시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 시차 주사 열량계를 사용하여 산업 환경에서 단백질의 열적 안정성과 구조적 구조를 평가하는 것입니다. 시차 주사 열량계는 온도의 함수로 샘플의 몰 열 용량을 측정하며 단백질의 열 안정성과 구조적 구조를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 비교적 간단한 절차는 다른 생물물리학적 방법의 경우와 같이 구조적 나선이나 고유 형광단에 의존하지 않습니다.

이 기술의 또 다른 장점은 상호 작용을 방해하는 데 필요한 열전이 온도와 에너지를 직접 측정하여 단백질의 3차 구조를 안정화한다는 것입니다. 풀림의 엔서롤피(enthralpy)와 함께 사용할 경우, 열 전이 온도는 생물학적 제제에 대한 제조 공정의 로트 간 일관성을 모니터링하는 데 유용한 매개변수로 사용될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 새로운 사용자가 중요한 단계를 수행하는 데 효과적으로 도움이 되는 대화형 매체 역할을 할 수 있습니다.

시작하려면 시차 주사 열량계를 켜십시오. 그런 다음 시스템에 질소를 공급합니다. 이것은 세포의 압력을 증가시켜 샘플의 끓는 것을 억제하고 고온에서 기포가 형성되는 것을 방지합니다.

셀의 구성 재료에 따라 셀의 손상을 방지하기 위해 제조업체에서 권장하는 압력에 따라 질소 가스 공급 압력을 조정하십시오. 모든 세척제 저장소가 필요한 양으로 채워졌는지 확인하십시오. 필요한 세척제에는 셀을 세척하기 위한 세제와 각 샘플 실행 후 셀을 세척하기 위한 물이 포함됩니다.

샘플 보관 구획의 온도를 적절한 값, 가급적이면 섭씨 5도로 설정하여 실험 전에 샘플의 무결성을 유지하십시오. 용액 간의 유일한 차이가 단백질인지 확인하기 위해 샘플과 버퍼를 평형을 이루는 것이 중요합니다. 따라서 관찰된 열용량의 차이는 단백질에 정확하게 기인할 수 있습니다.

Lowry 방법과 같은 적절한 단백질 농도 측정 방법을 사용하여 단백질 샘플의 농도를 측정합니다. 이 프로토콜에 사용되는 기기의 경우, 바람직한 작업 범위는 밀리리터당 0.5 내지 1밀리그램의 단백질입니다. 실험의 참조로 사용될 버퍼에 대해 샘플을 투석합니다.

진공 상태에서 샘플과 참조 버퍼의 가스를 제거하여 부피 부정확성을 유발할 수 있는 미세 기포를 제거합니다. 층류 생물 봉쇄 캐비닛에서 작업하면서 마이크로피펫과 멸균 팁을 사용하여 각각의 완충액에 있는 샘플을 쌍으로 96개의 웰 플레이트에 로드합니다. 처음 두 쌍의 웰에 버퍼를 채워 버퍼 버퍼 스캔을 수행하고 샘플 측정 전에 기기의 적합성을 확인합니다.

세포를 청소하기 위한 물 스캔을 위해 마지막 두 쌍의 우물에 물을 채웁니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 밀봉 필름으로 덮습니다. 샘플 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 꺼내기 전에 웰이 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오.

마지막으로, 플레이트를 샘플 보관 칸에 적절한 방향으로 놓습니다. 수집 소프트웨어를 사용하여 플레이트가 로드된 순서대로 샘플 정보를 입력합니다. 가능한 경우 단백질 농도를 입력합니다.

그렇지 않으면 데이터 분석 전에 분석 소프트웨어에 농도를 입력하십시오. 모든 시료 스캔 전에 세제로 셀을 세척할 수 있는 옵션을 선택하십시오. 세척 후에는 셀에 세제 잔여물이 남지 않도록 여러 번의 물 헹굼 단계를 거쳐야 합니다.

실험의 시작 온도를 섭씨 20도로 설정하며, 이는 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 알려진 단백질의 경우, 미리 결정된 시작 온도를 사용할 수 있으며, 알려지지 않은 샘플에는 더 낮은 시작 온도를 적용할 수 있습니다. 그런 다음 실험의 최종 온도를 설정합니다.

최종 온도는 샘플에 대한 사전 지식에 따라 달라질 수도 있습니다. 다음으로 실험의 스캔 속도를 설정합니다. 풀림의 역학을 평가하기 위해 다른 스캔 속도로 알려지지 않은 샘플을 스캔하는 것이 좋습니다.

열 전이의 가역성을 검사하기 위해 샘플을 다시 스캔하도록 수집 소프트웨어를 설정합니다. 단백질의 풀림은 두 번째 스캔에서 얻은 엔탈피가 첫 번째 스캔의 엔탈피 값의 80% 이상인 경우 가역적인 것으로 간주됩니다. 실험 후 온도 조절기를 섭씨 10도로 설정하여 열량계 셀의 무결성을 보존합니다.

실험을 실행하기 전에 실험 설정 매개 변수가 올바른지 확인합니다. 모든 것이 준비되면 실험을 시작합니다. 실험 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다.

해석을 위해 기준선 빼기는 수동으로 수행됩니다. 이 단계에서 일관성을 유지하는 것은 비교 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에 표시된 것은 완충액 및 물 스캔을 포함한 실험 실행의 대표적인 원시 데이터입니다.

분석 중인 샘플은 본래 상태와 해독 상태의 독소입니다. 샘플 스캔은 각 샘플의 용융 온도와 엔탈피 값을 도출하기 위해 별도로 처리됩니다. 원산지 국가의 경우 용융 온도는 섭씨 55.55도이고 독소의 엔탈피는 3.157 곱하기 10의 5 분의 5 칼로리입니다.

반대로, 해독 상태에서 독소의 용융 온도는 섭씨 81.21도이고 엔탈피는 3.656 곱하기 10의 5 분의 5 칼로리입니다. 네이티브 및 디톡스 상태에서 독소의 처리된 데이터를 오버레이하는 것은 디톡스화된 샘플이 용융 온도 값에 따른 네이티브 상태보다 열적으로 더 안정적임을 보여줍니다. 또한 해독 과정이 독소의 3차 구조에 구조적 변화를 일으킨다는 것을 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 정확한 결과를 얻으려면 세포와 주사기의 투명도가 중요하므로 세포와 주사기의 교차 오염을 방지하기 위해 세제와 물을 적절하게 공급하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질의 열적 안정성과 구조를 평가하는 방법으로서의 시차 주사 열량계를 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 결과 열 실행에서 의미 있는 공제를 할 수 있습니다.

이 절차에 따라, 펼침 중 2차 구조의 변화에 관한 추가 질문에 답하기 위해 원형 이색성과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 동일한 제품의 여러 로트에 대해 수집된 데이터는 백신 생산을 위한 단백질 항원의 구조 구조에 대한 공정 변경, 제형 및 보관 조건의 영향을 조사하기 위한 경험적 기준선을 만드는 데 사용되었습니다.