Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Cancer Research

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Summary

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

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Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

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Abstract

A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratón subcutáneo tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratones ortotópicos para superar estas limitaciones; Sin embargo, estos modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos huecos como el intestino grueso. Con el fin de producir tumores uniformes que crecen de forma fiable y metástasis, las técnicas estandarizadas de preparación e inyección de células tumorales son críticas.

Hemos desarrollado un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal (CRC) que desarrolla tumores muy uniformes y puede ser utilizado para estudios de biología de tumores, así como ensayos terapéuticos. Se inyectan células tumorales de tumores primarios, líneas de células bidimensionales (2D) o organoides tridimensionales (3D) en el ciego y, dependiendo del potencial metastásico de las células tumorales inyectadas, forman tumores altamente metastáticos. En adición,Los CTC se pueden encontrar regularmente. Aquí describimos la técnica de preparación de células tumorales tanto de líneas celulares 2D como de organoides 3D, así como el tejido tumoral primario, las técnicas quirúrgicas y de inyección, así como el aislamiento de CTCs de los ratones portadores de tumores y los consejos actuales para la resolución de problemas.

Introduction

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en los países occidentales. 1 Mientras que el tumor primario a menudo puede ser resecado, la aparición de metástasis distantes empeora drásticamente el pronóstico y a menudo conduce a la muerte. 2 , 3 El correlato biológico de la metástasis son las células tumorales circulantes (CTC), que se separan del tumor, sobreviven en la circulación, se adhieren al epitelio en el órgano diana, invaden el órgano y en última instancia, crecen a nuevas lesiones. 4 Aunque se sabe que los CTC son de relevancia pronóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 su biología sólo se entiende en parte como resultado de su extrema rareza en la CRC. 10

Los modelos de ratón son un poderoso tOol para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer. Los modelos clásicos de tumores subcutáneos se producen mediante inyección subcutánea de células tumorales en ratones receptores, que pueden ser inmunocompetentes (si se utilizan células tumorales murinas singénicas) o inmunodeficientes. Los modelos de tumor subcutáneo son baratos y producen datos rápidamente; Su crecimiento tumoral de punto final puede ser medido fácilmente y no invasivamente. Sin embargo, el 88% de los nuevos compuestos que han demostrado actividad antitumoral en estos modelos fallan en ensayos clínicos. 11 Esto es en parte debido a las diferencias entre especies entre humanos y ratones; Sin embargo, una gran parte de este fracaso se debe al bajo valor predictivo de los modelos de ratones subcutáneos.

Los modelos de ratones ortotópicos, en los que las células tumorales se inyectan en el órgano de origen y, por tanto, crecen en su microambiente original, se utilizan cada vez más en la investigación del cáncer. 11 , 12 , 13 , 14 Los modelos ortotópicos no sólo simulan las condiciones locales de crecimiento tumoral; Como resultado del sitio anatómicamente correcto del crecimiento tumoral, los modelos de ratón ortotópico también permiten la simulación realista de la metástasis y por lo tanto se usan para estudiar la biología del CTC 8 , 15 , 16 o su respuesta a diferentes tratamientos en la CRC. 13 , 17

Una de las principales desventajas de los modelos de ratones ortotópicos es su complejidad técnica. Dependiendo del órgano en el que se van a inyectar las células, la curva de aprendizaje hasta que el experimentador es capaz de inducir tumores reproducibles es bastante larga. Esto se aplica especialmente a los modelos de cáncer colorrectal, ya que las células tumorales necesitan ser inyectadas en la pared intestinal, lo que a menudo produce perforación, pérdida de células tumorales o pérdida endoluminal de células tumorales. Esto unEl objetivo de este artículo es describir el método de preparación celular a partir de muestras de tejido primario, líneas celulares 2D y cultivo organoide 3D y su inyección en el ciego de ratones. La técnica descrita aquí conduce a tumores muy uniformes y, dependiendo de la biología tumoral de la línea celular utilizada para inyección, la formación reproducible de metástasis a distancia y CTC en los ratones receptores. 15

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Protocol

Los experimentos con animales presentados aquí fueron revisados ​​y permitidos de forma independiente por un Comité de Cuidado de Animales y Uso Animal institucional y gubernamental y fueron conducidos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA). Se tomaron todas las medidas posibles para minimizar el sufrimiento, incluyendo anestesia y analgesia o, si es necesario, eutanasia prematura.

1. Preparación de células y organoides

NOTA: Utilice un volumen de 20 μL con 100.000 células para cada inyección. Utilizar la matriz de la membrana basal (BMM) para evitar fugas y asegurar la inyección estandarizada. Para asegurar resultados reproducibles, realice ensayos de autenticación de líneas celulares ( por ejemplo , mediante perfiles STR) a intervalos regulares.

  1. Preparación de suspensiones celulares primarias a partir de tejido fresco
    NOTA: Siempre trabaje bajo condiciones estériles. La transferencia inmediata de losEl tejido resecado de la sala de operaciones al laboratorio sobre hielo es necesario para asegurar la alta viabilidad de las células.
    El bienestar del paciente y el tratamiento óptimo deben ser siempre la primera prioridad. Por lo tanto, las muestras de tejido para la investigación deben obtenerse de una manera que no interfiera con el posterior tratamiento patológico y estadificación del tumor resecado. En la mayoría de los casos, por lo tanto, es razonable tener las muestras para la investigación obtenida por un patólogo entrenado con el fin de garantizar la no interferencia con el diagnóstico patológico.
    1. Inmediatamente después de la extracción estéril de la muestra resecada (idealmente ~ 1 cm 3 ), coloque la muestra de tejido en un tubo de 50 mL previamente llenado con 20-30 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Guarde el tubo en hielo y transfiéralo inmediatamente al laboratorio.
    2. Poner el tejido en una placa de Petri y lavar dos veces con un montón de PBS para eliminar la sangre restante.
    3. Cortar el tejido en trozos pequeños (~ 2-4 mm) con una scaLpel ( por ejemplo , con una cuchilla # 20 o # 36).
    4. Utilizar el disociador de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de disociar aún más el tejido tumoral a una suspensión de una sola célula. Alternativamente, utilice otros protocolos de digestión enzimática del tumor.
    5. Contar las células de la suspensión de una sola célula resultante ( por ejemplo , en un contador de cuchillas o un hemocitómetro).
    6. Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
    7. Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 6 células / mL y mantenerlos en hielo.
  2. Preparación de líneas celulares para inyección
    1. Cultivar todas las líneas celulares de cáncer colorrectal en condiciones normales de cultivo (37 ° C, 5% CO 2 ) y prepararlas el día de la cirugía.
    2. Cosechar las células de acuerdo con los protocolos de cultivo de células estándar, contar las células ( por ejemplo , en un contador de cuchara o un hemocitómetro) y calcular la demandaCantidad necesaria para todas las inyecciones dependiendo del número de animales a inyectar.
    3. Prepare 3-5x del volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo y el volumen muerto de la jeringa de inyección.
    4. Centrifugar (5 min a 1.500 g) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
    5. Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 6 células / mL y mantenerlos en hielo.
  3. Preparación de los organoides
    NOTA: Todos los cultivos organoide 3D se cultivan en condiciones de cultivo estándar (37ºC, 5% CO 2 ). Ya se han publicado protocolos detallados para el cultivo de organoides. 18 , 19 , 20 Similar a las líneas celulares convencionales, se recomienda un volumen de 20 μL de BMM con 100.000 células por inyección. Los organoides se preparan el día de la cirugía como sigue:
    1. Preparar el siguiente medio (en los siguientesA DMEM / F12 +++): Medio de Eagle modificado de Dulbecco avanzado (DMEM) / F12 + 1% de HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Pre-llenar tubos de 15 mL con 1 mL de DMEM / F12 +++.
    3. Aspirar cuidadosamente los organoides de la superficie de la placa de cultivo y transferir el contenido de 3 a 5 pocillos en un tubo de 15 ml.
    4. Cuidadosamente romper las organoides en trozos más pequeños por pipetearlos arriba y abajo con una pipeta de vidrio extendida.
    5. Añadir 5 mL de DMEM / F12 +++ al tubo, seguido de centrifugación a 1.000 xg durante 5 min.
    6. Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante, se resuspende el sedimento en 600 μl de tampón de disociación enzimática y se transfiere la suspensión a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
    7. Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos y luego cuidadosamente pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo con el fin de disolver los organoides.
      NOTA: Verificar la digestión a través del microscopio; Se completa cuando todos los clusters de células se han disociadoD a las células individuales.
    8. Tras la digestión exitosa, agregar 1,4 ml de DMEM / F12 +++ para detener la digestión. Luego transferir todos los pocillos de organoides digeridos a un tubo de 50 ml.
    9. Cuente las células y calcule la cantidad requerida para todas las inyecciones.
    10. Prepare de 3 a 5 veces el volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteado y el volumen muerto de la jeringa de inyección
    11. Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
    12. Se resuspendieron las células en BMM a una concentración de 5 x 106 células / mL y se mantuvieron en hielo.

2. Modelo de ratón ortotópico

  1. Preparación de los animales receptores para la cirugía
    NOTA: Utilice como destinatarios a los ratones NOD.Cg-Prkdc scid de 6 a 8 semanas de edad como ratones II2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). 21 NSG están entre los ratones más inmunocomprometidos, carecen de células maduras B, T y NK junto con otros múltiples inmunes.Los efectos. 21 Ellos crecen de forma fiable los tumores incluso si se inyectan bajo número de células y son muy propensos a la metástasis a distancia. Los ratones NSG son excelentes reproductores y pueden mantenerse en unidades convencionales libres de patógenos específicos (SPF).
    1. Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
    2. Utilice sevoflurano al 3-3.5% en volumen para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pinza del dedo del pie indica suficiente anestesia.
    3. Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
    4. Detenga los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña.
    5. Afeitar el abdomen con una máquina de afeitar eléctrica (la crema depilatoria se puede utilizar alternativamente) y desinfectar con al menos 3 veces clorhexidine / yodo y alcohol del 70% alternativamente.
    6. Cubrir el campo quirúrgico con cortinas estériles.
      NOTA: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las pautas institucionales.
  2. Laparotomía de la línea media y la exposición del ciego
    1. Use tijeras (los bisturíes se pueden usar alternativamente) para hacer una pequeña incisión de la línea media (3 - 5 mm) de la piel en el bajo abdomen. Recoger la musculatura de la pared abdominal con fórceps y cuidadosamente incise con tijeras, abriendo así la cavidad abdominal.
    2. Identificar y cuidadosamente exteriorizar el ciego con pinzas atraumáticas. Coloque la bolsa de terminación ciega del ciego en el abdomen apuntando cranealmente.
    3. Una vez exteriorizado, mantenga el ceco húmedo utilizando hisopos salinos tibios en todo momento.
  3. Inyección ortotópica, cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
    1. Para inyección intracecal, use una jeringa estándar de 1 ml con una cánula de 30 G. Monte esta jeringa en una bomba de microinyección, que a su vez se monta en un micromanipulador.
    2. Cuidadosamente agarre la punta del ciego con fórceps atraumático y suavemente suavizarlo acariciándolo downwarD con un segundo conjunto de fórceps humedecido con solución salina caliente.
    3. Coloque la cánula directamente sobre el ciego.
    4. Realice los siguientes pasos bajo control visual con un microscopio quirúrgico binocular.
    5. Coger con cuidado el ciego con dos pinzas atraumáticas en ambos extremos de la parte exteriorizada del ciego, estirarlo ligeramente y luego tirar lentamente sobre la cánula que se coloca paralelo y directamente encima. Es crucial no perforar toda la pared intestinal (inyectando así las células en el lumen), así como no perforar la serosa más allá del punto inicial de penetración, ya que esto conduciría a la fuga ya la diseminación peritoneal.
      1. Mueva el intestino hacia la cánula, no la cánula hacia el intestino. Sostenga y estire el intestino entre dos fórceps. Las manos del cirujano deben descansar sobre una superficie para reducir el temblor.
    6. Inyectar las células entre la serosa (visto como un revestimiento muy fino y translúcidoE intramurales) y la muscular. Por lo tanto, la cánula debe colocarse visualmente por encima de los vasos sanguíneos y por debajo de la delgada membrana translúcida.
    7. Utilice un interruptor de pie para iniciar la inyección con el fin de reducir el temblor mientras la cánula está dentro de la pared intestinal.
    8. Una vez que la cánula está en posición, iniciar la inyección. Utilice una duración de 20 s, resultando en un ajuste de 1 μl / s en la unidad de control de la bomba.
      NOTA: La inyección en o cerca de un vaso sanguíneo dañado conduce a diseminación intravascular directa ya metástasis a distancia y por lo tanto debe evitarse.
    9. Después de completar la inyección, retire cuidadosamente la cánula tirando hacia atrás.
    10. Coloque un hisopo seco debajo del ciego, y luego enjuague completamente el ciego con agua destilada con el fin de lisar las células filtradas y evitar así la difusión peritoneal artificial.
  4. Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
    1. Después de rInsing, devolver suavemente el ciego a la cavidad abdominal.
    2. Cierre la pared abdominal con suturas corrientes de absorción rápida de 6-0.
    3. Cierre la piel con clips para heridas quirúrgicas.
    4. Coloque el ratón en un mapa de calefacción establecido a 38 ° C hasta que se ha recuperado completamente de la anestesia.
    5. Observar de cerca el estado postoperatorio de los ratones durante las siguientes 48 h. En caso de malestar, tratar con 0,05 mg / kg de buprenorfina cada 12 h.
    6. Vigilar a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento del tumor.

3. Aislamiento de células tumorales circulantes de muestras de sangre entera

NOTA: Obtenga sangre por punción cardiaca transcutánea en ratones anestesiados, seguida de eutanasia. Idealmente, se inyectan 1.000 μl de sangre en una jeringa precargada con 100 μl de un anticoagulante (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o heparina). Utilizar un anti-humano-EpCAM (adhesión de células epitelialesMolécula) para identificar los CTC. Esto funciona muy bien si se usan líneas de células epiteliales humanas en el modelo de ratón. Para otros aparatos, pueden ser necesarios diferentes anticuerpos.

  1. Enriquecimiento de CTC:
    1. Pre-llene los tubos de 15 mL con 5 mL de medio de gradiente de densidad y transfiera cuidadosamente la sangre al tubo de 15 mL.
    2. Centrifugar (30 min a 300 xg sin freno) y retirar cuidadosamente el sobrenadante superior.
    3. Verter el resto en un nuevo tubo de 15 ml y centrifugar (15 min, 300 xg con freno).
    4. Recuperar la interfase que contiene las células mononucleares (descarte el resto) y lavar las células dos veces con PBS.
    5. Resuspender el sedimento en 200 μL de PBS / 1% de EDTA y añadir 4 μl de anticuerpo EpCAM. Incubar 20 min en hielo en la oscuridad.
  2. Tamizaje y selección
    1. Preparar el siguiente tampón (en lo siguiente denominado tampón de recogida): PBS + 10% de suero de ternera fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
    2. Utilice un lápiz PAP para dibujar un círculo de ~ 1 cm en una placa de Petri estéril de 6 cm (evita que el líquido se disperse en el plato) y pipetee 700 μl de tampón de recogida en este círculo.
    3. Añadir 50 μl de suspensión celular al tampón de recogida de 700 μl dentro del círculo. Compruebe la densidad de las células con el microscopio. Dividir la muestra en platos diferentes si es demasiado densa.
    4. Espere a que las células se establezcan (~ 5 min).
    5. Muestre la gota de la suspensión celular para las células teñidas (= EpCAM-positivas).
    6. Una vez que se encuentra una célula, recoger la célula con el micromanipulador y ponerlo en 50 μ l de buffer dependiendo de la intención de análisis aguas abajo ( por ejemplo , RNA extracción de amortiguación o medio de cultivo).
    7. Dependiendo de los análisis de aguas abajo, aislar las células EpCAM negativas y / o el medio como controles negativos.
    8. Proceder con análisis de aguas abajo ( por ejemplo , cultivo celular, PCR).

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Representative Results

La generación exitosa y reproducible de tumores colorrectales en este modelo depende en gran medida de una inyección precisa de las células sin derrames o fugas. Si esto se consigue, este modelo es extremadamente fiable y rara vez da lugar a la diseminación peritoneal artificial. La cinética de crecimiento de los tumores, así como sus patrones de diseminación dependen de la biología de los organoides y células utilizados. 15 Mientras que las células HCT116 metastatizan fiablemente en el hígado en este modelo, las células SW620 forman tumores ortotópicos, pero no se metastatizan. 15

El uso de células HCT116 en este modelo confiablemente resultados ratones moribundos dentro de los 35 días de la inyección de células tumorales. Los tumores primarios miden aproximadamente 10 mm de tamaño ( Figura 1A y Figura 2A ], metástasis hepáticas ( Figura 1B Y la Figura 2B ), las metástasis pulmonares ( Figura 1C y Figura 2C ) y las células tumorales circulantes ( Figura 3 ) están casi invariablemente presentes. En ratones portadores de tumores HCT116, 35 días después de la inyección de células tumorales, los CTC están presentes en alta frecuencia y cantidad y pueden aislarse fácilmente para análisis posteriores ( Figura 3 ).

Figura 1
Figura 1: Imágenes macroscópicas después de la disección 35 días después de la inyección ortotópica de células humanas de CRC de HCT116 en ratones NSG. ( A ) Tumor primario (línea discontinua) en el ciego. ( B ) Hígado con múltiples metástasis. ( C ) Metástasis pulmonar (flechas).1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Imágenes histológicas de los órganos mostradas en la Figura 1 . ( A ) Tumor primario (H & E). ( B ) Metástasis hepática (H & E). ( C ) Metastasis pulmonar (inmunohistoquímica anti-EpCAM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Células tumorales circulantes (células HCT116 en ratones NSG, 35 días después de la inyección de células tumorales). Campo brillante ( A B )) de CTCs en la fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A pesar de su actividad preclínicamente probada en los modelos de ratones subcutáneos, la gran mayoría de los nuevos compuestos fallan en ensayos clínicos y nunca llegan a la clínica. 11 Esta insuficiencia evidente de modelos subcutáneos de ratón para simular con precisión los patrones de la biología y de crecimiento de los tumores ha conducido al desarrollo de modelos ortotópicos ratón basa en la inyección de las células tumorales directamente en el órgano original.

Los modelos de ratones ortotópicos son capaces de simular la biología y la diseminación de tumores sólidos con mucha mayor precisión que los modelos subcutáneos. 15 Sin embargo, las principales desventajas son mala reproducibilidad especialmente en los órganos técnicamente exigentes tales como órganos huecos, así como la monitorización técnicamente exigente de la crecimiento del tumor. En nuestro modelo, por lo tanto, nos hemos centrado en el tamaño del tumor en un momento predefinido en lugar de repetidos procedimientos de imagen, lo que limita el número de técnicasPara los exámenes estresantes de los animales. El modelo aquí descrito puede ser utilizado para diversas aplicaciones tales como la caracterización de líneas celulares tumorales, 15 investigación de la biología tumoral y la difusión, así como ensayos terapéuticos. 17 Los puntos finales obvios son el tamaño del tumor primario y el número de metástasis a distancia, pero también se pueden emplear puntos finales más elaborados, como números de CTC 17 o modalidades de imagen.

El paso más crítico de nuestro protocolo es la inyección de células tumorales subserosal. Requiere práctica y debe realizarse en todo momento bajo control visual directo. Si el depósito está en cualquier otro lugar, pero debajo de la serosa, pero por encima de la mucosa, no habrá ningún crecimiento tumoral en absoluto o crecimiento impredecible y la diseminación, haciendo que los resultados sean incomparables. Otras posibles razones de la falta de desarrollo de tumores incluyen células no viables ( por ejemplo </ Em>, debido al largo intervalo de tiempo entre la cosecha y la inyección de las células) o no ratones totalmente singénicos. Esto es posible si se usan ratones C57B1 / 6; Ya que existen múltiples substracciones de C57Bl / 6 ( por ejemplo , C57Bl / 6J y C57Bl / 6N) que muestran diferencias genéticas y fenotípicas 22 que también se reflejan en las tasas de toma de tumores. 23

La técnica de inyección altamente controlada aquí descrita conduce a un crecimiento y diseminación de tumores altamente reproducibles y distingue este modelo de los modelos ortotópicos descritos anteriormente. 24 Además, enjuagando el ciego con agua destilada después de la inyección de las células tumorales reduce drásticamente la tasa de difusión peritoneal artificial; Por lo tanto, si la carcinomatosis peritoneal ocurre en nuestro modelo, es muy probablemente un resultado de la biología de la línea celular en lugar de una filtración de células tumorales iatrogénicas.

Limitaciones de este mOdel son los ratones receptores que tienen que ser inmunodeficientes si se van a utilizar líneas celulares humanas. Esto limita severamente la aplicación del modelo en estudios inmunológicos. Sin embargo, esta limitación puede ser superada mediante el uso de líneas de células murinas singénicas o organoides (datos no publicados). Otra limitación es el uso de las líneas celulares. Las líneas celulares tumorales suelen ser altamente anaplásticas, lo que deja dudas sobre su representatividad de la biología del tumor original. Esta limitación no está presente en los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM), que desarrollan un nuevo tumor mediante la introducción de mutaciones oncogénicas específicas de tejidos. 12 Estos GEMMs se basan generalmente en mutaciones condicionales en la línea germinal ( por ejemplo, un gen Apc floxado) y en la activación mediada por Cre de las mutaciones, ya sea por infección local con adeno-cre 25 , 27 , 28 o un promotor especıfico de tejido conduciendo creexpresión. 29 , 30 , 31 Sin embargo, estos modelos requieren a menudo extensos cruces y tienen una biología muy variable. Si se utilizan líneas celulares primarias en el modelo aquí presentado, la limitación de la baja representatividad puede ser superada sin la pérdida de las otras ventajas de nuestro modelo como la reproducibilidad y la rentabilidad relativa.

Otra limitación de la técnica aquí propuesta es la dependencia de EpCAM como un marcador de superficie. Es bien sabido que EpCAM se puede perder durante EMT y que hay una fracción de CTC que son EpCAM negativo. 10 , 15 Por lo tanto, según el objetivo del experimento y las líneas celulares utilizadas para la inyección, pueden usarse otros medios de identificación ( por ejemplo , marcaje GFP de las células antes de la inyección).

En conclusión, el modelo aquí presentado cEs una herramienta flexible para estudiar el desarrollo y la diseminación de tumores en el contexto del microambiente original del tumor en el colon. Si se utilizan líneas celulares metastásicas, simula fielmente la diseminación de células tumorales en todos los sitios relevantes para el CRC incluyendo CTC en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, es una herramienta útil para estudiar los cambios fenotípicos durante el crecimiento y la diseminación del tumor y permite el aislamiento y la caracterización repetidos de los CTC en la CRC. 15

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la fundación alemana de la investigación (WE 3548 / 4-1) y Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

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References

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