Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Proteinkinaser er højt udviklede signalerende enzymer og stilladser, der er kritiske for inter- og intracellulær signaltransduktion. Vi præsenterer en protokol til måling af kinaseaktivitet ved brug af radioaktivt mærket adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en pålidelig metode til at hjælpe med at tydeliggøre cellesignalregulering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Proteinkinaser er i stand til at styre storskala cellulære forandringer som reaktion på komplekse arrays af stimuli, og en stor indsats har været rettet mod at afdække allosteriske detaljer i deres regulering. Kinaser omfatter signaleringsnetværk, hvis defekter ofte er karakteristika for flere former for cancer og beslægtede sygdomme, hvilket gør en analyseplan til rådighed til manipulation af opstrøms regulatoriske faktorer og validering af reaktionskrav, der er kritiske i søgen efter forbedrede terapeutiske midler. Her beskriver vi et grundlæggende kinase-assay, der let kan tilpasses til specifikke eksperimentelle spørgsmål, herunder men ikke begrænset til testning af virkningerne af biokemiske og farmakologiske midler, genetiske manipulationer såsom mutation og deletion såvel som cellekulturbetingelser og behandlinger til sonde Celle signaleringsmekanismer. Dette assay udnytter radiomærkede [y-32P] ATP, som muliggør kvantitative sammenligninger og klar visualisering af resultater og kan modIfied til brug med immunopræcipiterede eller rekombinante kinaser, specifikke eller typiske substrater, over en lang række reaktionsbetingelser.

Introduction

Proteinkinaser er sofistikerede enzymer kritiske for transmissionen af ​​cellulære signaler i passende svar 1 . I betragtning af deres roller i at opretholde homeostase og forebyggelse eller fremme af sygdomstilstande 2 , er biokemiske metoder til vurdering af kinaseaktivitet fortsat effektive værktøjer til at afgrænse oplysningerne om eukaryotisk signalering 3 . Selvom strategier, der benytter phosphospecifikke antistoffer, har været meget informative med hensyn til måling af virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser på celle signaleringsstatus 4 , tillader et kinaseassay at måle virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser direkte i form af enzymatisk aktivitet af en kinase af interesse. Mens der er flere muligheder for lignende analyser, der ikke bruger radioaktive materialer 5 , fortsætter vi med at anvende denne metode til robust kvantificering af resultater. derEr to typiske anvendelser af dette assay, begge værdifulde af forskellige årsager: det immunpræcipiterede (IP) kinaseassay ( Figur 1 ) og det rekombinante proteinkinase assay ( Figur 2 ).

IP-kinaseassayet er yderst nyttigt til at identificere faktorer, der er i stand til at aktivere specifikke proteinkinaser såvel som måling af inhiberende behandlingsbetingelser. I korte træk transfekteres en epitop-mærket kinase af interesse i dyrkede eukaryote celler, udsættes for en række behandlinger, immunpræcipiteres og analyseres for evnen til at inkorporere radioaktivt mærket phosphat i et modelsubstrat ( fx myelinbasisk protein (MBP)). IP-kinaseassay kan også udføres uden at ty til overekspression, enten ved immunpræcipitation af endogent protein eller et hvilket som helst antal genom-redigeringsteknikker. Fordi behandlingerne administreres i kultur, kan denne metode detektere stimuleringer transmitteret gennem flere opstrømsfaktorerEller parallelle veje ved in vitro- aflæsning. En stor fordel ved denne metode er, at den ikke kræver forudgående kendskab til direkte opstrøms eller nedstrøms faktorer eller phosphoryleringssteder deri. Når specifikke substrater for en interessekinase er blevet identificeret, kan specifikke kinasassayprotokoller anvendes med rekombinante komponenter til måling af specifik aktivitet over for naturlige substrater og identifikation af specifikke phosphoryleringssteder, når de kombineres med massespektrometrianalyse. Sites identificeret på denne måde kan valideres yderligere med kinaseanalyser under anvendelse af substratmutanter. Endelig kan denne metode også bruges til at detektere og måle autophosphorylering.

Den heri tilvejebragte protokol antager enten et optimeret proteinrensningsskema eller transfektionsmetode til ekspression af en affinitetsmærket kinase af interesse i dyrkede celler. Til mere detaljerede udstillinger af transfektion, lysis, immunpræcipitation og proteinrensning protOcols, foreslår vi at henvise til Cold Spring Harbor Protocols 6 . For yderligere information om analyseudvikling og modifikation henvises til Proteinphosphorylation: Selected Methods in Enzymology 7 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kinase Oprensningsressourcer og Generel Immun Udfældning Pipeline

BEMÆRK: Kinaser til anvendelse med dette assay kan hidrøre fra immunpræcipitater af dyrkede celler eller ved rekombinante midler, såsom affinitetsmærket rensning 6 . Nedenfor er en generel protokol for flag-mærket immunpræcipitation, som muligvis skal modificeres afhængigt af kinasen af ​​interesse. Alt skal holdes på is når det er muligt.

  1. Tilsæt 2 μl 1 mg / ml antistof til 200 μl cellelysater (normalt ~ 1 mg / ml total proteinkoncentration) og inkuber ved 4 ° C i 1 time under gyngning.
  2. Vask protein En sepharose perler 2-3 gange med lysisbuffer (se nedenfor) ved kortvarig spinding ved 4 ° C i 30 s til 1 min ved 5.000 xg ("touch spin"), fjernelse af supernatant med en pipette og resuspenderende perler i puffer .
    1. Forbered lysis buffer: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0,2 mM natriumorthovanadat, 100 mM natriumfluorid, 50 mM β-glycerophosphat, 0,1% Triton X 100 eller 0,1% NP-40.
  3. Tilsæt 30 μl 50% opslæmning af protein A-sepharose-perler i lysisbuffer til lysater; Inkuberes ved 4 ° C i 1 time under rocking.
  4. Touch spin ved 4 ° C for at pille perlerne og fjerne supernatanten.
  5. Vask 3 gange med 1 ml perlevaskebuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
  6. Vask en gang med 1 x kinase-reaktionsbuffer (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Fjern så meget buffer som muligt uden at fjerne perler.

2. Initialisering af kinase-reaktioner

BEMÆRK: For IP-kinase-analyser er ~ 15 μl ikke-suspenderede perler en typisk startprøve. Til rekombinante proteinkinase-assays varierer typiske udgangsmængder fra 0,1-1,0 μg i 1-10 til 25-50 μl endelige reaktionsvolumener. Juster volumener af rekombinant proteinprøveS at være lig med bufferen de er lagret i forud for initialisering af analysen. Ved anvendelse af store mængder kinase indbefatter et bærerprotein, såsom BSA, at hjælpe med at opretholde proteinstabilitet i løbet af analysen.

  1. Forbered 5x kinase reaktionsbufferen givet nedenfor:
    50 mM HEPES pH 8,0
    50 mM MgCl2
    50 mM benzamidin (proteaseinhibitor)
    50 mM DTT (reduktionsmiddel)
    250 μM ATP (umærket eller "kold")
  2. Opbevar kinaseprøver på is i 1,5 ml rør. Forbered den følgende reaktionsblanding i separate, afkølede 1,5 ml rør:
    21 μl H20
    6 μl 5x kinase-reaktionsbuffer
    1 μl radiomærket ("hot") ATP
    2 μl substrat (~ 5 mg / ml)
    BEMÆRK: Ved rekombinante kinaseassays kan volumen indstilles til at rumme renset protein. Beregn således, at det endelige reaktionsvolumen er 30 μl. Brug denne opskrift til at forberede en mesterblande. Ved modtagelse af mærket ATP, fortyndet bestanddel i H20 til en specifik aktivitet på 0,01 mCi / μl før tilsætning til reaktionsblanding.
  3. For at initialisere analysen tilsættes hele reaktionsblandingen til kinaseprøve og inkuberes reaktion ved 30 ° C i 5 minutter til 1 time afhængig af aktivitet af kinase, der analyseres.
    BEMÆRK: Når du arbejder med en kinase, hvis aktivitet ikke er blevet analyseret tidligere, skal du udføre et kinaseaktivitetsforløb med intervaller på 5 minutter mellem tidspunkter.

3. Reaktionsterminering og SDS-PAGE

  1. Stop reaktionen ved at sætte på is og tilsæt 7,5 μL 5x Laemmli prøvebuffer 6 .
  2. Opvarm ved 100 ° C i 30 s til 2 min i varmeblok.
  3. Touch spin og indlæs 20 μL pr. Brønd på 10-15% SDS-PAGE gel. Kør gel lang nok til at adskille kinase og substrat (typisk 1 time ved konstant effekt på 5 W). Sørg for at holde gelapparatet afskærmet for at begrænse eksponeringen til 32
  4. Brug her hjemmelavede gelapparater, men standard kommercielt tilgængelige mini-geler passer perfekt. Brug dimensionerne som følger:
    Geler: 8 cm bredde, 5,5 cm længde (opløsning), 1,5 mm tykkelse.
    Combs: 15 brønde, 1,5 mm tykkelse, 2,9 mm bredde, 16 mm dybde

4. Gel-farvning og tørring

Forsigtig: Sørg for at reducere den personlige eksponering til 32 P ved hjælp af radioaktive afskærmninger og brug af personlige værnemidler. For mere information om specifikke trin er nogle nyttige referencer inkluderet.

  1. Fjern gelen fra glas / aluminiumoxidplader og anbring i 50 ml Coomassie-plet (10% iseddikesyre, 50% methanol, 0,25% R-250 farve) i 1 time på et omløbsapparat indstillet til 50 omdr./min. Til dette trin skal du bruge en beholder, der er lidt større end selve gelen. 8
  2. Flyt gelen fra plet til fikseringsopløsning (10% iseddikesyreD, 20% methanol) for at de-plettere. Sten gelen i 600-700 ml fikseringsopløsning natten over på orbital shaker ved 50 rpm. Placer stykker af skum eller knyttede laboratorieservietter i beholderen med gelen for at absorbere Coomassie-farvestoffet 8 , 9 .
  3. Fjern gelen fra fikseringsopløsningen og blød i 200 ml methanol i 1-2 minutter med forsigtig omrøring, indtil gelen bliver mælkhvid. Dette forhindrer revner under tørretrin.
  4. Våd et 14 cm x 14 cm stykke kvalitativt filterpapir med methanol, og læg dem på slibelugesuger. Læg gelen ned på filterpapirets forside opad.
  5. Dæk gelen med plastfolie forsigtigt for at undgå rynker og luftbobler. Kør tørretumbleren i 1,5 timer ved 80 ° C. Når vakuumet er nået, skal du åbne låget og udrulle eventuelle luftbobler, hvis det er nødvendigt, med en blød gummibroger.

5. Autoradiogram og scintillation tæller

  1. Fjern driEd gel og vedhæft en autorad markør, phosphorescerende linjal eller prikker til filterpapiret på siden af ​​gelen. Hvis du bruger prikker, skal du sørge for at de er i et asymmetrisk mønster. Dette vil justere gelen med filmen efter eksponering og udvikling.
  2. Brug en Geiger-tæller til at kontrollere signalets intensitet. Ved svagere signaler vil eksponering ved -70 ° C til -80 ° C med en intensiverende skærm øge filmbåndets tæthed.
  3. I et mørkt rum anbringes tørret gel i en filmkassette med film og en intensiverende skærm i følgende rækkefølge fra top til bund: gel, film, intensiverende skærm.
  4. Fastgør intensiveringsskærmen til kassettens låg og bånd gelen på plads for at gøre dette trin lettere. Den intensiverende skærm udsender lys, når det bestråles af beta-partiklerne fra 32 P. Disse lysemissioner trænger mere effektivt ind i filmen end beta-partiklerne.
    1. Sørg for, at bølgelængden udgivet fra intensiveringsskærmen korrespondererDamme til en bølgelængde film er mest følsomme over for.
    2. Brug en Geiger-tæller til at bestemme, hvor længe du skal forlade eksponeringen for: hvis cpm-tællingen er ~ 100 eller derunder, prøv natten over ved -70 ° C. Hvis tællingen er ~ 10.000, start med en eksponering på 1 time og optimer derfra.
  5. Ved afslutningen af ​​eksponeringen fjernes filmen og udvikles i en medicinsk / røntgenfilm processor. Hvis eksponeringen blev udført ved -70 til -80 ° C, skal du enten lade kassetten varme op til stuetemperatur for at minimere kondens på filmen eller fjerne filmen umiddelbart før kondenseringsformer 10 .
  6. Læg filmen over det tørrede gel / filterpapir og juster billedet af markøren / prikkene med markørerne / prikkene på den tørrede gel. Markér på båndet de bånd, der svarer til proteinstandarderne. Mærk proteinstandarderne og hvilke baner reaktionerne er til fremtidig reference.
  7. Punk båndene fra gelen, der svarer til bands af interesse på filmen og læg demI 7 ml scintillationsflasker. Tilsæt 4 ml scintillationsvæske og tæl med væskescintillationstæller. Bekræft, at tælleren er indstillet til at overvåge det rigtige energispektrumvindue til 32 P.
    BEMÆRK: Husk også at punge båndet svarende til substrat fra no-kinase kontrolbanen. Dette vil blive brugt til at beregne baggrundsstråling, der trækkes fra alle prøve scintillationstællinger.

6. Analyse af resultater

BEMÆRK: Autoradiogrammet giver en kvalitativ visualisering af resultaterne. Til nøjagtig kvantificering kan 32 P inkorporering måles med en scintillationstæller. Data udtrykkes normalt i forhold til relativ aktivitet, som vist i figur 1B . Så længe ensartede betingelser opretholdes for alle prøver, er relative målinger af specifik aktivitet tilstrækkelige til at sammenligne behandlinger.

  1. Ved beregning af absolutte specifikke aktivitetsværdier skal du udføre en strenghedOptimering af alle reaktionsbetingelser, herunder kinase-, substrat- og koldt ATP-koncentrationer for at sikre et lineært aktivitetsområde over et tidsforløb ( fx 2 x [kinase] = 2 x specifik aktivitet). For kinaser med høj specifik aktivitet udføres analyser med forøget substratkoncentration i tilfælde af at kinaseaktivitet er begrænset af mængden af ​​substrat.
  2. Beregn den specifikke aktivitet af kinase af interesse i enheder af nanomolphosphat overført pr. Minut pr. Mg kinase.
    1. Træk emner fra cpm i de talte bands.
    2. Beregn nedfaldet af hot ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 hvor t er antallet af dage siden referencedato (skal leveres af sælger), t 1/2 er Halveringstid på 32 P, hvilket er 14,3 dage og 0,95 afspejler effektiviteten af ​​scintillationstælleren. Eksempel: Hvis der anvendes hot ATP, der er 28 dage gammelt, skal decayværdien være 0,245.
    3. CalcUlat picomolerne (pmol) af total ATP i analysen (normalt er dette lig med mængden af ​​kold ATP i reaktionen): analysevolumen (μL) x [kold ATP] (μM) = total ATP (pmol). Eksempel: 30 μl x 50 μM = 1500 pmol
    4. Beregn cpm / pmol ATP: [μL varm ATP x (2,2 x 107) x henfaldsfaktor] / pmol af kold ATP.
      BEMÆRK: Værdien på 2,2 x 10 7 konverterer 0,01 mCi / μL ATP til cpm.
    5. Beregn mængden af ​​kinase i analysen i mg. For både rekombinant kinase og immunopræcipiterede kinaser er standardmetoder såsom BCA-assays egnede til at bestemme udgangskoncentrationer. Eksempel: wtERK2 0,0002 μg / μl i en 50 μl kinasereaktion er 0,01 μg eller 1 x 10 -5 mg.
    6. Beregn total cpm i assay. Saml 30 μl reaktioner og kør 20 μl fra hver reaktion på en gel. Multiplicer cpm talt (efter blank subtraktion) med en faktor af total testvolumen / volumen indlæst. Fortsætter ovenståendeEksempel multiplicere alle tællinger med 1,5 eller 30/20.
    7. Beregn den specifikke aktivitet af den analyserede kinase:
      Total cpm i assay) / (cpm / pmol ATP) / (analysetid i minutter) / (mængde kinase i mg)
      BEMÆRK: Fordeling af ovennævnte værdi med 1.000 giver den specifikke aktivitet i nanomol / minut / mg
  3. Beregn hvor mange mol fosfat der indgår i et substrat (så længe molekylvægten er kendt). Dette anvendes til at bestemme antallet af phosphositter på et bestemt protein, når reaktionen er gået til afslutning.
    Total cpm i assay) / (cpm / pmol ATP)] / (mængde substrat i pmoler)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WNK1 IP kinase assays

Myc-mærket WNK1 blev transficeret i HEK293-celler og immunpræcipiteret med et anti-Myc-antistof 11 . Immunpræcipitatet viste kinaseaktivitet over for modellsubstratet MBP såvel som mod sig selv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter blev derefter testet for kinaseaktivitet mod MBP ved samme metode, denne gang ved anvendelse af GST-mærket konstruktioner ( figur 1B ). Analyse af mutant kinaseadfærd i forhold til vildtype afslørede rester kritisk for optimal WNK1 aktivitet.

HEK293-celler blev udsat for et panel af farmakologiske og biokemiske behandlinger. Ved anvendelse af et antistof rejst mod et WNK1-N-terminalt peptid blev immunpræcipiteret endogen WNK1-kinaseaktivitet analyseret under anvendelse af MBP som substrat. Epidermal vækstfaktor (EGF), en kendt aktivatEller af ERK1 / 2-signalering, nocodazol, et lægemiddel, der målretter mikrotubuleldynamik, anisomycin, en hæmmer af eukaryotisk translation og lysophosphatidsyre (LPA), et potent mitogen, var alle ude af stand til at fremkalde en robust forøgelse af phosphoryleret MBP. I modsætning hertil viste NaCl at være en regulator af WNK1-kinaseaktivitet.

ERK2 rekombinante proteinkinase assays

Rat ERK2, der bærer et N-terminalt 6His-mærke, blev udtrykt i bakterieceller og affinitetsrenset med nikkelharpiks 12 . Protein blev yderligere oprenset ved ionbytningskromatografi på en MonoQ-søjle, hvor flere elueringsfraktioner blev testet for kinaseaktivitet ( figur 2A ). Fordi ERK2 kræver dobbelt fosforylering ved MEK for at opnå maksimal kinaseaktivitet, ERK2 renset fra bakterier i fravær af MEK, er stort set inaktiv. Derfor, for at teste fraktioner af recomBinant ERK2 til aktivitet over for MBP, inkluderede en konstitutivt aktiv form af MEK1, der hedder MEK1R4F, i kinasereaktioner. MEKR4F har ikke særlig høj kinaseaktivitet på MBP ( figur 2 ).

Ved anvendelse af et assay svarende til det, der er vist i figur 2A , blev en MBP-kinaseaktivitet brugt til måling af aktivitet af rekombinante ERK2-mutanter renset fra bakteriekulturer i forhold til vildtypeprotein ( figur 2B ). Selvom ERK2 er i stand til at fosforylere MBP, når det stimuleres af MEKR4F, hæmmer mutation af enten den katalytiske lysin (K52R) eller en threonin proximalt til de canoniske steder med dobbelt phosphorylering (T188D og T188E) dramatisk ERK2-kinaseaktivitet. ERK2-T188D og ERK2-T188E viser marginal kinaseaktivitet over for et lille, fleksibelt peptid ( Figur 2C ), men de kan ikke robust fosforylere de kendte ERK2-underlag Nup153 og PDX1 ( Figur 2 D).

figur 1
Figur 1: Immunpræcipitationskinaseanalyser af WNK1. ( A ) HEK293-celler blev transficeret med enten pCMV5-Myc uden et insert eller pCMV5-Myc-WNK1, mærkede proteiner blev immunpræcipiteret med anti-Myc-antistoffet efterfulgt af kinaseassays under anvendelse af MBP som substrat. Autoradiografi er vist til venstre, og en immunblot af immunpræcipiterer til højre. ( B ) Forskellige GST-WNK1-mutante proteiner blev anvendt i kinasassays med MBP som substrat; MBP-phosphorylering udtrykkes som aktivitet i forhold til vildtype WNK1. ( C ) Endogen WNK1 blev immunpræcipiteret fra HEK293-celler behandlet med forskellige stimuli og analyseret for autophosphorylering. Denne figur blev modificeret fra Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Rekombinant proteinkinase assays af ERK2. ( A ) Oprensede ERK2-fraktioner fra en MonoQ-anionbytterkolonne blev anvendt i et kinasassay med MBP i nærvær eller fravær af MEK1R4F, en konstitutivt aktiv stimulator af ERK2-kinaseaktivitet. ( B ) ERK2-mutanter blev testet for kinaseaktivitet på MBP. ( C ) Aktiveringssløjfe-mutanter ERK2-T188D og ERK2-T188E viser marginal kinaseaktivitet mod et lille typificeret peptidsubstrat. ( D ) Sammenligning af ERK2- eller T188D-kinaseaktiviteter efter aktivering af MEK1R4F med kendte ERK2-substrater nucleoporin-153 (Nup153) og pankreatisk og duodenal homeobox 1 (PDX1). Fosforylerede substrater er betegnet med kiler og phosphorylaTed ERK2 og T188 med asterisker. Gengivet (og ændret) med tilladelse fra McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kinaser er en forskelligartet familie af proteiner, der har udviklet stor funktionalitet i mange sammenhænge, ​​og kinaseanalyser har været utroligt nyttige til at studere flere signalproteiner og har i høj grad bidraget til vores nuværende forståelse af cellulær kommunikation. Navnlig blev det samme basiske assay anvendt til karakterisering af to forskellige kinaser på trods af store forskelle i struktur og aktivitet. WNK1 kinase indeholder en atypisk katalytisk lomme, hvor den kritiske lysin har skiftet til en unik position og er kendt for at spille roller i regulering af kation-chlorid-cotransportører gennem både kinase- og stilladsfunktioner. Kinasaktiviteten af ​​WNK1 er kendt for at have et lavt omsætningstal, selv på dets bedst kendetegnede substrater, proteinkinasen oxidativ stress responsiv 1 (OSR1) og SPS / STE20-relateret prolinalanin-rich kinase (SPAK). I modsætning hertil viser ERK2 sammen med den nært beslægtede kinase ERK1 robust kinaseaktivitet, når den aktiveres 13 , 14 .

Det mest kritiske aspekt ved analysen er reaktionssamling. For at kunne foretage præcise tidsmålinger skal der gives særlig omhu til initiering af kinasereaktioner. Der er fire grundlæggende krav til en kinaseanalyse for at fortsætte: kinase, substrat, ATP og en metalion. For denne protokol, der primært anvendes til eukaryotiske kinaser, anvendes MgCl2 som en kilde til magnesium. Både rekombinante proteinkinase og IP-kinasepræparater indeholder typisk magnesium, hvilket gør MgCl2 utilstrækkelig som en reaktionsstarter. Tilsvarende kan tilsætning af umærkede ("kold") ATP før tilsætning af mærket ("hot") ATP initiere en reaktion utilstrækkeligt tidligt. Vi anbefaler at forberede reaktioner ved hjælp af en koncentreret kinasereaktionsbuffer, der letter samtidig tilsætning af MgCl

Skønt der er nogen forskel mellem IP kinase assays og rekombinante proteinkinase assays, tHan eksperimentelle paradigme fælles for begge demonstrerer, hvor alsidig denne analyse kan være. Faktisk er der tilfælde, hvor funktionerne i begge kinaseassaytyper kan blandes, som med undersøgelser af den mitogenaktiverede proteinkinase / ekstracellulære signalregulerede kinase (MAPK / ERK) signalvej. I denne vej aktiveres ERK1 / 2 ved dobbeltfosforylering ved opstrømsfaktoren MAPK / ERK kinase 1 (MEK1). Tidligere undersøgelser har vist, at mens MEK1, såvel som en konstitutivt aktiv mutant betegnet MEK1R4F, er i stand til at aktivere ERK1 / 2, har den meget lav aktivitet mod MBP. Som følge heraf udviser ERK1 / 2 oprenset fra bakterieceller begrænset kinaseaktivitet mod MBP, medmindre de behandles med MEK1R4F, hvilket skaber en robust platform til sammenligning af kinaseaktiviteten af ​​vildtype ERK1 / 2 til mutantkonstruktioner som vist i figur 2 . Inddragelse af immunopræcipiterede komponenter kan tilføje endnu mere nuance, der fremhæver kinaseassayet som en meget tilpasningsbar metode til at sonde den multifacetterede nAture af disse vigtige signalmolekyler.

Mens nogle kan finde arbejde med radioaktive materialer besværligt, er den radioaktive mærkning af den radiomærkede kinaseanalyse en af ​​dens store fordele. De seneste fremskridt inden for naturproduktkemi, genomics og massespektrometri har imidlertid skabt en efterspørgsel efter modificerede kinaseanalyser Med readouts mere acceptabelt til applikationer med høj gennemgang 15 . Fordi disse analyser udnytter forskellige mærkningsmaterialer, laves kompromiser med hensyn til nøjagtighed, men disse kan overvindes ved at anvende et radioaktivt mærket assay for at validere screeningsresultater. Som vores forståelse for proteinkinase signalering stiger, er det fortsat klart, at teknikker, der er i stand til at udslette oplysningerne om kinase-regulerende funktioner, fortsat vil hjælpe med udvikling af værktøjer og terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifuldt arbejde og diskussioner, og Dionne Ware til administrativ bistand. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health Grant R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366, (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16, (16), 7788-7794 (2008).
  6. Cold Spring Harbor Protocols. Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
  7. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121, (51), 12215 (1999).
  8. Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
  9. Autoradiography. Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
  10. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. 3 edn, Humana Press. (2009).
  11. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275, (22), 16795-16801 (2000).
  12. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55, (12), 1909-1917 (2016).
  13. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4, (196), rs11 (2011).
  14. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  15. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18, (8), 444-455 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics