ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

この方法の全体的な目標は、オープンソースのプラットフォームを使用して、ラット全体の筋肉の筋線維の定量を自動的かつユーザーに依存しない方法で迅速かつ確実にガイドすることです。この方法は、骨格筋の老化、病気、または外傷の欠陥に関する神経筋分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、筋線維集団を確実に分析し、筋肉断面の高品質な画像を生成するために使用できることです。

十分に解凍した後、Triton XまたはPBSTを添加したPBSで試料を10分と5分の洗浄で1回、5分間の洗浄で慎重にすすぎます。2回目の洗浄後、切片を2分間風乾します。次に、疎水性ペンを使用して、個々の断面を囲みます。

さらに15分間の自然乾燥後、ヤギ血清を添加したPBSTで非特異的結合を室温で1時間ブロックします。次に、スライドを洗浄し、適切な一次抗体カクテルを各サンプルに加え、光から保護された室温で1時間染色します。インキュベーションの最後に、10分間のPBST洗浄と5分間のPBST洗浄を1回ずつスライドをすすぎます。

次に、光から保護された適切な二次抗体カクテルで筋肉切片を標識します。示されているように、スライドをPBSTで2回洗浄した後、スライドを乾燥させ、製造元の指示に従ってDAPI核染色キットで核を染色します。PBSTを1分間洗浄して余分なDAPIを取り除き、その後短時間自然乾燥させます。

次に、サンプルを蛍光封入剤とカバースリップで覆い、スライドを光から保護された摂氏4度で保存します。染色後24〜48時間以内に、スライドをスライドスキャナーにロードし、プログラムソフトウェアで新しいプロジェクトを開きます。スライドプレビューでは、DAPIチャンネルと2.5倍レンズを選択し、最初の試料に手動で焦点を合わせます。

詳細な取得プロセスに含めるべき各断面を概説し、各チャンネルの露光時間を設定します。次に、自動画像取得を実行し、最初の視野の正しい取得を確認して、自動プロセスの早い段階で誤った取得を防ぎます。画像取得が完了したら、断面のオートフォーカスが正しいこと、および個々のファイバーが明確に区別できることを手動で確認します。

オートフォーカスは、必要に応じてすべての画像に対して手動でチェックおよび修正することが重要です。自動化された筋線維定量化プロセスでは、最適な結果を得るために高品質の画像が必要です。次に、最終的な解析に含める必要があるすべてのクロスセクションについて、DAPIを除く各チャネルをJPEGファイルとして個別にエクスポートし、公開されたチャネルに従ってファイルに名前を付けて適切な名前のフォルダに分類します。

筋線維の定量化プロセスを開始する前に、適切な画像編集ソフトウェアで各画像をプレビューし、染色された線維と背景との間に十分なコントラストがあることを確認します。次に、ImageJ で Plugins>Macros>Edit コマンドを使用してマクロのソース コードを表示し、マクロのソース コード内の各チャネルのフォルダ ディレクトリを変更します。次に、[実行] コマンドを使用してマクロを開始します。

フォルダ内のすべての画像がマクロにロードされ、連続した順序で定量化されます。定量終了時に、結果を適切なスプレッドシートソフトウェアにエクスポートし、正にカウントされた低速、中程度、高速のファイバーの値を特定します。その後、合計ファイバー数を計算できます。

筋線維の免疫蛍光染色は、わずかな交差反応性で迅速であり、結果として得られる画像は、染色された線維と周囲の組織との間に高いコントラストを示し、異なる線維タイプ間で強い区別を示しています。自動分析では、手動分析と比較してプラスマイナス4%の精度で相対的な筋線維集団を検出でき、全体の絶対数は手動分析と比較して高くなります。ただし、相対的なカウントは、プラスマイナス 4% の範囲内で、ほぼ同じままです。

このビデオを見た後、この方法を使用して筋繊維の定量化を自動化する方法についてよく理解しているはずです。DAPIの使用には危険が伴うことを忘れないでください。そのため、染色を行う際には適切な保護具を着用してください。