कवक के माध्यम से रैपिड विलोपन उत्पादन
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

Genetics

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Summary

मुताबिक पुनर्संयोजन के माध्यम से उत्पन्न जीन विलोपन म्यूटेंट जीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक हैं। ओएससीएआर (एक चरण निर्माण एग्रोबैक्टेरिअम-पुनर्संयोजन-तैयार-प्लास्मिड) का निर्माण, शीघ्र ही विलोपन निर्माण के लिए तैयार किया गया है। एग्रोबैक्टेरिअम मध्यस्थता वाले कवक परिवर्तन निम्न प्रकार है। अंत में, फिंगल ट्रांसफार्मेंट में जीन विलोपन के एक पीसीआर आधारित पुष्टिकरण विधि प्रस्तुत की जाती है।

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Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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Abstract

ब्याज की जीन (एस) का सटीक विलोपन, शेष जीनोम को अपरिवर्तित छोड़ते समय, जीवित जीव में विशेष जीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए आदर्श उत्पाद प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में सटीक और तेजी से विलोपन प्लाज्मिड निर्माण की ओएससीएआर पद्धति का वर्णन किया गया है। ओएससीएआर क्लोनिंग सिस्टम पर निर्भर करता है जिसमें एक रिंकंबनीज प्रतिक्रिया होती है जिसमें शुद्ध पीसीआर-प्रवर्धित 5 'और 3' ब्याज के जीन और दो प्लास्मिड, पीए-हाइग ओएससीएआर (मार्कर वेक्टर) और पॉसैर (विधानसभा वेक्टर)। सही ढंग से इकट्ठे हटाए जाने वाले वेक्टर की पुष्टिकरण क्रमिक पाचन मैपिंग द्वारा क्रमिक द्वारा पीछा किया जाता है। एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफाइन्स का उपयोग फंगल स्पार्स (एटीएमटी के रूप में संदर्भित) में विलोपन के निर्माण की मध्यस्थता के लिए किया जाता है। अंत में, एक पीसीआर परख को यह निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है कि क्या विलोपन का निर्माण समरूप या गैर-मुताबिक पुनर्संयोजन द्वारा एकीकृत है, जीन विलोपन का संकेत याएक्टोपिक एकीकरण, क्रमशः। वर्टिकिलियम डाहलिया में कई जीनों को हटाने और अन्य प्रजातियों के बीच फ़ुसरियम वर्टिसिलियइड में इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

Introduction

आनुवंशिक विच्छेदन व्यक्ति या संयोजन के जीनों के कार्यात्मक महत्व को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली पद्धति है। विशिष्ट जीनों की भूमिका को समझने के लिए एक मानक दृष्टिकोण किसी अन्य जीन में अनियंत्रित एकल जीन म्यूटेंट का उत्पादन होता है। किसी भी अन्य जीन फ़ंक्शन को नुकसान किए बिना ब्याज के खुले पढ़ने वाले फ्रेम (जीओआई ओआरएफ) के जीन का सबसे शक्तिशाली और कम से कम संभावित रूप से भ्रामक दृष्टिकोण पूर्ण और सटीक विलोपन है।

चूंकि प्लाज्मिड पीढ़ी को हटाने के लिए मानक ढक्कन दृष्टिकोण कई कदमों की आवश्यकता है, ओएससीएआर 1 के लिए तर्कसंगत विट्रो दृष्टिकोण में अधिक तेजी से उत्पादन करना था। चित्रा 1 में OSCAR दृष्टिकोण में विधानसभा प्रक्रिया को दर्शाया गया है। यहां वर्णित विधि में एक एकल बहुपंक्ति प्रतिक्रिया में व्यक्तिगत जीन विलोपन वाले वैक्टर के तेजी से निर्माण के संयोजन का फायदा है, इसके बाद के एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफाइन्स मध्यस्थ ट्रांसपोर्सेजरेमेशन (एटीएमटी) ओएससीएआर बहुत तेजी से है और खमीर 2 में गिब्सन विधानसभा के उपयोग जैसे अन्य रणनीतियों के साथ तुलना करता है। ओएससीएआर विधि कई सफलतापूर्वक कवक के असम्कोकोटा प्रजातियों के साथ प्रयोग की गई है। इन प्रजातियों में शामिल हैं: Fusarium verticillioides (अप्रकाशित), वर्टिकिलियम डाहलिया 3 , सैटसोफियारिया टर्कािका 4 , मेटारिज़ियम रॉबर्टि 5 , फ़्युसरियम ऑक्सीसोरम्म एफ। sp। Vasinfectum 6 , पेस्टलोटियप्स माइक्रोसॉरा 7 , कोलेटोट्रिचिम हिग्गिंसियानम 8 , और डोथिस्ट्रोमा सेप्टोसॉम्रम 9 और सरोकालेडियम जुए (अप्रकाशित)

यह प्रोटोकॉल प्राइमर डिजाइन, पार्श्व पीसीआर प्रवर्धन, ओएससीएआर बीपी प्रतिक्रिया, विलोपन निर्माण संरचना की पुष्टि, ट्रांसफार्ममेंट सहित विधि के लिए चरण-दर-चरण अनुदेश प्रदान करता हैनिर्माण के साथ एग्रोबेक्टेरियम का आयन एटीएमटी आधारित हस्तांतरण के बाद फंगल कोशिकाओं में खुलता है, और अंततः एक्टोपिकी एकीकृत विलोपन निर्माण वाले उन लोगों से कवक हटाने मिटंट्स को विभेदित करता है।

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Protocol

1. जीन फ्लैक्स के पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्राइमर डिजाइन

  1. खुली पठन फ्रेम (ओआरएफ) और फुनजीडीबी या अन्य जीनोमिक डेटा संसाधन से हर तरफ जीन को कम से कम 2 केबी से जोड़कर ब्याज के जीन के जीनोमिक क्षेत्र को शब्द प्रसंस्करण फाइल में डाउनलोड करें।
  2. हटाए जाने और लेबल को शुरू करने और रोकना codons के लिए इरादा ओआरएफ हाइलाइट करें।
  3. डाउनलोड अनुक्रम के भीतर आसन्न ORF को पहचानें और हाइलाइट करें।
  4. 1 केबी के न्यूनतम आकार के उत्पाद को बनाने के लिए पीसीआर प्राइमर जोड़ी ओ 1 और ओ 2 को डिजाइन करने के लिए भारत के ओआरएफ के 2 केबी 5 'एंड एंड प्राइमर डिज़ाइन टूल (सामग्री सूची देखें) का इस्तेमाल करें। आसन्न ORFs को प्रभावित नहीं करने के लिए ध्यान रखें
    1. "एन्जेंस एंट्री" विंडो में 2 केबी 5 की परत चिपकाएं। "कस्टम पैरामीटर दिखाएं" बॉक्स पर क्लिक करें निम्नलिखित कस्टम डिजाइन पैरामीटर दर्ज करें: प्राइमर टीएम 58 (मिनट), 60 (ऑप्ट) और 62 (अधिकतम); प्राइमर जीसी 40 (मिन), 50 (ऑप्ट) और 60 (अधिकतम); प्राइमर आकार 22 (मिनट), 24 (ऑप्ट) और 26(अधिकतम); एम्प्लीकॉन आकार 1250 (मिनट), 1500 (ऑप्ट) और 2000 (अधिकतम)
    2. परिणाम चुनें जो ओआरएफ के सबसे निकट रिवर्स प्राइमर (ओ 2) रखता है। एशेज के स्क्रीन शॉट को कैप्चर करें और प्राइमर अनुक्रमों को कॉपी करके शब्द संसाधन दस्तावेज़ में पेस्ट करें।
    3. प्राइमर्स ओ 3 और ओ 4 को उत्पन्न करने के लिए इस प्रक्रिया को दोबारा दोहराएं, इस बार लक्ष्य को ओआरएफ के सबसे निकट वाला प्राइमर (ओ 3)
  5. प्राइमरों 1 से 4 के 5 अंक समाप्त करने के लिए उपयुक्त संलग्न साइटें जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
  6. नीचे अनुभाग 4 में हटाने की पुष्टि के लिए ओआरएफ विशिष्ट प्राइमरों को भी डिजाइन और ऑर्डर दें। यदि आवश्यक हो तो ओआरएफ की लंबाई के लिए एम्पलीकॉन आकार 500 (न्यूनतम), 750 (ऑप्ट) और 1000 (अधिकतम) समायोजन का उपयोग करते हुए चरण 1.4.1 में पैरामीटर समान होना चाहिए। अंत में, मुताबिक़ पुनः संयोजक की पुष्टि के लिए, 5 'बाहर और 3' प्राइमरों को उत्पन्न करते हैं जो क्रोमोसोम के भीतर केवल बाहर निकलते हैं। इन "बाहर" प्राइमरों के साथ प्रयोग किया जाएगाHygR (210) और hygF (850), क्रमशः ( अंजीर 2 )।
  7. आदेश प्राइमरों

2. ओएससीएआर कन्स्ट्रक्शंस का उत्पादन

  1. एक उच्च-निष्ठा Taq का उपयोग करते हुए , दो प्रतिक्रियाओं को एक दूसरे में 5 और 3 'फ्लैक्स के प्राइमर (100 सुक्ष्ममापी) O1 और O2 का उपयोग करके एक प्रतिक्रिया और प्राइमर्स ओ 3 और ओ 4 के लिए प्रत्येक एक करें। प्रतिक्रिया मिश्रण में निम्नलिखित शामिल हैं: 29.5 μL बाँझ आसुत जल (एसडीडब्ल्यू), 5 μL 10x एलए पीसीआर बफर, 8 μL 2.5 मिमी डीएनटीपी मिश्रण, 5 μL 25 मिमी एमजीसीएल 2 , 1 μL टेम्पलेट (50 एनजी / μL), 0.5 μL हाय- निष्ठा Taq , 0.5 μl प्राइमर O1 और 5 'पार्श्व (या 0.5 μl प्राइमर O3 और 0.5 μl प्राइमर ओ 4 के लिए 3' पार्श्व के लिए 0.5 μl प्राइमर ओ 2) उपयोग की स्थिति निम्नानुसार है: 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, फिर 30 चक्र 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस से 2 मिनट के लिए, फिर 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंतिम चरण और फिर अनिश्चित काल के 10 डिग्री सेल्सियस पर रखें
  2. 0.8% भागोउत्पाद आकार और सापेक्षिक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक मानक मिनेगल उपकरण में लगभग 125 वीएच के लिए agarose 1x TAE (40 एमएम ट्रिस एसीटेट पीएच 8.3, 1 एमएम EDTA) जेल वैद्युतकणसंचलन। पोस्ट निर्माता निर्माता निर्देशों के अनुसार गैर-एसिडियम के दाग के साथ दाग डालना। यूवी प्रकाशक पर कल्पना करें
  3. यदि 5 'और 3' पार्श्व उत्पाद मोटे तौर पर भी एकाग्रता में होते हैं, तो उन्हें गठबंधन करते हैं और एक एफ़िनिटी कॉलम किट (या पीईजी वर्षा 90 μL संयुक्त पीसीआर उत्पादों, 240 μL टी बफर पीएच 7.5, 160 μL 30% पॉलीथीन ग्लाइकॉल PEG8000 30 एमएम एमजीएल 2 ) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर उत्पादों को सह-शुद्ध करना। यदि वे समान एकाग्रता के नहीं हैं, तो उच्च उपज प्रतिक्रिया से अनुमानित बराबर मात्रा के उत्पाद के साथ सभी निम्न एकाग्रता उत्पाद को जोड़ते हैं।
  4. शुद्ध डीएनए एकाग्रता को मापने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें।
  5. निम्नलिखित मिश्रण के द्वारा बी.पी. प्रतिक्रिया करें: 1 एनएलएल 60 एनजी / μL पॉसाकार, 2 μL 60 एनजी /ΜL पीए-हाइग-ओएससीएआर, 1 एनएलएल 60 एनजी / μ एल मिलाएं, 1 μ एल क्लोनेज। 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं 0.5 μL प्रोटीनेस के कश्मीर जोड़कर प्रतिक्रिया समाप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते रहें।
  6. उच्च क्षमता ई रूपांतरण कोलाई कोशिकाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोनों सक्षम कोशिकाओं और घर-निर्मित DH5α CaCl 2 सक्षम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया था जैसा कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार वर्णित है। कम सोडियम पर प्लेट (0.5 ग्राम / एल नाउल) एलबी जिसमें 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्पेक्ट्रोमाइसिन (स्पेसी) शामिल हैं।
  7. उपरोक्त बनाए गए 10 कॉलोनियों के डीएनए मिनेप्रेप्स के प्रदर्शन से सही निर्माण की पहचान करें। हिन डीआईआईआई और केपीएन के साथ डबल पाचन को निम्न प्रकार से करें: पिपेट 5 μL डीएनए, प्रत्येक एंजाइम के 2 यू, 2 μL उचित 10x बफर के साथ 20 μL कुल मात्रा में एसडीडब्ल्यू यह वेक्टर ( सीए 7 केबी) से सम्मिलित करता है (1.5 केबी जीन फ्लैक्स के साथ 4.5 केबी) और किसी भी साइट में कटौती करता हैउम्मीद के मुताबिक बैंड आकार दे सकते हैं।
  8. अनुक्रम 11 एक उपयुक्त बैंडिंग पैटर्न दिखा क्लोनों का चयन करें।

3. एंग्रबैक्टीरियम ट्यूफाफाइन्स फुनजी की मध्यस्थता परिवर्तन (एटीएमटी)

  1. ओएससीएआर विलोपन के साथ एग्रोबेक्टेरियम ट्यूमफेसिकेंस एजीएल 1 को तब्दील करें।
  2. एजीएल 1 के साथ कवक कढ़ाई जिसमें भारत सरकार ओएससीएआर विलोपन प्लास्मिड होता है। ऐसा करने के लिए निम्न चरणों का पालन करें:
    1. 2 x 10 6 बीजाणु / एमएल पर बाँझ पानी के साथ एक कवक बोर निलंबन तैयार करें। एक हेमोसिटामीटर या स्वचालित सेल काउंटर पर बीजाणुओं को बढ़ाएं। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में 500 μL रखें। यह सेट 4 ट्रांसपोर्ट प्लेट्स के लिए है
    2. 2-3 दिन के पुराने एलबी-स्पेक 100 माध्यम से एजीएल 1 युक्त विलोपन प्लाज्मिड के आसानी से दिखाई देने वाले गोब (लगभग 20% लूप व्यास को कवर करना) को जोड़ने के लिए नीली बाँझ डिस्पोजेबल पाश का प्रयोग करें।संरचना के लिए एटरियल सूची) जिसमें प्लेटों और बीजाणु निलंबन में मिश्रण होता है। बैक्टीरिया कोशिकाओं तक भंवर अच्छी तरह से फैल गए हैं ( सीए 5 मिनट मध्यम गति)।
    3. पिपेट 100 मिलीलीटर कोनिडिया-एग्रो निलंबन को सेलूलोज़ झिल्ली फिल्टर के केंद्र पर रखा जाता है जिसमें प्रत्येक 4-6 सेमी पेट्री डिश युक्त सह-खेती माध्यम 12 होता है
    4. झिल्ली फिल्टर की पूरी सतह को कवर करने के लिए बाँझ गिलास मोती (लगभग 4) के साथ निलंबन फैलाएं। वैकल्पिक रूप से पारंपरिक स्प्रेडर टूल का प्रयोग करके निलंबन फैल गया। झिल्ली फ़िल्टर को लगभग 10 मिनट के लिए हुड में सूखने की अनुमति दें, पैराफिन फिल्म के साथ लपेटें। एकाधिक परिवर्तनों को सेट करने के लिए चरण 3.2.2 और 3.2.3 को दोहराएं।
    5. कमरे के तापमान पर 2 दिनों के लिए प्लेट को सेते, उल्टे।
    6. 6 सेमी एस्परगिलस चयन मध्यम 12 प्लेटें, जिसमें hygromycin B (Hyg) 150 μg / mL, 200 मिमी cefotaxime और 100 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त झिल्ली फिल्टर पर स्थानांतरण करेंmoxalactam। Hyg प्रतिरोधी कालोनियों को अलग करने से पहले 5-7 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    7. बाँझ टूथपेक्स के साथ, 6 सेमी आलू डिक्टरोस अगार (पीडीए) प्लेटों में 150 माइक्रोग्राम / एमएल हाइग, 100 माइक्रोग्राम / एमएल कनामाईसिन युक्त पोटिफायर ट्रांसफार्मेंट स्थानांतरण करें।

4. पीसीआर द्वारा हटाने म्यूटेंट पहचान

  1. थर्मोलिसिस 13 द्वारा ट्रांसफॉर्मेंट से पीसीआर के लिए डीएनए निकालें
    1. एक बार ट्रांसफार्मेंट चरण 3.2.7 से पीडीए पर कॉलोनियों का निर्माण करते हैं, तो कॉलोनी से छोटी मात्रा (2 मिमी x 2 मिमी) के मायसेलियम या खमीर कोशिकाओं को 100 μL के विश्लेषण समाधान (50 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच) में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ टूथपिक का उपयोग करें। 7.4, 1 एमएम ईडीटीए, 5% ग्लिसरॉल) एक माइक्रोप्रोसेज ट्यूब में।
    2. मिश्रण 20-30 मिनट के लिए 85-90 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं चरण 4.2 में उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर जीनोमिक डीएनए युक्त क्रूड निकालने की दुकान करें।
  2. प्रत्येक ट्रांसफॉर्मेंट प्रति 4 पीसीआर प्रतिक्रियाएं करेंक्रमशः 5 'और 3' फोर्केस के मुताबिक़ पुन: संयोजन, ईकाइटेड चयनकर्ता मार्कर (इस मामले में हायग्रोमाइसिन फॉस्फोट्रेंसफेरेज) और एक भारत ओआरएफ के लिए।
    नोट: हम आम तौर पर इन प्रतिक्रियाओं के लिए कम-निष्ठावान ताक़ी का इस्तेमाल करते हैं। रिएक्शन की स्थिति के अनुसार चरण 2.1 में वर्णित है और एसडीडब्लू 20 μL, 10x ताक बफर 2.5 μL, डीएनटीपीएस (10 मिमी) 0.5 μL, होममेड टैक 14 , 0.5 μL, प्राइमर ए (100 माइक्रोग्राम) 0.5 μL, प्राइमर बी (100 माइक्रोन ) 0.5 μL, टेम्पलेट 0.5 μL। कम एकाग्रता प्राइमर स्टॉक (10 माइक्रोन) समान रूप से अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है
  3. पीसीआर उत्पादों के एक agarose जेल ( जैसे 0.8%) चलाएं। हटाने म्यूटेंट्स को हाइग बैंड का उत्पादन होगा, लेकिन ओआरएफ उत्पाद नहीं होगा। एक्टोपिक एकीकृतकर्ता दोनों बैंड दिखाएंगे I जंगली प्रकार केवल ओआरएफ बैंड का निर्माण करेगा
  4. भविष्य के उपयोग के लिए हटाने के म्यूटेंट (और एक एक्टोपिक ट्रांसफार्मेंट या दो नियंत्रण के लिए) को स्थायी रूप से संग्रहित करें
    नोट: 15% ग्लिसरॉल का उपयोग एस के लिए किया जाता हैहमारे तनावों को लंबे समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फाड़ दिया

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Representative Results

ओएससीएआर विधि, एक एकल प्रतिक्रिया में, एक प्लाज्मिड उत्पन्न करता है जिसमें लक्ष्य जीन के फ्लैंक्स को चुना जाता है जिसे चयनकर्ता मार्कर कैसेट के आसपास हटाया जा सकता है। ओएससीएआर का उपयोग करने से विलोपन का निर्माण बहुत ही कुशल है हालांकि, प्रणाली, आंशिक संरचनाओं का उत्पादन कर सकती है, जिसमें कुछ तीन अवयव हैं (दो जीन flanks और चयन मार्कर)। आम तौर पर, ई। कोली ट्रांसफार्मेंट के बहुमत में सही OSCAR का निर्माण होता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 में वर्टिकिलियम डाहलिया जीन VDAG_06812 के लिए ओएससीएआर विलोपन का निर्माण दर्शाया गया है। इस मामले में VDAG_06812 के flanks हिन डीआईआईआई या केपीएनआई साइटों की कमी है और इसलिए 4,247 बीपी के एक प्लाज्मिड डालने जारी किया जाना चाहिए। चित्रा 3 से पता चलता है कि हिन डीआईआईआई-केपीएन मैं प्रतिबंध एंजाइम डबल पाचन सही प्लाज्मिड संरचना की पुष्टि ग्लेन 5 और 11 को छोड़कर असंगत construc का प्रतिनिधित्वts। 4 चित्रा दक्षिणी धब्बा द्वारा दो अलग जीन विलोपन के अंतिम पुष्टि दिखाती है। चित्रा 5 दक्षिणी धब्बों के विकल्प के रूप में एक निश्चित पीसीआर दृष्टिकोण को दर्शाता है।

चित्र 2
चित्रा 1: ओएससीएआर विलोपन निर्माण प्रतिक्रिया OSCAR विलोपन निर्माण प्रक्रिया में 5 'और 3' जीन फ्लैक्स के अलग पीसीआर प्रवर्धन शामिल है, इसके बाद संयुक्त शुद्ध शुद्ध उत्पादों और बाइनरी और चयन मार्कर प्लास्मिड के साथ बीपी क्लोनेस प्रतिक्रिया होती है। बी 1 आर, बी 2 आर, बी 3, बी 4, पी 1 आर, पी 2 आर, पी 3, पी 4, आर 1, आर 2, एल 3 और एल 4 लैम्ब्डा पुनर्संयोजन साइट का प्रतिनिधित्व करते हैं। संदर्भ 1 से अनुमति के साथ पुनः प्रिंट

चित्र 2
चित्रा 2: ओएससीएआर हटाने के लिए < Em> वर्टिसिलियम डाहलिया जीन VDAG_06812 प्रतिबन्ध निर्माण संरचना की पुष्टि करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम की मान्यता और प्राइमर एनीलिंग साइटों की स्थिति दिखायी जाती है। संदर्भ 1 से अनुमति के साथ पुनः प्रिंट

चित्र तीन
चित्रा 3: केपीएन मैं और हिन डीआईआईआई के साथ वीडीएजीजी 6868 के विलोपन निर्माण संरचना की रोकथाम पाचन पुष्टि। प्लास्मिड को जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा 0.8% agarose जेल पर डबल पचाने और विश्लेषण किया गया था। सही निर्माण क्रमशः दो बैंड उत्पन्न करता है, लगभग 6.9 केबी और 4.2 केबी, जो बाइनरी वेक्टर रीढ़ की हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है और HygR मार्कर को लक्ष्य जीन फ्लैक्स से जोड़ा जाता है। संदर्भ 1 से अनुमति के साथ पुनः प्रिंट

Ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4: ओएससीएआर हटाना निर्माणों का उपयोग करते हुए वी। डाहलिया में VDAG_02161 और VDAG_09930 को हटाने की पुष्टि करने वाले दक्षिणी दाग संकरण। जीनोमिक डीएनए को बीसीएल I के साथ पचाया गया था। तब उन्हें एक साथ VDAG_02161 और VDAG_09930 ओआरएफ जांच के साथ जांच की गई थी। संकरण बैंड VDAG_02161 और VDAG_09930 के जंगली प्रकार alleles के क्रमशः 2,757 बीपी और 1,426 बीपी हैं। नमूने इस प्रकार हैं: लेन 1: जंगली प्रकार का तनाव VdLs.17; लेन 2: विस्थापन उत्परिवर्ती तनाव 02161.1; लेन 3: विस्थापन उत्परिवर्ती तनाव 02161.3; लेन 4: एक्टोपिक ट्रांसफॉर्मेंट तनाव ईसीटी 02161.2; लेन 5: उत्परिवर्ती तनाव 09 9 30.3; लेन 6: उत्परिवर्ती तनाव 09 9 30.10; लेन 7: एक्टोपिक ट्रांसफॉर्मेंट तनाव ईसीटी 09 9 30.4। से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट संदर्भ 1


चित्रा 5: पीसीआर द्वारा उत्परिवर्तनीय पुष्टि हटाने जीन एफवीजीई 33253 के लिए विलोपन और एक्टोपिक फ्यूसरियम वर्टिसिलियइड ट्रांसनामेंट्स का विश्लेषण लैन 1 शीर्ष और नीचे, मार्कर; लेन 2-6 शीर्ष जेल ट्रांसफॉर्मेंट पीसीआर 5 'बाहर टुकड़ा प्रवर्धन; लेन 7-11 शीर्ष जेल ओआरएफ प्रवर्धन; लेन 2-6 नीचे जेल Hyg जीन प्रवर्धन; लेन 7-11 तल जेल 3 'बाहर टुकड़ा प्रवर्धन नमूने 11/31 (लेन 2 और 7), 11/32 (लेन 3 और 8), 11/33 (लेन 4 और 9), और एक्टोपिक ट्रांसफार्मेंट 11/34 (लेन 5 और 10) और 11 / 35 (लेन 6 और 11)

भजन की पुस्तक उपयोग अनुक्रम
प्राइमर ओ 1- (एटीबी 2 आर) 5'फेंक का प्रवर्धन,प्राइमर आगे 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
प्राइमर ओ 2- (एट बी 1 आर) 5'फेंक, प्राइमर रिवर्स का प्रवर्धन 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
प्राइमर ओ 3- (एटीबी 4) 3 पंख का प्रवर्धन, प्राइमर आगे 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT
प्राइमर ओ 4- (एटीबी 3) 3'फेंक, प्राइमर रिवर्स का प्रवर्धन 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

तालिका 1: विशिष्ट OSCAR प्राइमर 5 'एक्सटेंशन जीन विशिष्ट प्राइमर अनुक्रमों में जोड़ा गया

भजन की पुस्तक उपयोग अनुक्रम
ओएससी-एफ 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
ओएससी-आर ओएससीएआर रिवर्स सिकेंजिंग प्राइमर, 5 'फेंक के एंटी-इन्सान स्ट्रैंड की अनुक्रम 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) रिवर्स सिक्वेंसिंग प्राइमर, 5-अंपायर की विरोधी भावना के किनारा 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) अग्रेषित क्रमिक प्राइमर, अनुक्रम 3 फीट की किनारा समझते हैं 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
नई हाइग मार्कर फ़ॉरवर्ड एक नियंत्रण के रूप में hygromycin प्रतिरोध जीन को बढ़ाने के लिए (नीचे नई Hyg मार्कर रिवर्स प्राइमर के साथ) 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
नया हाइग मार्कर रिवर्स एक नियंत्रण के रूप में hygromycin प्रतिरोध जीन को बढ़ाने के लिए (साथ में ऊपर नई Hyg मार्कर फॉरवर्ड प्राइमर के साथ) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

तालिका 2: ओएससीएआर विलोपन के विश्लेषण के लिए प्राइमर्स

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Discussion

एक चरण एग्रोबेक्टेरियम का निर्माण- पुनर्संयोजन-तैयार-प्लास्मिड (ओएससीएआर) को सफलतापूर्वक एक असम्कोकोटा कवक की बढ़ती संख्या के साथ नियोजित किया गया है। एसिबैक्टेरीयम मध्यस्थता परिवर्तन और मुताबिक पुनर्संयोजन संभालने के लिए, संभवतः बसिद्योमाकोटा और अन्य कवक फ्लाई (प्रजातियों को उपयुक्त मार्कर जीन चलाते हुए उपयुक्त प्रमोटरों के साथ) से प्रजातियों पर आसानी से लागू होना चाहिए। एंटी-फंगल परिसर के विकल्पों में विविधता लाने के साथ-साथ डबल और उच्च ऑर्डर म्यूटेंट के उत्पादन की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त मार्कर वैक्टर तैयार किए गए हैं। इनमें जी 418, नोसियोथ्रिकिन, और हाल ही में हर्बाइसाइड ग्लूफोसाइंट अमोनियम और क्लोरिमुरॉन एथिल 4 के प्रतिरोध शामिल हैं।

विधि वर्टिसिलियम डाहलिया के साथ उपयोग के लिए तैयार की गई थी, जिसमें से यहां प्रस्तुत छवियां मुख्य रूप से 1 से प्राप्त हुई हैं। हाल ही में हटाए जाने के लिए हाल ही में ओएससीएआर बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया हैमायकोटॉक्सिगेनिक फंगस फ्यूसरियम वर्टिसिलियइड में जीन का 60 से अधिक विलोपन निर्माण किए गए हैं और 30 से अधिक जीनों के लिए म्यूटेंट हटाए गए हैं (अप्रकाशित)।

अपने वर्तमान पुनरावृत्त में इस प्रक्रिया को हाथ में पुष्टि हटाने के म्यूटेंट का एक सेट रखने के लिए लगभग 4-6 सप्ताह की आवश्यकता होती है। निम्नलिखित प्रमुख ओएससीएआर कदमों की एक संक्षिप्त सूची है और उन्हें पूरा करने के लिए आवश्यक अनुमानित समय: 1) जीनोम डेटा (5 दिन) के आधार पर OSCAR प्राइमरों के डिजाइन और खरीद, 2) प्रवर्धन और क्लोनिंग, (2 दिन), 3) एटीएमटी (4 दिन) के लिए एग्रोबैक्टेरियम में प्लाज्मिड की शुरूआत , (4) 5) फ्यूसरियम वर्टिलिलिआइड में एटीएमटी द्वारा ट्रांसफॉर्मेंट का उत्पादन और बढ़ने (2 सप्ताह, ध्यान दें कि यह विकास दर पर निर्भर है कणों के अध्ययन के तहत), थर्मोलिसिस और पीसीआर निर्धारण (2 दिन), 6) एकल स्पोरिंग, जीनोटाइप पुष्टिकरण और भंडारण (1-2 सप्ताह)।

15 के द्वारा उपलब्ध हैं । पीए-बार-ओएससीएआर और पीए-सुर-ओएससीएआर जैसे अन्य ओएससीएआर प्लास्मिड लेखकों 5 से उपलब्ध हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

लेखकों ने निम्नलिखित स्नातक और उच्च विद्यालय के छात्रों को अपने काम के लिए Fusarium verticillioiodes में ओएससीएआर म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए धन्यवाद : अंजेलिका मिलर, अथर नसीर, झू लिन, केटलिन वुडब्र्री, चेल्सी पैटरसन, कैथलीन रॉबर्टसन, क्रिस्टिना ब्राडली, एशटन रोजर्स, एलेक्सिस मैकेन्सी, मैन्नी हर्नांडेज़ , अशली क्रेप्सैक, जेफ डेलाग, क्रिश्चियन किंग, गि जोंग, मारिया बेल्डिंग, क्रिस्टी बुरे, डैनियल ओमेरा, लॉरेन (विक्टोरिया) कुक, जेक गुडमैन, संप्रती डी, ओगे ओकॉय, एलिसा बेकस्टेड, गेटेट हिब्स, निक गोल्डस्टीन, कैरोलिन ट्विम , क्रिस बेन्सन, लुई स्टोक्स, हन्ना इटेल, जेन हल्स, जासीम मोहम्मद, जेम्स लॉगगिन्स, केल्ली रसेल, ग्रेनीना जोन्स, क्रिस्टिन शेफ़र, मरीयम हम्मानी, एवा विल्सन, कैटरीना बजेमोरे, टनी हार्पर, कार्लिन मैकही, मोहम्मद मोमीन, रीमा मोमीन , थी नोगोक ले और एंजेल फम

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

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References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48, (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7, (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103, (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9, (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65, (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10, (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8, (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51, (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Springer International Publishing. 361-384 (2016).

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