Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Biochemistry

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Summary

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

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Liokatis, S. Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones. J. Vis. Exp. (121), e55349, doi:10.3791/55349 (2017).

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Abstract

nucleossomos assimetricamente modificados contêm as duas cópias de uma histona (histonas irmã) decorados com conjuntos distintos de modificações pós-traducionais (PTMS). Eles são recém-espécie identificada com meios desconhecidos de estabelecimento e implicações funcionais. métodos analíticos correntes são insuficientes para detectar a ocorrência específica contra cópia de PTMs sobre as histonas nucleossomais irmã. Este protocolo apresenta um método bioquímico para a reconstituição in vitro de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. O complexo gerado também pode ser assimetricamente modificada, após a inclusão de uma piscina histona premodified durante a redobragem de subcomplexos histonas. Estas preparações nucleossomos assimétricos podem estar prontamente reagiu com enzimas modificadoras de histonas para estudar modificação mecanismos de cross-talk impostas pela PTM assimetricamente pré-incorporados usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Em particular, as reacções de modificaçãoEm tempo real pode ser mapeado de forma independente nas duas histonas irmã através da realização de diferentes tipos de experiências de correlação de RMN, adaptados para o respectivo tipo de isótopos. Esta metodologia proporciona os meios para estudar os mecanismos de diafonia que contribuem para a formação e propagação de padrões PTM assimétricos em complexos nucleossomais.

Introduction

ADN eucariótico está firmemente embalados dentro de núcleos celulares em cromatina. O bloco de construção fundamental da cromatina é a partícula de núcleo que contém nucleossoma ~ 147 pb de ADN envolvida em torno de um complexo octam�ica constituído por duas cópias de cada um dos quatro histonas nucleares (H3, H4 e H2A, H2B). proteínas histona abrigar uma variedade de modificações pós-traducionais (PTMs). Estas substituições covalentes induzir alterações na estrutura da cromatina, tanto directamente ao afectar a química física do sistema e, indirectamente, através do recrutamento de actividades de remodelação da cromatina 1, 2, 3. Por esses meios, PTMs histonas controlar a acessibilidade da cromatina e, portanto, regular todas as funções celulares 4 baseados em DNA.

PTMs são instalados por sistemas de enzimas de modificação de histonas principalmente sobre os segmentos do terminal N não estruturados (caudas) de histo núcleo incorporou-nucleossomanes. Devido aos muitos locais de modificação no relativamente curta sequência de caudas das histonas, PTMs influenciam uns aos outros através da indução ou bloqueando reações posterior modificação, um efeito conhecido como modificação cross-talk 5. Devido à arquitectura geral simétrica do nucleossoma, reacções de modificação e os mecanismos de diafonia foram pensados ​​para ocorrer de forma semelhante para as duas cópias de cada histona nucleossomal (histonas irmã). Este conceito foi recentemente desafiado e posteriormente refutadas. Particularmente, in vitro ensaios enzimáticos sobre peptídeos cauda H3 histonas livre e em nucleossomos demonstraram que um conjunto de quinases H3 introduzido fosforilação de forma assimétrica 6. Adicionalmente, análise por LC-MS / MS com base em afinidade de purificação revelado a existência de nucleossomas assimetricamente metilada-H3 em vários tipos de células eucarióticas 7. Assim, nucleossomas assimetricamente modificados constituem novas espécies, eferramentas são necessárias para desvendar os mecanismos que controlam a sua formação e para analisar os efeitos crosstalk que esta assimetria pode exercer.

Comumente, Western Blotting (WB) e análise de espectrometria de massa (MS) foram utilizados para detectar PTMs histonas. Apesar de sua fácil aplicação, WB sofre de problemas de especificidade / reatividade cruzada. Em cima disso, é incapaz de realizar a análise multi-PTM simultânea e quantificação direta das reações de modificação 8. Por outro lado, a análise MS emprega instrumentação sofisticada que requer a formação de alto nível, mas proporciona uma elevada especificidade, assim como o mapeamento simultâneo e quantificação de múltiplos PTMs 9.   No entanto, ambos os métodos são perturbadores e os complexos são dissociados nucleossomais antes da análise, dando origem a uma mistura de histonas e / ou péptidos derivados de histona. Esta manipulação remove a capacidade de distinguir independentereacções de modificação que ocorrem em cada um dos dois histonas irmã e para relatar o status de modificação específicos de cópia das histonas nucleossomais.

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) nuclear evoluiu como um método alternativo para mapear reacções PTM. NMR é sem interrupções e, portanto, permite o monitoramento de eventos da PTM de uma forma em tempo real em misturas reconstituídos, e até mesmo em células intactas 10, 11. O desenvolvimento de rotinas para aquisição de dados rápida, bem como para o mapeamento de alta resolução com base em 2D métodos de correlação hetero-nuclear de amostras com isótopos marcado (15 N e / ou 13 C) 12 permitiram o mapeamento simultânea de diferentes tipos de PTMs, tais como serina / treonina / fosforilação da tirosina, lisina acetilação / metilação, arginina e metilação 13. Dependendo da PTM sob investigação, 15 N- ou 13 C-rotulagem protocols pode ser utilizado para marcar a proteína de grupo funcional que serve como um repórter modificação. Por conseguinte, o mapeamento PTM pode ser realizada seguindo o deslocamento do desvio químico característico do grupo funcional correspondente "sensing" a alteração no ambiente químico. Na maioria dos casos, ambos os grupos NH e CH químicas pode ser usada para informar a evolução da PTM de interesse.

O protocolo atual descreve a geração de nucleossomos contendo histonas irmã marcados com isótopos de forma diferenciada. Ela combina a flexibilidade da espectroscopia de RMN para mapear PTMs usando tanto um H- 15 N e 1 H- 13 C espectros de correlação com a utilização de diferentes marcadores de afinidade da proteína para a purificação dos complexos de histona reconstituídos seleccionados. Notadamente, o protocolo emprega duas piscinas diferentes de uma histona especial para reconstituição nucleossomo. Estas piscinas são diferencialmente marcado com isótopo (com um 13 C), e eles são fundidos com um poli-histidina e uma etiqueta de afinidade estreptavidina, respectivamente. Um esquema de purificação por afinidade em tandem com Ni-NTA e cromatograf ia à base de estreptavidina inicialmente utilizado por Voigt et al. 7 é empregue para purificar homólogos de espécies assimétrica simétrico (Figura 1A). Oct�eros histonas assimétricos são utilizados posteriormente para reconstituir complexos nucleossomais equivalentes (Figura 1B), utilizando o método de diálise sal padrão 14. Além disso, através do mesmo procedimento e por ter uma das piscinas histona pré-modificados, um PTM pode ser incorporado de forma assimétrica para os nucleossomas resultantes. A reacção destes substratos com as enzimas modificadoras de histonas e subsequente RMN-mapeamento de eventos de modificação de permitir a caracterização dos mecanismos de diafonia, tanto em cis-(cópia histona premodified) e na trans-(unmodificópia Ed histona) (Figura 1C).

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Protocol

1. Reconstituição de Nucleosomes com diferencialmente Isotope marcado (e assimetricamente Modificada) Irmã Histones

NOTA: O protocolo atual descreve a reconstituição dos nucleossomos com diferencialmente H3 histona marcada com isótopos. Para este fim, foram utilizados dois conjuntos de histona H3; um N-15 foi rotulado e continha uma 6xHis-tag no terminal-N e a segunda foi de 13 C-rotulado e continha o péptido Strep (WSHPQFEK) fundido na extremidade N-terminal. Ambas as marcas foram separados a partir da sequência nativa H3 com um local de reconhecimento para proteases do tabaco Etch Vírus (TEV). Para preparar nucleossomos adicionais assimetricamente modificados, uma das duas piscinas H3 está incluído numa forma premodified. Premodification de uma piscina de histona pode ser realizado fazendo reagir o histona marcada com isótopos de interesse com o respectivo enzima de modificação de histona na presença do necessário para cada tipo de co-factores de reacção / vc 1 doadores6. O posicionamento eficiente da respectiva PTM pode ser avaliada por espectroscopia de RMN ou espectrometria de massa. As quantidades de histonas / ADN são utilizados aqui recomendações em bruto para se obter uma preparação nucleossoma com uma concentração aproximada de 10 | iM (medida como concentração de ADN, a 260 nm) .Este rendimento final é suficiente para registar os espectros de RMN de boa qualidade com tempos de aquisição relativamente curtos.

  1. A reconstituição de um octâmero histona com diferencialmente histona H3 (e assimetricamente modificado) marcada com isótopo
    NOTA: Recombinante proteínas histona podem ser produzidos em quantidades em mg BL21 (DE3) pLysS 14. Para obter histonas marcados com isótopos, o mesmo protocolo de expressão / purificação é seguido com a excepção de usar para o crescimento bacteriano num meio mínimo contendo 15 NH 4 Cl e / ou C-Glicose 13, como fontes de azoto e de carbono, para 15 N ou 13 respecti-rotulagem Cvely. histonas purificados são extensivamente dialisadas contra 5 mM β-mercaptoetanol e armazenado liofilizado antes da utilização.
    1. Dissolve-se alíquotas de histona liofilizadas, contendo ~ 5 mg de cada histona em 1 ml de tampão de revelação (M guanidínio-HCl 7, Tris 20 mM pH 7,5, DTT 10 mM). Incluem ambos os tipos de histona H3. Misturar por pipetagem e não vortex. Manter os tubos em gelo durante 30 min para permitir desdobramento completo.
    2. Determinar a concentração exacta de cada histona através da medição da absorvância a 280 nm contra tampão de desdobramento e utilizando coeficientes de extinção calculado com a ferramenta ProtParam do portal ExPASy. 15
    3. Misturar as histonas nucleares para proporções equimolares, tendo em mente para incluir 50% de cada um dos dois conjuntos de histona H3. Comece usando todo o conteúdo da histona menos concentrado e adicionar todos os outros em conformidade.
    4. Ajustar a concentração final de proteína de aproximadamente 1 mg / mL utilizando tampão de desdobramento.
    5. transfer-se a mistura para uma membrana de diálise de corte de 6 kDa-e dializar contra a 1-2 L de tampão de redobragem arrefecido (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 2 M, EDTA 1 mM, DTT 2 mM) a 4 ° C. Mudar o tampão de pelo menos uma vez após a diálise prosseguiu por um período mínimo de 3 h. Realizar uma final de diálise O / N a 4 ° C.
    6. Recolher o material dialisado e remover quaisquer precipitados por centrifugação numa microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C em velocidade máxima (normalmente nenhuma precipitação deve ser observado). Determinar a concentração octâmero através da medição da absorvância a 280 nm. Nos cálculos, usar os coeficientes de extinção das histonas adicionados, mantendo em mente para cada valor duplo.
    7. Concentra-se para um volume final de ~ 2 ml utilizando uma unidade de filtração centrífuga de 10 kDa-corte. Recalcular concentração octamer e perda estimativa. Neste ponto, uma concentração octâmero entre 50 - devem ser obtidas 100 uM.
    8. Ligue a coluna de filtração em gel (indicado na tabela de materiais) para umSistema de FPLC e equilibrar-se com 2 volumes de coluna (CV) de 0,22-filtrada e desgaseificada de redobragem tampão a um caudal de 1 mL / min e um limite da pressão de 0,5 MPa.
      NOTA: O gel de filtração deve ser executado no quarto frio ou em um armário de frio.
    9. Injectar material concentrado utilizando uma taxa de fluxo de 1 mL / min e recolher 1,0 - 1,5 mL fracções.
    10. Siga o perfil cromatográfico e observar histona octamer eluição a ~ 65 - 68 mL.
      NOTA: Um pequeno ombro do pico de eluição e um pico a ~ 80 mL indica a existência de tetrâmeros H3-H4 livres e dímeros H2A-H2B, respectivamente.
    11. Executar 20 uL de cada fracção recolhida num gel de SDS-PAGE a 18%.
      NOTA: Diluir as amostras por um factor de pelo menos 2 com água antes de os colocar no gel para reduzir a concentração elevada de sal e, assim, evitar distorções. O mesmo aplica-se para as análises de SDS-PAGE de amostras subsequentes no tampão de redobragem.
    12. Piscina fra relevanteCÇÕES contendo oct�eros puros julgados pela distribuição igual dos 4 histonas no gel corado e determinar a concentração de antes (passo 1.1.7).
    13. Conectar um 1 ml de Ni-NTA de (tabela de materiais) para um sistema de FPLC e equilibrar-se com 10 CV de 0,22 um filtrado e desgaseificado redobragem tampão a um caudal de 1 mL / min.
      NOTA: A cromatografia de Ni-NTA devem ser realizados na câmara fria ou num armário frio.
    14. Passe o octâmero purificada através de Ni-NTA utilizando uma taxa de fluxo de 1 mL / min.
    15. Recolha de fluxo e manter as amostras para a análise de SDS-PAGE / WB (20 mL e 4 mL, respectivamente). Subsequentemente, lavagem da coluna com 10 CV de tampão de redobragem ou até que um sinal de linha de base é atingido.
    16. Eluir com 10 CV de tampão de redobragem contendo imidazole 250 mM, utilizando uma taxa de fluxo de 1 mL / min. Manter as amostras de SDS-PAGE análise / WB (20 mL e 4 mL, respectivamente).
    17. Equilibrar a coluna de afinidade de 1 mL de ACestreptavidina ommercial (Tabela de Materiais) com tampão de redobramento 10 CV contendo imidazol 250 mM usando uma configuração de fluxo de lote / gravidade.
      NOTA: Este passo cromatograf ico deve ser realizada no ambiente frio.
    18. Passa de Ni-NTA de eluição através da coluna de afinidade de estreptavidina comercial.
    19. Recolha fluxo através e manter as amostras de SDS-PAGE análise / WB (20 mL e 4 mL, respectivamente). Subsequentemente, lava-se com 10 CV de tampão de re-enrolamento.
    20. Eluir com 10 CV de tampão de redobragem contendo destiobiotina 2,5 mM. Manter as amostras para a análise de SDS-PAGE / WB (20 e 4 mL, respectivamente).
    21. Medir a concentração de octâmero, adicionar 10 vezes menos protease de TEV e deixar reacção prosseguir durante a noite a 4 ° C num tubo de plástico de centrífuga padrão.
      NOTA: A quantidade necessária de TEV para obter a digestão completa (remoção das etiquetas de afinidade) depende da origem (construção) e sobre a actividade (feito recentemente, TEV recombinante é maisactiva em comparação com o armazenado durante períodos prolongados a - 80 ° C). Tente inicialmente adição de 10 vezes menos TEV em comparação com o octâmero (avaliado em termos de concentração de proteína) e ajustar em conformidade.
    22. Entrada para a digestão eficiente executando 20 uL da mistura anterior e depois disso TEV num gel de SDS-PAGE a 18%. Se a digestão não está completa, adicione mais TEV protease e continuar a incubação por mais 3-4 h.
    23. Diálise da amostra contra redobrando buffer usando uma membrana de diálise 50 kDa-corte para remover TEV protease e ajustar composição do tampão.
    24. Concentra-se o octâmero assimétrica purificado utilizando uma unidade de corte de 10 kDa-centrífuga de filtro (da mesma unidade de filtro a partir do passo 1.1.7 pode também ser usado) até um volume de 1,0-2,0 mL. Medir a concentração final. De qualquer utilização logo após a reconstituição dos nucleossomas para ajustar ou a 50% (v / v) de glicerol para armazenar a -20 ° C durante períodos mais longos. Neste ponto e esperando a perda de pelo menos 70% durante os passos anteriores, The octâmero concentração deve estar na gama de 20 - 50 um.
  2. reconstituição nucleosome
    1. Se octâmero foi armazenada em 50% glicerol, dializar durante a noite a 4 ° C contra o tampão de re-enrolamento antes de prosseguir com a reconstituição nucleossoma.
    2. Ajuste de ADN (contendo uma sequência de nucleossomas posicionamento) concentração de sal para NaCl a 2 M, utilizando uma solução stock de 5 M de NaCl.
      NOTA: O ADN purificado quer isolado depois da purificação de um plasmídeo que contém várias cópias da sequência desejada ou sintetizados por amplificação por PCR deve ser armazenado concentrada para ~ 50 uM em água ou um tampão de Tris-EDTA padrão.
    3. Misture e octâmero de ADN utilizando a razão óptima determinada a partir de um teste em pequena escala. Utilize tampão de re-enrolamento para ajustar o volume final de ~ 3,0 mL. Sempre adicionar o octâmero última para evitar qualquer possibilidade de misturar o octâmero e o ADN a <concentrações de 2 M de sal.
      1. Execute inicial pequeno-screconstituições ale para determinar o octâmero: rácio de DNA que leva a rendimentos óptimos de nucleossomas. Para isso, reúnem três reacções de 0.9: 1.0 e 1.0: 1.0 e 1.1: 1.0: ADN octâmero proporções em um volume entre 50-100 mL. Tipicamente, usar uma concentração de 5 uM de ADN.
      2. Continuar com a reconstituição, tal como descrito abaixo (passos 1.2.4-1.2.8) e, no final, estimar a quantidade de nucleossomas solúveis reconstituído qualidade boa e por medição da concentração de ADN a 260 nm e por execução de um gel de ADN-PAGE nativa 6% , corado com brometo de etídio, respectivamente (Figura 5A).
    4. Transferir a mistura para uma membrana de diálise de corte de 6 kDa-e dializar contra um tampão de L de redobragem durante a noite a 4 ° C.
    5. Reduzir a concentração de sal do tampão de diálise de um modo passo a passo a partir de 2, a 0,85, 0,64, e 0,2 M de NaCl, respectivamente. Mantenha a amostra em cada tampão durante pelo menos 3 h. Às vezes precipitado é formado depois da última transição. Neste caso continue diálise como planeado e remover o precipitado por centrifugação microcentrífuga no final do passo seguinte.
    6. Transferência de membrana de diálise numa proveta com 1 L de tampão de ensaio (25 mM de NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 a pH 6,8, NaCl 25 mM, DTT 2 mM) e continuar a diálise O / N a 4 ° C.
    7. Recolha de amostra, remover qualquer precipitado formado no passo 1.2.5 por centrifugação numa microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C no máximo de velocidade e concentrado utilizando uma unidade de filtro de centrífuga de 30 kDa-corte para um volume final de ~ 300 mL.
    8. Medir a concentração de ADN, a 260 nm, correr num gel de 18% de proteína SDS-PAGE (4 mL de amostra) e um gel de 6% de ADN-PAGE nativa (0,2 uL de amostra) e amostra armazenar a 4 ° C durante várias semanas. A concentração final deverá estar na gama de 10-20 pM.

2. Análise de RMN de reacções de modificação nos dois Histones irmã

NOTA: Atribuição de2D espectros de 1 H-15 N correlação das caudas das histonas nucleossomais podem ser encontradas em referências 16, 17, 18. Além disso, as atribuições de canais x grupos de lisinas, serinas e treoninas na 2D 1 H- 13 C espectros de correlação podem ser encontrados em 16 de referência.

  1. Configuração e registo de espectros de referência NMR
    NOTA: Os ensaios enzimáticos foram realizados utilizando 140 mL da amostra de nucleossoma em tampão de ensaio para um tubo de RMN de 3 mm a 300 K. diferentes tubos de RMN com outros volumes de amostra podem também ser usados. A temperatura acima mencionada é adequado obter boa qualidade 1 H- 15 N correlação espectros das caudas das histonas nucleossomais e boas atividades enzimáticas. 2D-SOFAST-HMQC 1H-15N HSQC e 2D-1 H- 13 C espectros foram registados, respectivamente, com uma configuração de Tchapéu confere tempos de aquisição similares. Os parâmetros de aquisição típicos são transientes com 128 1,024 (1 H) x 128 (15 N) pontos complexos e 32 transientes com 1,024 (1 H) x 64 (13 C) pontos complexos para os dois tipos diferentes de espectros de correlação. Para ambos os espectros 2D, o tempo de aquisição foi de ~ 30 min.
    1. Definir 300 K como a temperatura da amostra no espectrômetro. Adicionar 10% de D 2 O (v / v) para a amostra a ser utilizada para o bloqueio de frequência espectrómetro.
    2. Colocar a amostra no espectrómetro e realizar operações básicas (bloqueio, tuning, calços). Além disso, determinar comprimentos de pulsação óptimo e os parâmetros gerais de aquisição.
    3. Ficha 1D e 2D 1 H- 15 N e 1 H- 13 C espectros de referência.
    4. Processo de espectros de referência e assegurar que os sinais a serem utilizados para o mapeamento das reacções de modificação são bem resolvida e tem boas intensidades.
    5. Recuperar amostra e transferir it para um tubo de microcentrífuga.
  2. Configuração da reacção enzimática, monitorização RMN e análise quantitativa
    1. Copiar e organizar uma série de 2D intercalados 1 H- 15 N e 1 H- 13 C espectros. Alvo para um tempo total de aquisição de várias horas e ajustar em conformidade, de uma nova execução com base nas taxas enzimáticas obtidas a partir da primeira reacção.
    2. Adicionar à amostra os co-factores necessários para o respectivo tipo de reacção de modificação (1 mM de ATP / 2 mM de MgCl2 para a fosforilação, 1 mM de acetil-CoA para a acetilação, o SAM 1 mM para a metilação, etc.).
    3. Adicionar a enzima de interesse, misture por pipetagem, transferir a amostra de volta no tubo de RMN e, posteriormente, o espectrómetro (executar essas operações rapidamente).
      NOTA: Se não há dados sobre a actividade enzimática esperado, ajustar o substrato-enzima a razão molar de 10: 1. Realizar um primeiro ensaio de funcionamento e ajustar em conformidade paraa execução real.
    4. Executar uma shimming automática rápido e usar o resto dos parâmetros a partir dos espectros de referência.
    5. Inicia-se a série de 2D intercalada 1 H- 15 N e 1 H- 13 C espectros.
    6. Seguir o progresso da reacção em tempo real e parar de aquisição, quando a reacção atinge conclusão ou de um nível desejado.
    7. espectros processo como antes, com exatamente os mesmos parâmetros.
    8. Repita a corrida inteira usando uma ordem de aquisição diferentes para os dois tipos de espectros de correlação. Se no primeiro experimento uma correlação 1 H- 15 N foi o primeiro da série, começar agora com uma correlação 1 H- 13 C. Por esta e tendo o mesmo tempo de aquisição para ambos os espectros, é possível traçar e comparar reacções PTM em ambas as histonas isotopicamente marcados diferencialmente sobre a mesma escala de tempo. Além disso, é possível calcular as médias e barras de erro trama.
      NOTA: A thorough descrição das metodologias de análise do sinal de NMR e subsequente quantificação de reacções enzimáticas pode ser encontrada aqui 19.
    9. Seleccionar sinais de RMN a partir de cada espectro de RMN tempo-curso que relatam a progressão da reacção e calcular as suas intensidades de sinal relativas, utilizando um software de visualização e de análise para os espectros de RMN. Faça isso por sinais que relatam o não modificado, bem como o estado modificado. Extrair níveis de modificação.
    10. Traçar os valores calculados de níveis de modificação contra o tempo de reacção.

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Representative Results

Octam�ica espécies correctamente redobradas são isolados após uma corrida de reconstituição a mistura através de uma coluna de filtração em gel (Figura 2). A piscina octam�ica reconstituído contendo os três tipos diferentes de octâmeros é submetido ao esquema de purificação por afinidade em tandem. As amostras são recolhidas a partir de todas as etapas e analisadas por SDS-PAGE e subsequentemente WB. A verificação da correcta execução do protocolo que resulta no isolamento de espécies assimétrica é conseguida seguindo a presença dos dois marcadores de afinidade (His) e Streptomyces nas diferentes amostras (Figura 3). Subsequentemente, as marcas de afinidade são removidos após a digestão de protease TEV (Figura 4). oct�eros assimétricas eliminados marcas de afinidade são utilizados para reconstituir nucleossomos assimétricas. Inicialmente, uma pequena reconstituição escala de teste é utilizado para determinar a razão molar óptima de ADN: octâmero que resulta numa altarendimento de formação de um complexo monodispersa. Subsequentemente, a proporção de mistura optimizado é utilizada para reconstituir nucleossomas numa grande escala. Reconstituições de nucleossomas são analisados por proteína / géis de ADN e espectroscopia de RMN para a montagem correcta e a presença das histonas H3 irmã isotopicamente marcados diferencialmente, respectivamente (Figura 5). Um exemplo de aplicação é representado na Figura 6. Particularmente, marcado diferencialmente isótopo-assimetricamente e fosforilado em H3S10 nucleossomas são feitos reagir com GCN5 acetiltransferase, e acetilação de H3K14 em ambas as cópias H3 é seguido em tempo real por espectroscopia de RMN. A análise revela que estimula a fosforilação H3S10 H3K14 acetilação por GCN5 em comparação com cis em trans.

figura 1
Figura 1: Diagrama de fluxo para a preparação de l-diferencialmente Isotopeabeled (e assimetricamente Modificada) Nucleosomes. (A) A reconstituição e de afinidade em tandem purificação da diferencialmente (e assimetricamente modificado) marcada com isótopos oct�eros histonas. (B) a reconstituição Nucleosome combinando os octâmeros assimétricos purificado e uma sequência de ADN de nucleossomas posicionamento. (C) RMN de monitorização em-cis-trans e em diafonia modificação após a mistura dos nucleossomas marcados com isótopos assimetricamente modificados diferencialmente e com enzimas de modificação de histonas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Reconstituição da histona oct�eros. Um perfil de eluição de filtração em gel da mistura redobrada histona. O pico principal em ~ 70 mL corresponde aos octâmeros histonas. A 14 - 20% de gel de gradiente de SDS-PAGE (coloração com Azul de Coomassie) das fracções eluídas correspondentes ao pico do octâmero mostra a estequiometria correcta histona. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Purificação de histona assimétricas octâmeros. 14-20% de gel de gradiente de SDS-PAGE (coloração Coomassie) e WB contra os His e marcadores de afinidade Streptomyces das amostras dos diferentes fases do esquema de purificação por afinidade em tandem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figura Figura 4: Remoção da afinidade Tag. 18% de gel SDS-PAGE (coloração Coomassie) de octâmeros histona assimétrica purificados antes e após a mistura com a protease TEV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Bioquímica e RMN Caracterização de Nucleosomes diferencialmente Isotope marcado. (A) em gel de ADN-PAGE nativa 6% (coloração com brometo de etídio) de uma reconstituição nucleossoma escala pequena do teste usando diferentes razões molares de ADN: octâmero (esquerda). gel de 6% de ADN-PAGE nativa (coloração com brometo de etídio) de um nucleossoma reconstituição em larga escala utilizando a ADN optimizada: octâmero razão molar (direita). (B) 18% de gel de proteína SDS-PAGE (coloração Coomassie) de nucleossomas reconstituídos mostra a estequiometria correcta dos quatro histonas nucleares. (C) 1 H 15 N SOFAST-HMQC espectro da cópia H3 15 N-rotulados de nucleossomas isotopicamente marcados diferencialmente (apenas H3 resíduos de cauda são visíveis - o núcleo proteico é invisível, devido à taxa lenta caindo). (D) 1 H- 13 C espectro de HSQC da cópia H3 13 marcado com C de nucleossomas isotopicamente marcados diferencialmente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: RMN Monitoramento de In cis e em trans Modificação Cross-talk imposto pelos Asymmetric A fosforilação de H3S10 no H3K14 acetilação Atividade de GCN5 acetiltransferase. (A) Representação esquemática de diferencialmente e assimetricamente fosforilada em H3S10 nucleossomas feito reagir com GCN5 acetiltransferase e mapeamento acetilação H3K14, em cis e trans em marcada com isótopos. (B) 1 H- 15 N SOFAST-HMQC e 1 H- 13 C espectros HSQC (regiões selecionadas) dos nucleossomos assimétricas antes e depois da reacção com GCN5. (C) a monitorização RMN resolvida no tempo de H3K14 acetilação por GCN5 em nucleossomos assimetricamente H3S10 fosforilada. As médias e variação (barras de erro) de dois experimentos independentes são mostrados. Reproduzido com permissão 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

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Discussion

Para a reconstituição nucleossomo, o protocolo atual utiliza um modelo de DNA longo de 165 pb contendo o 601-Widom sequência posicionamento nucleosome 20, mas o desempenho semelhante é esperado usando vários comprimentos de modelos de DNA. O protocolo foi projetado e ao serviço que utilizam tipos assimétricos de histona H3. Com o mesmo princípio, o método pode ser aplicado também a outras histonas nucleares e, adicionalmente, pode ser utilizado para reconstituir os complexos que transportam duas histonas de núcleo distintas com diferentes etiquetas de isótopos. O protocolo também pode ser ligeiramente modificado para reconstituir inicialmente histona sub-complexos e não histona directamente octâmeros. Após esta modificação, tetrâmeros H4-H3 assimétricos pode ser reconstituída, empregando o mesmo esquema de purificação em tandem. Estes últimos são misturados com dímeros H2A-H2B reconstituídos separadamente e ADN de montar 16 nucleossomas. Os rendimentos finais e o desempenho geral do PROTOC modificadool são similares ao original.

O protocolo é fortemente dependente da capacidade das duas colunas de afinidade para se ligar de forma eficiente as espécies relevantes e, assim, para se obter no final complexos assimétricos altamente puros. É pesado para fornecer a prova directa e concreta de que o complexo purificado final é de fato e só assimétrica. No entanto, a análise de WB amostras de todos os passos de purificação com os anticorpos relevantes fornece indicações fiáveis para o sucesso do esquema de purificação em tandem (Figura 3). Os mesmos resultados, e, por conseguinte, garantia adicional, foram obtidos através da análise das mesmas amostras quanto à presença dos marcadores de afinidade por métodos de RMN 16. Ainda assim, se a análise WB indica contaminação de espécies assimétricas com os simétricos, uma pequena variação pode ser aprovada na primeira etapa de purificação (Ni-NTA) que pode melhorar o resultado. Em particular, em vez de uma eluição isocrática, um gradien imidazol t eluição (10-250 mM) podem ser empregues e, em seguida, apenas as primeiras fracções de eluição que estão altamente enriquecidas em espécies assimétricos são reunidas e executado através da coluna de afinidade. Isto pode ser avaliado por análise de WB das fracções de eluição para a presença da etiqueta de afinidade strep.

A selecção do rótulo isótopo em relação ao PTM de interesse é bastante flexível, porque para a maioria dos casos, NMR é capaz de mapear o mesmo PTM usando tanto um H- 15 N e 1 H- 13 Ccorrelation espectros. No entanto, para alguns aminoácidos, como lisinas, a dispersão de desvio químico para as 13 ressonâncias H-1 de cadeia lateral C é bastante limitado. Além disso, quando os locais alvo de uma enzima de modificação de lisina são desconhecidos, específica do local de leitura de lisina PTMs não é simples. Nestes casos, os métodos alternativos de empregar-C rotulagem local selectivo 13, combinada com a produção de histona semi-sintético"> 21 ou a utilização de sequências de impulsos de RMN recentemente estabelecidas que permite a detecção específica de estados de modificação através da excitação selectiva rotinas 22. Espectroscopia de RMN confere bastante baixa sensibilidade. A este respeito, são necessárias quantidades relativamente elevadas de nucleossomas (gama uM) para executar a reacções enzimáticas. Isso impede que a evolução do método para uma instalação de alto rendimento.

Ao mesmo tempo, um novo método químico foi introduzido para a síntese de nucleossomas quimicamente puras, modificadas de forma assimétrica, com rendimentos elevados, levando definido PTMs 23. Esta abordagem tem sido utilizada, em combinação com fluorografia, para estudar os mecanismos de diafonia da PTM. Devido à baixa capacidade de resolução de métodos filmogra na detecção PTMs, as conclusões foram derivadas indiretamente, comparando atividades enzimáticas globais sobre um conjunto de nucleossomos que transportam diferentes combinações de PTMs simétricas e assimétricas, em veznão por observação direta das reações da PTM nos locais correspondentes de cada histona irmã. No entanto, a incorporação de histonas isotopicamente marcados eo uso de espectroscopia de RMN para a PTM leitura poderia constituir o método acima mencionado uma ferramenta adicional para análise PTM de alta resolução de nucleossomos assimetricamente modificados.

Em conexão com a identificação de novos tipos de nucleossomos assimetricamente modificados no futuro, o actual método visa constituir um instrumento de alta resolução para analisar em cis e em reações de trans crosstalk PTM em substratos nucleossomais. Particularmente, de grande importância é a decodificação do mecanismo de crosstalk que dão origem a nucleossomos bivalentes 24 que contêm de forma assimétrica, ambos PTMs transcricionalmente ativos e repressivas.

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Acknowledgements

O autor agradece o Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlim) para fornecer espaço de wet-lab e infra-estrutura para realizar experimentos e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para financiar o trabalho através de uma bolsa de investigação (LI 2402 / 2-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidinium HCl Applichem A14199 Use high quality Gu-HCl
Tris  Roth 4855.2
DTT Applichem A1101
NaCl VWR chemicals 27810.364
EDTA Roth 8043.2
Na2H2PO4 Applichem A1046
NaH2PO4 Applichem A3902
Imidazole Applichem A1073
d-Desthiobiotin Sigma D1411
Ni-NTA Superflow Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow IBA 2-1207-001
His-probe antibody Santa Cruz sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP IBA 2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28-9893-35
6 - 8 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 1, 132650
50 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 7, 132129
10 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC901024
30 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC903024
Solution-state NMR spectrometer  at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe
Buffer name Component
Unfolding Buffer 7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7.5
10 mM DTT
Refolding Buffer 10 mM Tris, pH 7.5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Assay Buffer 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8
25 mM NaCl
2 mM DTT

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References

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