ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル
March 28th, 2017
ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。
この方法の全体的な目標は、オープンソースのプラットフォームを使用して、ラット全体の筋肉の筋線維の定量を自動的かつユーザーに依存しない方法で迅速かつ確実にガイドすることです。この方法は、骨格筋の老化、病気、または外傷の欠陥に関する神経筋分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、筋線維集団を確実に分析し、筋肉断面の高品質な画像を生成するために使用できることです。
十分に解凍した後、Triton XまたはPBSTを添加したPBSで試料を10分と5分の洗浄で1回、5分間の洗浄で慎重にすすぎます。2回目の洗浄後、切片を2分間風乾します。次に、疎水性ペンを使用して、個々の断面を囲みます。
さらに15分間の自然乾燥後、ヤギ血清を添加したPBSTで非特異的結合を室温で1時間ブロックします。次に、スライドを洗浄し、適切な一次抗体カクテルを各サンプルに加え、光から保護された室温で1時間染色します。インキュベーションの最後に、10分間のPBST洗浄と5分間のPBST洗浄を1回ずつスライドをすすぎます。
次に、光から保護された適切な二次抗体カクテルで筋肉切片を標識します。示されているように、スライドをPBSTで2回洗浄した後、スライドを乾燥させ、製造元の指示に従ってDAPI核染色キットで核を染色します。PBSTを1分間洗浄して余分なDAPIを取り除き、その後短時間自然乾燥させます。
次に、サンプルを蛍光封入剤とカバースリップで覆い、スライドを光から保護された摂氏4度で保存します。染色後24〜48時間以内に、スライドをスライドスキャナーにロードし、プログラムソフトウェアで新しいプロジェクトを開きます。スライドプレビューでは、DAPIチャンネルと2.5倍レンズを選択し、最初の試料に手動で焦点を合わせます。
詳細な取得プロセスに含めるべき各断面を概説し、各チャンネルの露光時間を設定します。次に、自動画像取得を実行し、最初の視野の正しい取得を確認して、自動プロセスの早い段階で誤った取得を防ぎます。画像取得が完了したら、断面のオートフォーカスが正しいこと、および個々のファイバーが明確に区別できることを手動で確認します。
オートフォーカスは、必要に応じてすべての画像に対して手動でチェックおよび修正することが重要です。自動化された筋線維定量化プロセスでは、最適な結果を得るために高品質の画像が必要です。次に、最終的な解析に含める必要があるすべてのクロスセクションについて、DAPIを除く各チャネルをJPEGファイルとして個別にエクスポートし、公開されたチャネルに従ってファイルに名前を付けて適切な名前のフォルダに分類します。
筋線維の定量化プロセスを開始する前に、適切な画像編集ソフトウェアで各画像をプレビューし、染色された線維と背景との間に十分なコントラストがあることを確認します。次に、ImageJ で Plugins>Macros>Edit コマンドを使用してマクロのソース コードを表示し、マクロのソース コード内の各チャネルのフォルダ ディレクトリを変更します。次に、[実行] コマンドを使用してマクロを開始します。
フォルダ内のすべての画像がマクロにロードされ、連続した順序で定量化されます。定量終了時に、結果を適切なスプレッドシートソフトウェアにエクスポートし、正にカウントされた低速、中程度、高速のファイバーの値を特定します。その後、合計ファイバー数を計算できます。
筋線維の免疫蛍光染色は、わずかな交差反応性で迅速であり、結果として得られる画像は、染色された線維と周囲の組織との間に高いコントラストを示し、異なる線維タイプ間で強い区別を示しています。自動分析では、手動分析と比較してプラスマイナス4%の精度で相対的な筋線維集団を検出でき、全体の絶対数は手動分析と比較して高くなります。ただし、相対的なカウントは、プラスマイナス 4% の範囲内で、ほぼ同じままです。
このビデオを見た後、この方法を使用して筋繊維の定量化を自動化する方法についてよく理解しているはずです。DAPIの使用には危険が伴うことを忘れないでください。そのため、染色を行う際には適切な保護具を着用してください。
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概要
この記事では、筋線維の迅速な分析のためのプロトコルを提示し、染色の品質を向上させ、ImageJソフトウェアを使用して筋線維の集団の自動取得と定量化を可能にします。この方法は、ラットの全筋肉における信頼性の高い筋線維の定量化を容易にすることを目的としています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 筋肉生物学
- 定量分析
背景
- 筋線維の集団を理解することは神経筋研究において重要です。
- 骨格筋の欠陥は加齢、疾患、または外傷から生じる可能性があります。
- 既存の方法は信頼性と自動化に欠ける可能性があります。
- このプロトコルはこれらの制限に対処します。
研究の目的
- 自動的でユーザーに依存しない筋線維定量化の方法を開発すること。
- 筋肉横断面の画像品質を向上させること。
- 神経筋分野における重要な質問への回答を支援すること。
使用された方法
- 分析前の筋組織の解凍。
- Triton Xを添加したPBSで組織をすすぐ。
- 切片を空気乾燥し、疎水性ペンで横断面を囲む。
- 分析にImageJソフトウェアを利用する。
主な結果
- このプロトコルは筋線維の集団の信頼性の高い分析を可能にします。
- 筋肉横断面の高品質な画像が生成されます。
- この方法は効率的でユーザー依存性を減少させます。
- 加齢や外傷に関連する筋肉の欠陥に関する洞察を提供します。
結論
- この方法は研究における筋線維の分析を強化します。
- 神経筋疾患の研究のための信頼できるツールを提供します。
- オープンソースソフトウェアの使用は研究におけるアクセシビリティを促進します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Automated quantification of muscle fiber populations using myosin heavy chain immunohistochemistry addresses the need for reproducible, high-throughput tissue phenotyping in preclinical research. This protocol reduces inter-user variability and accelerates data generation, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in neuromuscular and musculoskeletal drug discovery. The approach enables scalable, quantitative assessment of tissue remodeling in response to disease, trauma, or therapeutic intervention, enhancing predictive confidence at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of muscle fiber composition to clarify disease mechanisms and therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by distinguishing slow, intermediate, and fast fiber populations in whole tissue sections.
- Reduces mechanistic ambiguity through standardized, automated analysis workflows.
- Facilitates portfolio triage by providing reproducible, quantitative tissue phenotyping data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue sections for downstream screening of candidate compounds or interventions.
- Standardizes assay outputs with automated, user-independent quantification using open-source ImageJ macros.
- Enables reproducible, high-contrast imaging and fiber-type discrimination for reliable compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across multiple studies and research teams.
Translational & Preclinical Research
- Aligns tissue-level phenotyping with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation by enabling consistent, quantitative readouts.
- De-risks advancement decisions by providing robust, cross-study comparable data on muscle remodeling.
- Enhances predictive value for therapeutic efficacy in models of disease, trauma, or aging.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, providing a reusable platform for tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fiber-type shifts in response to experimental variables.
- Screening: Delivers standardized, reproducible assay outputs for compound or intervention evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, spreadsheet-ready data on fiber populations, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking tissue composition changes to disease or therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, open-source workflow adaptable across research programs and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-level studies.
- Operational Value: Standardizes and automates quantification, minimizing user bias and manual workload.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuromuscular and musculoskeletal programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and digital image analysis.
- Needs access to slide scanning instrumentation and open-source ImageJ software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to various muscle models but dependent on antibody specificity and imaging quality.
- Manual quality control of image acquisition remains critical for optimal automated analysis.
