH 2 O. pipett 3 mikroliter, 33 mikroliter, 333 mikroliter, 3,3 ml och 6,6 ml av stamlösningen i en 15 ml plaströr; tillsätt 2 ml av livsmedel färg (för rött: Cochineal [E124]; för blått: Indigokarmin [E132]) och fyll till 10 ml med DDH 2 O. De resulterande koncentrationerna är 0,001, 0,01, 0,1, 1, och 2 M sackaros .
    OBS: maten färgämnet tillåter att visualisera menisken lättare. Emellertid färgämnet kan ha en inverkan på födointaget. För att undvika en bias på grund av att färgämnet fördela maten färgämnet eller randomiserad användningen av färgämnen till livsmedelsprover under experimentet och grupper.
  2. Till testet för alkoholpreferens pipett 333 mikroliter av 3 M sackaros stamlösning i ett 15 ml plaströr.Tillsätt 1,5 ml (2,3 ml) av 100% EtOH (etanol) och tillsätt DDH 2 O upp till 10 ml för att resultera i 15% (0,25 mM) och en 23% (0,39 mM) arbetslösningar.
  3. Föra lagerlösningar vid -20 ° C och arbetslösningar vid 4 ° C; användas inom en vecka.
  4. Fyll upp till 10 kapillärer samtidigt med en färgad livsmedels lösning, genom kapillärkraft. Sätt ändarna av kapillärerna i sackaroslösning (håller kapillärerna vid en 45 ° vinkel till lösningen). Stoppa om vätskan når toppen (5 mikroliter) märke kapillär, och ta bort överflödig lösning på utsidan och insidan med silkespapper.

4. Montering och utföra de kapillära Feeder analys

  1. Om inte behövs fasta, överföra de experimentella flugor till analysen genom att knacka eller blåsröret. Se till att inkludera tre kontrollflaskorna utan flugor att kvantifiera avdunstning.
  2. Försiktigt bort en pipettspets (2-20 mikroliter volym) som avslutas ett av ytter openings, och infoga en fylld glaskapillär, bottom-änden först. Säkra kapillären genom att placera pipettspetsen tillbaka bredvid kapillären. Om flera matlösningar testas, upprepa proceduren i enlighet därmed.
  3. Placera kapillär slutar i alla flaskor på samma nivå för att undvika en snedvridning som skulle kunna inträffa om matkällor var belägna på olika höjder (3 - 4 cm från locket); hålla ett avstånd till filterpapper för att förhindra kapillär från att läcka genom att av misstag vidröra filterpapper eller olika viskositeter av matkällor.
  4. Märk den övre änden av den färgade vätskan med hjälp av en märkpenna (märke början). För att säkerställa de olika kapillärerna kan identifieras, märka dem individuellt med hjälp av en färg eller rand kod.
  5. Placera flera beredda CAFE analyser i en plastlåda med inrutade inlägg och överföra lådan (Figur 2A) till en säker position under laboratorieförhållanden eller i en temperatur-, ljus- och fuktkontrollerade climåt kammar (parametrar: 25 ° C, 60% relativ fuktighet, 12 h / 12 h ljus-mörker-cykel) för försöksperioden (t.ex. 3 timmar eller dagar).
  6. Som undre filterpapper torkar ut, om analysen utförs under flera dagar, tillämpa färskvatten var 24 h via svampen propp (100 | il) för att hålla fuktigheten konstant inuti analysen. Använd fyra separata ampuller (8 cm höjd, 3,3 cm i diameter) fyllda med 30 ml DDH 2 O som fukt enheter och placera dem bredvid CAFE analyser i plastlåda. Använd en täckmantel för plastlåda för att skapa fuktighet kontrollerad miljö under försöket (figur 2A).
    OBS: Bredare variationen sker under laboratorieförhållanden; emellertid är det möjligt att utföra CAFE analysen vid rumstemperatur (t ex., i ett klassrum). Användningen av en befuktning enhet (filterpapper, med eller utan en våt svamp propp, fylld vattenflaskor och lock för plastlådan) är mycket uppmuntras att minska avdunstningen (
  7. Byt kapillärerna med färskt fyllda dem för långtidsförsök varje 24 h. Anteckna döda flugor före varje 24 h intervall och använda antalet levande flugor för att beräkna förbrukningen per fluga för den följande perioden. Kasta de gamla kapillärerna efter mätning av minskningen av menisken (se 5.1).
    OBS: Under en tre timmar experiment vi knappast se några döda flugor. Under en 4-dagarsundersökningen vi brukar hitta 1 - 3 döda flugor.
  8. Vid slutet av analysen eller före byte av kapillären, markera de nedre menisk av kapillären (märket änden) med en markeringspenna medan CAFE analysen är fortfarande i upprätt läge. Kasta data om märket slutet är inte under den första märket (märke början). Ta inte bort locket, eftersom det kan ändra menisken.
  9. Försiktigt bort kapillärerna från analysen och lagra dem för datainsamling. Kontrollera om vätskan inuti kapillären nått den nedre änden om inte discard uppgifterna, eftersom maten var inte tillgänglig för flugorna. Samla alla kapillärer per flaska som en grupp. Sätt uncut pipettspetsar i alla öppningar för att förhindra flugor från att fly. Demon installationen och tvätta flaskor, lock och svamp tapp i en tvål bad och torka över natten vid rumstemperatur för vidare användning.
    OBS: Flugor kan analyseras ytterligare efter analysen. Bekräfta mat upptag av ögat eller under en dissektion mikroskop.
  10. Upprepade experiment med samma genotyper på åtminstone tre olika dagar.

5. Datainsamling och analys

  1. Mät avståndet mellan märket början och markering änden på kapillären med hjälp av ett skjutmått eller en linjal. För att överföra data direkt till ett kalkylprogram, använd en USB (Universal Serial Bus) är ansluten digital bromsok (figur 1E). Kasta kapillärerna efter mätningen.
  2. Konto för kapillär storlek för att beräkna mat upptag eller avdunstning. Betrakta exempelvis ett lockIllary som är 73 mm lång och innehåller 5 mikroliter av livsmedelslösning. En 14,6 mm minskning av menisken återspeglar upptaget av en mikroliter lösning. Beräkna mat upptag med hjälp av följande formel:
    Mat upptag (il) = uppmätt avstånd (mm) / 14,6 mm
  3. För att utesluta effekten av avdunstning på födointag, beräkna betyda avdunstning i tre (åtminstone) kontrollflaskorna utan flugor. Subtrahera detta medelvärde från det värde som erhölls för livsmedelskonsumtion av flugorna.
  4. Använd följande formel för att bestämma den totala konsumtionen per fluga:
    Livsmedelskonsumtion (il) = (Food upptag [il] - avdunstning [il]) / totalt antal flugor i flaskan. För långtidsförsök använda antalet flugor levande inför starten av 24 h intervall.
  5. För att ta hänsyn till skillnader i kroppsstorlek, såsom mellan manliga och kvinnliga flugor, normalisera livsmedelskonsumtion till kroppsvikten (il mat / mg fluga).
  6. Använda statistisk mjukvara för dataanalys. för normally fördelade data, användning av Students t -tests att bestämma skillnader mellan två gylf grupper, och använda ANOVA (variansanalys) med post hoc Tukey Cramer tester under mer än två grupper. I ett val situation, analysera skillnader från slumpmässigt val med användning av en icke parametrisk en-sampel teckentest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flugor av w 1118 genotyp används för att visa hur analysen utförs. W 1118 mutanter är allmänt använda för att generera transgena linjerna och för att styra den genetiska bakgrunden av transgener märkta med den vita genen. Normalt, för beteendeexperimenten, är alla transgena linjer återkorsas i fem generationer till samma w 1118 lager, som används som en experimentell kontroll. Vi visar olika experiment: en jämförelse av avdunstningsförlust för vår ändrade inställning, en kortsiktig matvalmöjlighet experiment, en långsiktig födointag experiment och ett experiment på olika sackaros utspädningar.

Avdunstning spelar en avgörande roll i utförandet av CAFE-analysen. Vi ingår ytterligare metoder för vår analys för att minska avdunstningen: i) den centrala svampen proppen fylls med vatten var 24 h; ii) Addinella vattenfylld flaskor inom transportlådan och iii) användning av en täckmantel för rutan för att skapa en fukt hölje (se 4.6). Jämförelse av avdunstning mellan en setup utan och med ovan nämnda apparat, är en betydande minskning av avdunstning sett. Även effekten av högre volatilitet av en etanolinnehållande lösning är inte upptäckas med den nya installationen.

I en två-val livsmedel experiment en grupp av 20 flugor kan foder under 3 timmar. I naturliga miljöer, fruktflugor matar företrädesvis på jäsa frukt med alkohol 22, och det har visat sig, med hjälp av en liknande inställning, att flugor föredrar jäst sackaros lösningar med etanol över jäst sackaros lösningar utan etanol 23. Här är två val av mat erbjuds, en 0,1 M sackaroslösning märkt med röd karamellfärg och en 0,1 M sackaroslösning med 15% EtOH märkt med blå livsmedelsfärg (Figur 1A, C). visuell examinering av buken indikerar att flugorna foder på båda lösningarna (figur 1D). Livsmedelskonsumtion per fluga är signifikant större (nästan 2-faldigt) för sackaroslösningen innehållande EtOH (figur 3A).

I en följande experiment, en långtidsstudie, en grupp av åtta flugor har tillgång till liknande matkällor i 4 dagar, och flugor konsumera mer av det etanolinnehållande mat varje dag (Figur 3B). Preferens index för etanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / totala förbrukningen) förblir konstant under denna period (genomsnitt = 0,29, tabell 4). Den observerade etanol föredrar överensstämmer med flera andra publikationer och visar att kan flugor skilja mellan olika födokällor 24, 25, 26. Den observerade etanol attraktion kan vara ett resultat av de olika caloric innehållet ide erbjudna lösningarna och de givande egenskaper etanol 24. Analysen kan också användas för att mäta negativa effekterna av kosttillskott. Ja och kollegor visade i den första publiceringen av denna metod att tillämpningen av parakvat (en oxiderande läkemedel) minskar livsmedelskonsumtion 10.

I nästa experiment, är skillnaden i födointag mellan könen visas. Metaboliska krav skiljer sig mellan manligt och kvinnligt D. melanogaster. Till exempel, medan manliga flugor föredrar kolhydratrik mat under äggproduktion, en fas som kräver ökad proteinbiosyntes, kvinnor föredrar proteinrika dieter över kolhydratrika dieter 27. Parade manliga och kvinnliga flugor användes i detta experiment. För att analysera skillnader i födointag mellan 20 manliga och 20 kvinnliga flugor i en tre timmar matningsintervallet en CAFE-analys utförs med hjälp av en sackaros concentranson serien. Fem kapillärer tillhandahölls, med lösningar som sträcker sig från 10 till 3 till 2 M sackaros, och konsumtion av varje lösning mättes (Figur 4A). Resultaten visade att båda könen föredragna hög koncentration sackaroslösningar som en näringskälla (Figur 4A). Men kvinnor som förbrukas betydligt mer av de två lägsta koncentration sackaros lösningar jämfört med män (p <0,05); Å andra sidan, män konsumerade betydligt mer av de högre koncentrations lösningar (p <0,001). Observera att dessa uppgifter inte hänsyn till skillnader i kroppsstorlek. Kvinna D. melanogaster är oftast större och tyngre än män (tabell 1). När livsmedelskonsumtion normaliseras för att flyga massa skillnader mellan män och kvinnor i konsumtionen av låg sackaros lösningar inte längre signifikant. Sammanfattningsvis män konsumerar mer sackaroslösning än parade honor, i överensstämmelse med tidigare data, reflecting möjliga olika metaboliska krav, närings preferenser eller enkla skillnader i förmågan att livnära sig på kapillärerna mellan de två könen.

Figur 1
Figur 1: Drosophila melanogaster Capillary Feeder analys. A) matnings analys med flugor. Fuktat filterpapper ger vatten på botten av flaskan. Fyra kapillärer tillhandahålls under försöket (röd- och blåfärgad mat i motsatta kapillärer). Notera att kapillärerna är säkrade i läge av en andra pipettspets, och oanvända positioner är stängda med hjälp av pipettspetsar. En skumplugg i centrum av locket tillåter luftväxling. B) Detaljerad vy av locket. Cut pipettspetsar (2-20 mikroliter, röda gränser) är införda i de koniska öppningarna hos oanvända positioner och en andra piPette spets sätts in i snittet spets för att stänga hålet. De skurna pipettspetsar används för att styra placeringen av mikrokapillärer, och uncut spetsar används för att hålla kapillärerna snäva. C) En D. melanogaster fluga livnär sig på en kapillär. D) Efter utfodring, livsmedel färg syns tydligt i farten buken. E) En digital bromsok används för att mäta avståndet mellan märket som börjar och markera slutet av menisken. Uppgifterna överförs direkt till ett Excel-kalkylblad via USB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Inverkan av Indunstning i Capillary Feeder Assay. A) Flera CAFE analys placerad inutien plastlåda med en inrutade inlägg. För att styra luftfuktigheten under experimentet fyra vattenfyllda flaskor (röda kanter) är placerade inuti gallret. Kontrollerna avdunstning är placerade i direkt närhet till dessa flaskor. Ett lock för hela installationen visas i bakgrunden. B) Jämförelse av volymförlusten genom avdunstning. Medelvärdet för avdunstning över fyra dagar visas. Fuktigheten kontrolleras av (i) att applicera vatten till den centrala svamppropp (24 h intervall); (Ii) tillsats av fyra vattenfyllda flaskor i nätet; och (iii) med hjälp av ett plasthölje för hela installationen. Avdunstningen är betydligt lägre om luftfuktigheten kontrolleras för båda testade lösningar (*** P ≤ 0,001; N = 48). Inga skillnader i volatilitet mellan EtOH innehållande och icke-innehållande sackaroslösning kan detekteras med fukt enheter som används. Klicka här för att se en större version avden här figuren.

Figur 3
Figur 3: preferens för etanol (EtOH) som innehåller sackaros över sackaroslösning. A) Livsmedelskonsumtion för manliga w 1118 flugor visas. Manlig förbrukar betydligt mer av en 15% EtOH innehållande sackaroslösning än av en vanlig sackaroslösning. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Flugor avsevärt föredrar en sackaroslösning innehållande 23% EtOH under en 4-dagars testversion. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Consumption (il / fly och il / mg fluga) av olika sackaroskoncentrationer av manliga och kvinnliga w 1118 flugor. A) Förbrukningen av olika koncentrationer av sackaros lösningar skiljer sig markant mellan män och kvinnor. Kvinnliga flugor konsumera mer vid lägre sackaroskoncentrationer och manliga flugor konsumera mer vid högre koncentrationer. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 försök med 20 hanar vardera, n = 30 försök med 20 honor vardera). B) Mat upptaget på en massbasis. En betydande ökning av konsumtionen sker mellan manliga och kvinnliga flugor för 0,1 till 2 M sackaros lösningar när normaliserats för att flyga massa. *** P ≤ 0,001; N = 27 hanar, n = 30 kvinnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: kroppsvikt manliga och kvinnliga w 1118 flugor. Fyra till fem grupper om 100 flugor mättes och kroppsvikt (mg / fluga) beräknades. Medelvärden (med STDEV (standardavvikelse) och STERROR (standardfel)) visas. Medelvärden används för att normalisera livsmedelskonsumtion för att flyga massa (il / mg fluga). Klicka här för att ladda ner kalkylblad.

tabell 2
Tabell 2: avdunstning (mikroliter) i CAFE-analys. Den mängd vätska som förloras genom avdunstning visas i 4 dagar. Fuktighet styrs (+) eller ingent (-) såsom beskrivs i figur 2. Avdunstningsdata för två olika lösningar (sackaros och sackaros plus EtOH) visas. Medelvärden presenteras för varje dag och under perioden (med STDEV och STERROR). Avdunstningen förlust av den sackaros utspädningar experiment visas undertill separat (medelvärden). Klicka här för att ladda ner kalkylblad.

tabell 3
Tabell 3: Förbrukning av 0,1 M sackaros med / utan 15% EtOH genom Man w 1118 Flugor Fed under 3 timmar. Konsumtionen av båda lösningarna för grupper av 20 flugor mättes under 3 timmar på 3 dagar. Förbrukningsvärden för flyga grupper dividerat med antalet testade flugor för att uppskatta mikroliter upptag per fluga efter avdrag avdunstning. Medelvärden (med STDEV och STERROR) visas. Klicka här för att ladda ner kalkylblad.

tabell 4
Tabell 4: Förbrukning av 0,1 M sackaros med och utan 23% EtOH i fyra dagar från Male w 1118 flugor. Konsumtionen av båda lösningarna för grupper av 8 flugor mättes under 24 timmar i 4 dagar. Företräde index för etanol beräknades med hjälp av följande formel ([Suc + EtOH] - [Suc] / totala förbrukningen). Förbrukningsvärden för flyga grupper dividerat med antalet testade flugor att uppskatta mikroliter upptag per fluga efter avdrag avdunstning. Medelvärden (med STDEV och STERROR) visas för varje dag..jove.com / filer / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner kalkylblad.

tabell 5
Tabell 5: Förbrukning av fem koncentrationer av sackaros av manliga och kvinnliga w 1118 flugor. Intag av varje lösning, och värdet för summan av sackaros intag, visas. Medelvärden för varje koncentration ges nedan varje kolumn (med STDEV och STERROR). För att beräkna intag baserat på fluga massa (mikroliter upptag per milligram fluga), är livsmedelskonsumtion delat med den genomsnittliga vikten av manliga eller kvinnliga flugor (från tabell 1, som visas till höger). Klicka här för att ladda ner kalkylblad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapporten beskriver CAFE-analysen i en steg-för-steg sätt, med fokus på teknisk installation och dess framgångsrika resultat i laboratoriet. På grund av sin enkelhet, kan denna analys även användas utbildningsmässigt som en skola experiment. Exemplen visar att analysen tillåter undersökning av livsmedelsanalys, preferenser och konsumtion i Drosophila melanogaster korta och längre tidsperioder (timmar till dagar). CAFE analys har använts i stor utsträckning i området för att undersöka ämnen inklusive mat och drogkonsumtion, missbruk, energi homeostas och neuronal styrning av matning 16, 18, 24, 25.

I CAFE-analysen måste experimentella flugor framgångsrikt utföra flera uppgifter för att få mat, såsom födosök, avkänning och förflyttning; oförmåga att utföra dessa uppgifter kan leda till minskad konsumtion. Föråldrande beteende beror huvudsakligen på hunger tillstånd av flugor och kan ökas genom fasta 19, 21. Avkänning, och därmed lokalisering, av livsmedelskälla kan påverkas genom förmågan hos flugan att lukt eller smak och kan indirekt leda till en lägre konsumtionshastigheten 28. Visningen av livsmedel i slutet av en kapillär tvingar flugan att klättra ner och aktivt hålla sig i en upp- och nedvänd position för att mata. Att hålla dricks position på kapillär måste flyga samordna muskelsammandragning. Försämring eller hyperaktivitet av förflyttning klart skulle påverka livsmedelsupptag, liksom locomotion brister på grund av åldrande. Dessutom leder störningar genom andra flugor under denna manöver för att för tidig terminering av föda. Därför bör antalet flugor som skall användas bestämmas före experimentet. Detta antal bör se till att alla flugor kan mata på rätt sätt och bör kontrollera för fly densitet i flaskan (från 8 upp till maximalt 20 flugor i vår D. melanogaster CAFE analysflaska). Utfodring påverkas av näringsvärdet i måltiden, och flugor dynamiskt anpassa sin intag följaktligen 24, 29. Det visades att mutanter saknade signalsubstansen oktopamin har normala PER respons poäng, men på samma gång visar en signifikant minskning av födointaget 14. Dessutom under utfodring, att motivationen att fortsätta äta minskar och leder till uppsägning av beteende.

Ovannämnda överväganden gäller inte bara för CAFE-analysen, inflytande de ätbeteende mätt i andra testsystem också. Därför måste förmågan hos flugor för att utföra analysen beaktas vid mätning av födointaget. Även om det inte är tekniskt utmanande, har CAFE analysen några potentiella praktiska nackdelar. Minskningen av meniskeninuti kapillären beror på avdunstning förlust och födointag av flugorna. Hög avdunstning är problematiskt när det gäller signalbrusförhållandet och bör därför minimeras. Vi tillämpade flera ytterligare metoder och anordningar för att styra luftfuktigheten under försöksperioden (se 4.6). Dessa tillbehör hjälpt oss att minska avdunstningen avsevärt och även elimineras effekterna av olika flyktighet av födokällor vi använde. Men om ingen klimatkammaren finns analysen kan utföras vid rumstemperatur (t.ex. i ett klassrum) med högre avdunstningsvärden som en nackdel.

Som nämnts i protokollet, ändarna av kapillärerna måste placeras på samma nivå i flaskan för att undvika partiskhet i farten val på grund av olika avstånd till näringskälla. För att uppnå detta är det kapillära positionen fixeras med en andra pipettspetsen. Längden av kapillären verkar inte vara ett kriterium för matning i vildtyp flugor 10. Spill av vätskan kan underminera korrekt avläsning av livsmedelskonsumtion (se 4.3 och 4.9); en vibration miljö förhindrar spill. Partiklar i lösningen blocket kapillärflöde och förhindra livsmedelskonsumtion. Maten lösning, särskilt om den innehåller jäst, måste fullständigt upplöst för att undvika en sådan blockering. Användningen av vattenlösliga jästextrakt kan övervinna detta problem, men som en ofullständig näringskälla det kan orsaka ytterligare fitness kostnader. Mat tillgänglighet måste utvärderas före och efter försöket. Det enda smolket uppgifter som bör ingå i analysen är att erhållas där tillgången till mat var närvarande under hela experimentet (se 4.9). Den upp och ned matningsläge är en kritisk funktion i försöket. Under naturliga förhållanden, är denna matningsläge inte främmande för flugan, som frukt hänger ner från träden och de kan klättra ner en rutten frukt. Detta stöds av experiment Comparing måltiden storlekar av flugor som livnär sig på en uppochnedvänd position i CAFE analys för att (i) en horisontell äta ställning immobiliserade flugor i Mafe analysen och (ii) ett höger upp utfodring position med hjälp av radiomärkt mat 13, 21 . Även om upp-ner mat display verkar inte vara en fråga för flugorna, kan det påverka sammansättningen av mat inuti kapillären. Suspenderade kosttillskott såsom jästceller kunde sjunka via tyngdkraften till botten av kapillären och därför kan vara mer koncentrerad vid botten eller kan koppla kapillären. Detta skulle påverka fly beteende och därmed resultatet. Säkerställa att komponenterna i matningslösningen är fullständigt lösta, och ofta introducera färsk kapillärer under långtidsförsök, minimerar denna påverkan på födointag.

Användningen av CAFE analysen beskriven här medger mätning av födointaget hos en fluga grupp över tiden spänner övertimmar eller dagar. Om mer detaljerad analys krävs (t ex., Beteendet hos en enda fluga eller beteende i intervallet minuter), andra matnings analyser, såsom Mafe analysen är mer lämpligt. Det kan vara möjligt för antalet flugor att minska ytterligare genom att använda en 1,5 ml mikrocentrifugrör och en enda kapillär 30.

Antalet experiment som användes för att erhålla de representativa resultat varierar från 15 till 27, som överensstämmer med experiment som beskrivs i litteraturen 17, 24. Analysen kan utföras i en klassisk blint som utesluter eventuell bias från försöksledaren, och den är normalt upprepas minst fyra till fem gånger på var och en av flera dagar. Data som erhållits med CAFE-analysen kan normaliseras kroppsvikt för att ta hänsyn till skillnader i ätbeteende relaterad till kroppsstorlek. De resultat som erhölls med denna analys är robusta och reproducerbara, så att denhar införts framgångsrikt i praktiska kurser för doktorander.

CAFE-analysen används flitigt inom metaboliska och smak forskning i Drosophila melanogaster; Det har flera tillämpningar inom testa rollen som kosttillskott och / eller droger på ätbeteende, och det kan användas för att undersöka dossvaret till en viss födokälla 24. I kombination med den anmärkningsvärda olika tekniker som används för att manipulera neuronal kretsar i D. melanogaster, kan denna analys även forskare att undersöka vilken roll förstärkningssystem på ätbeteende 12, 17, 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3, (4), 244-250 (2002).
  2. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
  3. PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
  4. Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
  5. Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
  6. Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
  7. Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65, (2), 132-137 (2009).
  8. Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
  9. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
  10. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (20), 8253-8256 (2007).
  11. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
  12. Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
  13. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11, (5), 535-540 (2014).
  14. Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
  15. Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
  16. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4, (6), e6063 (2009).
  17. Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
  18. Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
  19. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9, (6), e101107 (2014).
  20. Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
  21. Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
  22. Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12, (7), 609-612 (2015).
  23. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
  24. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19, (24), 2126-2132 (2009).
  25. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (7), 2498-2503 (2008).
  26. Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36, (11), 1903-1912 (2012).
  27. Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20, (11), 1006-1011 (2010).
  28. Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, (33), 14833-14838 (2010).
  29. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  30. Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9, (6), e99732 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics