En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aorta und die Halsschlagader der Maus für die Immunfärbung im Gesicht nach der Ligatur der linken Halsschlagader vorzubereiten. Diese Methode ermöglicht es uns, die Organisation, jede Proteinexpression und den möglichen Zustand von Antralzellen und anderen Gefäßzellen in Immunfärbemethoden zu untersuchen. Gesichtspräparate ermöglichen die Analyse großer Bereiche über Blutgefäße hinweg, um regionale Unterschiede in der Expression verschiedener normaler und möglicher Zellparameter zu beurteilen.

Das Verfahren wird von Dr. Quaico, einem Mikrochirurgen in unserer Gruppe, vorgeführt. Beginnen Sie damit, die betäubte Maus in Rückenlage auf ein Operationsbrett zu legen. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Zehenkneifen reagieren, kleben Sie die Vorderpfoten in der ausgestreckten Position an das Brett und beide Hinterbeine auf die rechte Seite der Maus, um sie auf der linken Seite des Nackens freizulegen.

Entfernen Sie die Haare um den Halsbereich und desinfizieren Sie die freiliegende Haut. Decken Sie die Maus mit einem sterilisierten OP-Tuch mit einem Loch über der Operationsregion ab und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Bewegen Sie die Maus unter das Präpariermikroskop und machen Sie einen Schnitt in der ventralen Mittellinie um den Gebärmutterhalsbereich.

Positionieren Sie die Speicheldrüsen, die die Blutgefäße bedecken, auf die linke Seite des Tieres, um die linke Halsschlagader freizulegen, die sich in die linke innere Halsschlagader und die linke äußere Halsschlagader gabelt. Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe um und unterhalb der linken Arteria carotis interna und führen Sie mit einer Pinzette eine 2,5 Zentimeter lange, vorgeschnittene Sechs-O-Seidennaht unter der Arterie hindurch, wobei Sie mit einer zweiten Pinzette die Naht etwa ein Drittel ihrer Länge zur anderen Seite des Gefäßes ziehen. Lizieren Sie die linke Arteria carotis interna.

Entfernen Sie dann das Bindegewebe um die linke Arteria carotis externa, wie gerade gezeigt, und machen Sie eine Ligatur proximal zur linken Arteria thyreoidea superior. Wenn alle Arterien mit Ausnahme der Okzipitalarterie ligatisiert sind, bringen Sie die Speicheldrüsen wieder in ihre ursprüngliche Position zurück und hydratisieren Sie das Operationsfeld mit zwei bis drei Tropfen Kochsalzlösung. Verwenden Sie dann sechs O-beschichtete Vicryl-Nähte, um die Haut zu schließen und setzen Sie die Maus in den vorgewärmten Käfig mit Überwachung, bis sie vollständig liegt.

Am Ende des Experiments wird die Maus in Rückenlage auf einem Präparierbrett fixiert und die Bauchhöhle mit einer Irisschere mit einem Mittellinienschnitt freigelegt. Schneiden Sie die Rippen seitlich zum Brustbein, um die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie dann die Oberschenkelarterie ein und führen Sie eine 26-Gauge-Nadel ein, die an einer Schwerkraftprofusion befestigt ist, die in der Spitze des linken Ventrikels eingerichtet ist, um das Kreislaufsystem mit Kochsalzlösung zu füllen, die mit Heparin ergänzt wird.

Setzen Sie die Infusion fort, bis die aus dem Schnitt fließende Kochsalzlösung klar wird. Stellen Sie dann das Profusion-System von Kochsalzlösung auf 4%Paraformaldehyd in PBS um. Nach fünf Minuten bewegen Sie die Maus unter das Präpariermikroskop und entnehmen Sie mit einer stumpfen Schere und einer Zange die Aorta sowie die linke und rechte Halsschlagader.

Übertragen Sie als nächstes das Gewebe in eine Petrischale mit PBS und entfernen Sie vorsichtig das Fett und das Bindegewebe, gefolgt von der Trennung und Längsspaltung der Aorta und der Halsschlagader, um das Endothel freizulegen. Das Wichtigste, was Sie bei der Präparation von Blutgefäßen beachten sollten, ist, dass die Endothelzellen durch grobe Handhabung leicht beschädigt werden können. Dehnen Sie die Gefäße zu keinem Zeitpunkt, insbesondere nicht während der Ernte- und Reinigungsschritte.

Übertragen Sie dann jedes Gefäß in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die 0,5 Milliliter Permeabilisierungslösung pro Vertiefung enthält. Permeabilisieren Sie die Blutgefäße 10 Minuten lang mit Schaukeln bei Raumtemperatur, gefolgt von einer kurzen Wäsche in PBS. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit einer 30-minütigen Inkubation in 10 % normalem Serum von derselben Spezies wie die geplanten Sekundärantikörper bei TTBS, wobei Sie bei Raumtemperatur wiegen.

Markieren Sie dann die Proben mit den primären Antikörpern von Interesse, verdünnt in TTBS mit 10 % normalem Serum über Nacht und Schaukeln bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen spülen Sie die Blutgefäße mit drei 10-minütigen Waschgängen in TTBS unter Schaukeln bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation in den entsprechenden Sekundärantikörpern, verdünnt in TTBS und 10% normalem Serum und Dappy. Legen Sie die Proben wieder in die Wippe und die Abdeckung, um sie vor Licht zu schützen.

Nach einer Stunde bei Raumtemperatur unter Schaukeln waschen Sie die Proben dreimal in frischem TTBS, wie gezeigt, gefolgt von einem kurzen Spülen in PBS, und geben Sie einen Tropfen Anti-Fade-Reagenz pro Gefäß auf einzelne 22 x 50 Millimeter große Deckgläser. Legen Sie unter einem Mikroskop ein Gefäß mit dem Endothel nach unten in jeden Tropfen Reagenz und bedecken Sie die Gefäße mit einem 22 x 75 Millimeter großen Objektträgerglas pro Probe. Legen Sie die Objektträger auf ein sauberes Labortuch und bedecken Sie sie mit zwei Stück Labortuch und 3,5 Kilogramm Gewicht, um die Gefäße flach zu drücken.

Entfernen Sie nach maximal fünf Minuten das Gewicht und wischen Sie die überschüssige Lösung von den Deckgläsern ab. Tragen Sie dann Nagellack auf die vier Ecken der Deckgläser auf und legen Sie die Objektträger mit der Deckblattseite nach oben in eine Objektträgerbox. Verwenden Sie am nächsten Morgen mehr Nagellack, um die Deckgläser vollständig zu versiegeln und die Gefäße abzubilden, sobald der Nagellack getrocknet ist.

Hier wird ein typisches En-Face-Immunfloreszenzbild von endothelialen doppelt gefärbten Endothel-Antikörpern gezeigt, die mit Anti-VE-Cadherin und antivaskulären Zelladhäsionsmolekülen gefärbt sind, und das einen einzelnen optischen Schnitt einer Maus-Aorta zeigt, der in der Nähe der Öffnung einer Interkostalarterie aufgenommen wurde. Zu beachten sind die grüne, lineare Färbung an der Adhärenzverbindung der Endothelzellen und das starke antivaskuläre Zelladhäsionsmolekül, eine Färbung an der Öffnung der Interkostalarterie, wo die gestörte Durchblutung bekanntermaßen auftritt. In diesen Bildern ist die Färbung einer partiell ligierten linken Halsschlagader und einer unligierten rechten Arterie der Kontrolle einen Tag nach der Operation zu sehen, wobei eine erhöhte antivaskuläre Zelladhäsionsmolekülfärbung im ligierten Gefäß sichtbar ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine partielle Ligatur der linken Halsschlagader durchführt und wie man Gesichtspräparationen in Blutgefäßen von Mäusen vornimmt. Nehmen Sie dies mit Ihrer Optik zu anderen Kleintieren mit. Die Verwendung von Gesichtspräparaten ist heute auf die Immunfluoreszenzfärbung beschränkt, kann aber auch mit anderen Methoden verwendet werden, z. B. für die Untersuchung ganzer Regionen nach der Pirolfärbung oder für Ex-vivo-Gegenexperimente.