Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

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Biology

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Summary

Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren.

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Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

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Abstract

Zellen werden oft durch plötzliche Umweltveränderungen herausgefordert. Stressgranulate (SGs), zytoplasmatische Ribonukleoproteinkomplexe, die sich in Zellen bilden, die Stressbedingungen ausgesetzt sind, sind in verschiedenen Aspekten des Zellstoffwechsels und des Überlebens verwickelt. SGs modulieren zelluläre Signalwege, post-transkriptionale Genexpression und Stress-Response-Programme. Die Bildung dieser mRNA-haltigen Granulate ist direkt mit der zellulären Translation verbunden. SG-Assembly wird durch gehemmte Translationsinitiation ausgelöst, und die SG-Demontage wird durch Translationsaktivierung oder durch gehemmte Translationsdehnung gefördert. Diese Beziehung wird durch SG-Komposition weiter hervorgehoben. Core-SG-Komponenten sind gestoppte Translationsvorinitiierungskomplexe, mRNA und ausgewählte RNA-bindende Proteine ​​(RBPs). Der Zweck der SG-Versammlung besteht darin, zelluläre Energie durch Sequestrierung von translatorisch blockierten Housekeeping-mRNAs zu erhalten, was die verbesserte Translation von stressempfindlichen Proteinen ermöglicht. In additivAuf die Kernbestandteile, wie z. B. gestoppte Translationsvorbereitungskomplexe, enthalten SGs eine Fülle von anderen Proteinen und Signalmolekülen. Defekte in der SG-Bildung können die zelluläre Anpassung an Stress beeinträchtigen und so den Zelltod fördern. SGs und ähnliche RNA-haltige Granulate wurden mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten, einschließlich neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, verbunden, was zu dem jüngsten Interesse an der Klassifizierung und Definition von RNA-Granulat-Subtypen führte. Dieses Protokoll beschreibt Assays zur Charakterisierung und Quantifizierung von Säugetier-SGs.

Introduction

Zellen verwenden viele Mechanismen, um auf Stress zu reagieren. Einige Antworten treten auf der posttranskriptionellen Ebene auf und beinhalten die Regulierung der mRNA-Translation und / oder der Stabilität 1 , 2 . Stressmodulierte mRNA-Translationsstillstand und -abbau sind mit der Bildung spezifischer nichtmembranöser zellulärer Herde verbunden, wobei die am stärksten charakterisierten Stressgranulate (SGs) 3 sind . SGs sind zytoplasmatische Herde, die die Nicht-Translations von mRNPs in translatorisch verhafteten Zellen, die auf Stress reagieren ( z. B. Oxidation, Hitzeschock, Nährstoffhunger und Virusinfektion), konzentrieren. Zusätzlich zur Nicht-Translation von mRNAs enthalten SGs Translationsinitiierungsfaktoren, RNA-bindende Proteine ​​und verschiedene Signalproteine 5 . SGs sind Biomarker der gehemmten Protein-Translation und veränderten RNA-Metabolismus und wurden mit Zellüberleben und Apoptose, Signalweg verbundenS und nukleare Prozesse 5 .

SGs sind dynamische Entitäten, und ihre Bildung ist eng mit dem Status der zellulären Übersetzung verbunden 6 . Trotz ihrer scheinbar soliden Erscheinung, die meisten SG-Protein-Komponenten schnell ein- und ausschalten, mit einer verweilzeit von Sekunden. Während SGs für Minuten bis Stunden bestehen bleiben, sind die meisten ihrer Komponenten im raschen Fluss. Die Hemmung der Translationsinitiierung und die daraus folgende Demontage von translatierenden Polysomen fördern die Bildung von SGs; So sind die SGs im Gleichgewicht mit der Übersetzung von Polysomen. Dieses Polysom ​​/ SG-Gleichgewicht ist der Schlüssel zur Unterscheidung bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden 6 , 7 .

Die Veranlassung der Translationsinitiierung beinhaltet die Umwandlung von translation-kompetenten Prä-Initiierungskomplexen, die mRNA, Translationsinitiationsfaktoren (eIF) und 40S ribosomale Untereinheiten enthalten (s O-genannt 48S-Komplexe) in translatorisch blockierte Komplexe (sogenannte 48S * -Komplexe), die sich in SGs 4 , 6 koaleszieren können. SGs werden durch Translationsstillstand an zwei verschiedenen Schritten stromaufwärts von 48S-Komplexbildung gefördert: Interferenz mit den Funktionen des cap-bindenden eIF4F-Komplexes ( zB Targeting auf seine eIF4A-Untereinheit) oder Phosphorylierung der α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2, vermittelt durch eins Oder mehr der vier eIF2-Kinasen. Die Anwesenheit von blockierten 48S-Komplexen ( dh 40S ribosomale Untereinheiten und ausgewählte Translationsinitiierungsfaktoren) ist ein Kennzeichen der SGs 8 , 9 .

SGs wurden mit verschiedenen pathologischen Zuständen wie Virusinfektionen, Neurodegeneration, Autoimmunität und Krebs 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Mutierte Formen von mehreren SG-Komponenten sind mit neurodegenerativen Erkrankungen ( zB amyotropher Lateralsklerose) assoziiert, bei denen Neuronen intrazelluläre pathologische Einschlüsse zeigen, die im neuronalen Tod aktive Rollen spielen können. Einige Viren entführen SG-Komponenten, um die SG-Bildung zu hemmen und die Virusreplikation zu verbessern 14 . Jüngste Studien verknüpfen auch SGs an Krebs 15 und an Krebszellüberleben unter Chemo- und Strahlentherapie-Behandlungen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Während solche Erkenntnisse ein großes Interesse an der SG-Biologie geweckt haben, fehlen viele der veröffentlichten Berichte über wichtige Kontrollen, um die Bildung von bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden zu unterscheiden.

SGs wurden anfänglich als nichtmembranöse zytoplasmatische Foci beschrieben, die aus ausgewählten mRNA-bindenden Proteinen (RBPs) zusammengesetzt waren, einschließlich T-Zell-ntrazelluläres Antigen 1 (TIA-1) und Poly-A-bindendes Protein (PABP); Übersetzungsinitiierungsfaktoren; Polyadenylierten mRNA; Und kleine ribosomale Untereinheiten 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionell wurde ihre Zusammensetzung durch Techniken wie Immunfärbung und die ektopische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen 23 , 24 bestimmt . Aufgrund ihrer hochdynamischen Natur bleibt die Immunolokalisierung von SG-Proteinen und / oder mRNAs die definierende Methode zur Detektion von SGs 23 , 24 . Bisher werden viele RBPs und andere Proteine ​​(über 120 verschiedene Proteine) als SG-Komponenten beschrieben 11 . So viele SG-lokalisierte Proteine ​​verändern ihre Lokalisation sowohl in einer stressabhängigen als auch in einer unabhängigen Weise und können sich an anderen intrazellulären Kompartimenten und Herden ansammeln. Es ist wichtig, korrekte SG-Marker zu wählen und funktionelle Kriterien zu verwenden, um SGs von anderen Arten von Stress-induzierten zu unterscheiden Foci Bona fide SGs enthalten mRNA, Translationsinitiationsfaktoren und kleine ribosomale Untereinheiten und befinden sich im dynamischen Gleichgewicht mit Translation.

Dieser einfache Workflow ist darauf ausgelegt, festzustellen, ob Stress-induzierte Herde bona fide SGs sind. Dieser Workflow umfasst mehrere experimentelle Ansätze mit U2OS-Zellen, Zellen, die üblicherweise zur Untersuchung von SGs verwendet werden. Diese Zellen sind ideal, da sie ein großes Zytoplasma haben, sind relativ flach und haften stark an Glasdeckgläschen. Andere Zelltypen können verwendet werden, um SGs zu studieren, aber es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Unterschiede in der Zeitmessung, der Arzneimittelkonzentration und der Fülle von SG-Nukleierungsproteinen die Kinetik und den Compo verändern könnenSition Zusätzlich reagieren einige Zellen auf die Paraformaldehyd-Fixierung, indem sie Zelloberflächen-Blasen bilden, was dann ein gerafftes Aussehen gibt, das die punktuelle Lokalisierung einiger SG-Marker verursacht; Ohne sorgfältige Analyse können diese als SGs falsch klassifiziert werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, alle Kriterien zu beurteilen, die erforderlich sind, um stressinduzierte Herde als bona fide SGs zu identifizieren. Vinorelbin (VRB), ein Krebs-Therapeutikum, das SGs 20 fördert, sowie Sodium Arsenite (SA), ein robuster und gut charakterisierter SG-Induktor, werden als Stress für die Experimente in diesem Protokoll verwendet.

Kanonische SGs enthalten mehrere SG-Marker (sowohl Proteine ​​als auch mRNAs), die sich in zytoplasmatischen Herden kolokalisieren. Dieses Protokoll verwendet sowohl Immunfluoreszenz- als auch Fluoreszenz- in-situ- Hybridisierung (FISH), um die Lokalisierung von Proteinmarkern und polyadenylierten mRNA 22 zu detektieren. Kurz gesagt, indirekte Immunfluoreszenz verwendet Antikörper ( i.E. Primäre Antikörper), die für ein gegebenes Protein spezifisch sind, um es innerhalb der Zelle zu detektieren. Dann erkennen sekundäre Antikörper (meist speziespezifisch) an Fluorochrome den primären Antikörper und zeigen die Zielprotein-Lokalisation. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um das lokalisierte Signal innerhalb der Zelle zu detektieren. Die Verwendung von in verschiedenen Spezies produzierten Antikörpern und deren Nachweis mit unterschiedlich gefärbten sekundären Antikörpern ermöglicht den Nachweis der Kolokalisation mehrerer Antikörper, was darauf hinweist, dass ihre Proteinziele an der gleichen Stelle 23 gefunden werden . Es ist wichtig, Marker auszuwählen, die bei der Korruption bei bona fide SGs überprüft wurden.

FISH verwendet eine markierte Sonde, die Basenpaare zu einer spezifischen RNA oder DNA-Sequenz 25 bildet . Um mRNA zu detektieren, verwendet dieses Protokoll eine biotinylierte Oligo (dT) 40- Sonde, die (oder Basenpaare) an den PolyA-Schwanz von mRNA hybridisiert ( dh PolyA FISCH). Die biotinylierte Sonde wird dann unter Verwendung von fluoreszenzkonjugiertem Streptavidin nachgewiesen, da Streptavidin eine hohe Affinität für Biotin aufweist. Bei der Beurteilung von SGs ist es wichtig, PolyA FISH mit Immunfluoreszenz zu koppeln, die einen SG-Marker detektiert, wie bei bona fide SGs, die beiden Signale sollten kolokalisieren.

Mit diesem Protokoll wird die Kolokalisierung auf mehrere Arten beurteilt. In einem mehrkanaligen ( dh RGB: rot, grün und blau) Bild wird die Kolokalisierung die Farbe des überlappenden Signals verändern ( z. B. kolokalisiert rot und grün gelb) 23 . Zusätzlich wird die Kolokalisierung graphisch unter Verwendung einer Linienabtastanalyse quantifiziert, wobei die Intensität jeder der Farben über eine gegebene Linie 8 , 20 gemessen wird . Dieses Protokoll beschreibt zwei Zeilen-Scan-Analyse-Verfahren mit ImageJ 26 . Ein Verfahren ist manuell und geht durch den gesamten Prozess, whiDer andere verwendet ein Makro oder ein einfaches Programm, das die manuellen Schritte automatisiert. Es ist wichtig, durch das manuelle Programm zu gehen, um das Makroverfahren zu verstehen.

SGs bilden sich in Zellen, wo die Translation unterdrückt wird; Daher sollten Zellen mit SGs verringerte Werte der globalen Translation im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigen. Experimentell wird Ribopuromycylierung verwendet. Puromycin und Emetin werden den Zellen für eine kurze Dauer vor der Fixierung zugesetzt, so dass das Puromycin in die aktive Bildung von Polypeptiden einbinden kann, was die Beendigung 27 , 28 verursacht. Eine Behandlung mit Emetin ist erforderlich, um eine Wiederinitiierung zu verhindern 29 . Puromycin kann dann mit Anti-Puromycin-Antikörper nachgewiesen werden, was eine Momentaufnahme der aktiven Translation ergibt. Diese Methode wird verwendet, weil es schnell ist, erfordert nicht vorhungern mit einem Medium fehlt eine bestimmte Aminosäure (und potenziell Vorspannung der Zellen), und zeigt dieSubzelluläre Lokalisation der Proteinübersetzung Andere Verfahren, insbesondere modifizierte Aminosäureanaloga, wie das Methionin-Analog-L-Azidohomoalain (AHA), gekoppelt mit der "Klick-it" -Aryge 30 , wurden verwendet, um zu zeigen, dass Zellen, die SGs enthalten, eine viel geringere Translation aufweisen als die benachbarten Zellen 31 . Diese Technik erfordert jedoch einen Methionin-Hunger, gefolgt von einer Puls-Markierung für 15-30 min. Der Methionin-Hunger stellt einen zusätzlichen Stress dar, während die lange Etikettierzeit ( dh 15-30 min) zur Messung der kumulativen und nicht fortlaufenden Translation führt und es den neu synthetisierten Proteinen ermöglicht, sich von ihrem Syntheseort zu ihrem endgültigen Ziel innerhalb der Zelle. Im Gegensatz dazu ist die Ribopuromycylierung viel schneller und kompatibel mit jedem Medium, wie dem glucosefreien Medium, das verwendet wird, um SGs durch Glucoseverhungern zu induzieren.

Die kanonischen SGs befinden sich im dynamischen GleichgewichtMit aktiv übersetzenden Polysomen. Dies kann experimentell beurteilt werden, indem man Proben mit den Medikamenten behandelt, die Polysomen stabilisieren oder destabilisieren, wodurch das Gleichgewicht zwischen SGs und Polysomen gekippt wird 23 . Cycloheximid (oder Emetin, das sich ähnlich verhält) blockiert die Dehnung durch "Einfrieren" von Ribosomen auf mRNA, wodurch der Pool der verfügbaren nicht-polysomalen mRNPs, die SGs bilden können, verringert. Experimentell kann dies auf zwei Arten verwendet werden: durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin) vor Stress, um eine SG-Bildung zu verhindern, oder durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin), nachdem die SGs gebildet worden sind, auch ohne das Stressmittel zu entfernen, was eine SG-Demontage verursacht, wie es blockiert ist Präinitiierungskomplexe werden langsam in die Polysomfraktion eingelassen. Im Gegensatz dazu verursacht Puromycin eine vorzeitige Beendigung und fördert die Polysom-Demontage, wodurch der Pool von initiierenden mRNAs erhöht wird, die in der Lage sind, in SGs zusammenzusetzen. Experimentell erhöht die Puromycin-Behandlung die Anzahl der SGs oder senkt den SchwellenwertD, bei denen sie sich als Reaktion auf abgestuften Stress oder Arzneimitteldosierung bilden. Bei der Beurteilung der Wirkung von Puromycin ist es wichtig, ein submaximales Niveau des Medikaments von Interesse zu verwenden, da Puromycin erwartet wird, die Wirkung des Arzneimittels zu erhöhen und den Prozentsatz der Zellen, die SGs zeigen, zu erhöhen - dies kann nicht auftreten, wenn das Medikament / Stress verursacht SGs in 100% der Zellen anfangs. Dies steht im Gegensatz zu der Cycloheximid-Behandlung, die SGs zerlegt und am besten funktioniert, wenn ~ 95% der Zellen anfänglich SGs zeigen, so dass die größtmögliche Abnahme beobachtet und genau quantifiziert werden kann.

Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die Untersuchung von SGs in Säugetierzellen. Zu den Methoden gehören: (1) Immunfluoreszenzfärbung und ImageJ-Analyse zur Beurteilung der Kolokalisierung der klassischen SG-assoziierten Marker eIF4G, eIF3b und Ras GTPase-aktivierenden Proteinbindungsprotein 1 (G3BP1) in putativen SGs; (2) Oligo (dT) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (PolyA FISH) zur Detektion polyadenylierter mRNA; (3) Cycloheximid- und Puromycin-Behandlung, um zu bestimmen, ob stressinduzierte Herde im dynamischen Gleichgewicht mit Polysomen sind; Und (4) Ribopuromycylierung zur Beurteilung des Translationsstatus von Zellen, die putative SGs enthalten. Zusammen können diese Assays bestimmen, ob Stress-induzierte Herde als bona fide SGs eingestuft werden können.

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Protocol

1. Zellvorbereitung

  1. Fügen Sie autoklavierte Deckgläser zu 12 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen hinzu, wie in Fig. 1A gezeigt ; Dies kann mit einer sterilen Pasteurpipette erfolgen, die an einem Vakuum befestigt ist, um jedes Deckglas aufzunehmen. Vorsichtig auf das Deckglas auf der Seite des Brunnens klopfen, um das Absaugen zu lösen, so dass das Deckglas in den Brunnen fallen kann.
  2. Platte 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) Osteosarkomzellen pro Vertiefung bei einem Endvolumen von 500 μl Medium. Bewegen Sie die Platte seitlich und nach oben und unten mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
  3. Drücken Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer sauberen P1000-Spitze nach unten, um sicherzustellen, dass sich das Deckglas auf der Unterseite des Brunnens befindet und dass es keine Blasen unter dem Deckglas gibt.

2. Stresszellen

  1. Am nächsten Tag kontrollieren Sie die Tafel visuell, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt und gleichmäßig über das Deckglas hinweg konfludern, da Variationen zwischen saMples kann die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nachteilig beeinflussen. Verwenden Sie ein 10X-Ziel auf einem invertierten Gewebekulturmikroskop.
  2. Das Medium auf 37 ° C vorheizen. Vermeiden Sie es, kalte oder heiße Medien auf die Zellen zu applizieren, da diese Kälte- oder Hitzeschock verursachen.
  3. Medikamente in vorgeheizten Medien verdünnen Für jede unterschiedliche Arzneimittelkonzentration werden 2 Vertiefungen mit 500 μl Medium hergestellt. Bereiten Sie weitere 500 μl vor, um während des Pipettierens einen Verlust zu ermöglichen. Aliquot-4-Röhrchen mit jeweils 1,5 ml
    1. Für Natriumarsenit: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 1,5 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben oder 0,75 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 50 μM) zugegeben.
    2. Für Vinorelbin: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 22,5 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 150 μM) zugegeben oder 18,75 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben.
      HINWEIS: Natriumarsenit Ist ein gut charakterisierter und gängiger Stressgranulat-Induktor und wird daher klassisch als Positivkontrolle eingesetzt.
  4. Entfernen und entsorgen Sie das Medium aus den Brunnen B1 - 4 und C1 - 4. Fügen Sie das Medium mit Drogen hinzu und warten Sie 60 Minuten (Abbildung 1A).
    1. Füge 500 μl Medium mit 100 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B1 und B2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 50 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B3 und B4 hinzu.
    2. Füge 500 μl Medium mit 150 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C1 und C2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 125 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C3 und C4 hinzu.
  5. 30 min vor der Fixierung die Vertiefungen in Spalte 2 mit 5 μl Cycloheximid (1 mg / mL Stamm) und den Vertiefungen in Spalte 4 mit 2 μl Puromycin (1,25 mg / mL Stamm) behandeln. Schlagen Sie die Platte vorsichtig vor, bevor Sie die Platte wieder in den 37 ° C-Inkubator stellen.

3. Zellfixierung und Immunfluoreszenz

Nt "> HINWEIS: Vor dem Versuch sicherstellen, dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird. Puffer, einschließlich Phosphat-gepufferter Saline (PBS), 5% normales Pferdeserum (NHS) in PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA ) In PBS.

  1. Verwerfen Sie die Medien und waschen Sie die Wells mit Deckgläschen mit PBS. Abhängig von den verwendeten Medikamenten könnte es wichtig sein, die Medien, die Drogen enthalten, ordnungsgemäß zu verwerfen; Wenden Sie sich an die örtliche Umweltschutzstelle für spezifische Anweisungen. Um effizient zu waschen, füllen Sie eine Squeeze-Flasche mit PBS, schneiden Sie die Spitze, um einen sanften Fluss zu ermöglichen, anstatt einen engen Strom, und verwenden Sie diese, um PBS zu jedem Brunnen nach dem Ansaugen der ursprünglichen PBS hinzuzufügen.
  2. Fixieren Sie die Zellen mit ~ 250 μl 4% PFA für 15 min bei RT unter leichtem Rühren. Den Deckel komplett mit PFA bedecken; 250 μl sollte ausreichend sein, aber wenn nicht, fügen Sie mehr hinzu. Vermeiden Sie immer Pipettieren direkt auf die Deckgläser, da einige Zellen (oder Stressbehandlungen von Zellen) die Befestigung verändern können und tEr Kraft aus Pipettieren kann die Zellen zu vertreiben.
  3. PFA entfernen und ordnungsgemäß ablegen. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um Einzelheiten darüber zu erhalten, wie Sie Paraformaldehyd ordnungsgemäß verwerfen können.
  4. Füge ~ 250 μl Methanol (-20 ° C) hinzu und inkubiere für 5 min bei RT unter leichtem Schütteln; Dies permeabilisiert und flacht die Zellen.
  5. Entfernen und entsorgen Sie das Methanol und blockieren Sie die Zellen durch Anwendung von ~ 250 μl 5% NHS für 1 h bei RT O / N bei 4 ° C. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um weitere Informationen darüber zu erhalten, wie Sie Methanol ordnungsgemäß entsorgen können.
  6. Für primäre Antikörper verdünnen die Antikörper in 5% NHS.
    HINWEIS: Die Verwendung von mehreren SG-Markern ist der Schlüssel zur Bestätigung, ob die beobachteten Granulate bona fide SGs sind. Die Anzahl der SG-Marker, die verwendet werden können, hängt von den im Mikroskop verfügbaren Filtern ab. Wenn Standardgrün-, Rot- und Fernrot-Filter-Sets verfügbar sind, verwenden Sie G3BP1, eIF4G und eIF3b bei einer 1/250 Verdünnung.
  7. Waschen Sie die Wells 3x mit PBS und inkubieren Sie jede Wäsche für 5 min.
  8. Für sekundäre Antikörper verdünnen Sie alle sekundären Antikörper (1/250 Verdünnung) und Hoechst Farbstoff (1 / 1.000 Verdünnung) in 5% NHS.
    1. Für dieses Experiment (12 Deckgläser bei jeweils 250 & mgr; l - Gesamt: 3 ml 5% NHS) wurden 12 & mgr; l von jeweils folgend zugegeben: Cy2-Maus, Cy3-Kaninchen und Cy5-Ziege (jeweils 1/250 Verdünnung) ) Und fügen Sie 3 μl Hoechst Farbstoff hinzu.
    2. Inkubieren Sie die Deckgläser mit den sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Während dieses und der folgenden Schritte, schützen Sie die Proben vor Licht, indem Sie die Platte mit einer Schachtel abdecken oder indem Sie Folie über die Oberseite der Gewebekulturschale legen.
  9. Waschen wir unsDreimal mit PBS für jeweils 5 min.
  10. Montieren Sie die Deckgläser auf beschrifteten Glasschienen mit Montagemedium. Das Montagemedium in einem 37 ° C Heizblock für 10 min erhitzen; Dadurch verringert sich die Viskosität und erleichtert die Pipettierung. Mit einer geschnittenen P200-Spitze, pipettieren Sie 25 μl Montagemedium pro Deckglas auf eine Glasrutsche; 4-8 Deckgläschen können auf eine Glasrutsche passen, vorausgesetzt, dass die Mikroskopstufe dies zulässt. Mit feinen Pinzetten, übertragen Sie das Deckglas vom Brunnen zum Schieber und achten Sie darauf, die Zellseite auf das Montagemedium zu legen. Mit einem sauberen P200-Tip drücken Sie das Deckglas nach unten.
  11. Sobald alle Deckgläser montiert sind, verwenden Sie gefaltetes Laborgewebe, um das übermäßige Montagemedium aufzuräumen, indem Sie das Laborgewebe sehr fest auf die Folie drücken. Verwenden Sie eine Quetschflasche, die H 2 O enthält, um das überschüssige Füllmedium abzuspülen und wiederholen Sie das Blotting mit gefaltetem Laborgewebe, um das Wasser zu entfernen.

4. Fluoreszenz in situ </ Em> Hybridisierung (FISH)

  1. Platte und behandeln die Zellen, mit den Schritten 1 und 2.1-4 als Leitfaden; Es ist nur notwendig, die Zellen in Spalte 1 zu plattieren, da im folgenden Experiment nur 3 Decklippen benötigt werden.
  2. Sicherstellen, dass alle Puffer vorbereitet sind ( dh 4% PFA in PBS, 70% Ethanol in Wasser, 2x Salin-Natrium-Citrat (SSC) und 5% NHS), dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird, und das Der Hybridisierungsofen wird auf die entsprechende Temperatur erwärmt.
  3. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 aus, um die Zellen zu waschen und zu fixieren.
  4. Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von -20 ° C Methanol für 10 min.
  5. Das Methanol entfernen und die Deckgläser in 70% igem Ethanol inkubieren. Legen Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. Die Platte mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu vermeiden.
  6. Am nächsten Tag entfernen Sie das Ethanol und rehydrieren die Zellen durch Zugabe von 500 μl 2x SSC. Inkubieren Sie die Deckgläser für 5 min mit sanfter Bewegung bei RT.
  7. Entfernen Sie die 2x SSC und fügen Sie 500 hinzuΜL von 2X SSC. 5 min unter leichtem Rühren inkubieren.
  8. Legen Sie ein Stück Parafilm flach auf den Boden des Hybridisierungsofens. 25 μl Hybridisierungspuffer auf das Parafilm für jedes Deckglas pipettieren. Entfernen Sie das Deckglas aus der 24-Well-Schale (an dieser Stelle sind die Deckgläser zellseitig nach oben) und legen Sie die Deckglas-Zelle auf den Hybridisierungspuffer. Tun Sie dies bei 42 ° C oder wahlweise bei 65 ° C für 15 min.
    ANMERKUNG: Wenn Sie diesen Schritt bei 65 ° C abschließen, werden zelluläre RNAs denaturiert; Dies kann das Signal verbessern, wenn das PolyA durch Wechselwirkungen mit Proteinen maskiert wird.
  9. Verdünnen Sie die Biotin-Oligo (dT) -Sonde (100 ng / μL) im Hybridisierungspuffer auf eine Konzentration von 2 ng / μL; 25 μl pro Deckglas ist ausreichend.
  10. Für jedes Deckglas pipettieren Sie 25 μl Hybridisierungspuffer, der Biotin-Oligo (dT) enthält, auf das Parafilm. Heben Sie das Deckglas mit Pinzette auf und berühren Sie die Kante des Deckglases vorsichtig auf ein Laborgewebe, um überschüssiges zu entfernenHybridisierungspuffer Übertragen Sie das Deckglas in den Hybridisierungspuffer mit Biotin-Oligo (dT); Denken Sie daran, die Zelle Seite nach unten zu halten.
  11. Legen Sie die Deckgläser in eine Hybridisierungsbox, um die Verdunstung zu begrenzen. Inkubieren Sie die Deckgläser mit Biotin-Oligo (dT) in Hybridisierungspuffer für 60 min bei 42 ° C.
  12. Legen Sie 2x SSC in den Hybridisierungsofen, damit er auf 42 ° C äquilibrieren kann.
  13. Fügen Sie ~ 500 μl erwärmtes 2x SSC zu den Vertiefungen in der 24-Well-Schale hinzu und verwenden Sie Pinzette, um die Deckgläser in den Brunnen zu übertragen. 10 min inkubieren
  14. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt zweimal bei 42 ° C und dann zweimal bei RT.
  15. Führen Sie die Schritte 3.5-3.10 aus und stellen Sie sicher, dass Sie ein Streptavidin-Fluorochrom verwenden, um das Biotin-Oligo (dT) anstelle eines herkömmlichen Antikörpers zu detektieren.

5. Ribopuromycylierungsassay zur Beurteilung des Translationsstatus

  1. Platte U2OS Zellen auf Deckgläschen, wie in Schritt 1 angegeben, aber nur Platte ein Deckglas pro Zustand (in diesemFall, 3 Deckgläser: nicht kontaminiert, 100 μM Natriumarsenit und 150 μM Vinorelbin) (Abbildung 1 A).
  2. Stress-Zellen mit dem Protokoll in Schritt 2, Abschluss der Schritte 2.1-2.4.
  3. 5 min vor der Fixierung 2 & mgr; l Puromycin (Bestand: 1,25 mg / ml, 2 & mgr; l in 500 & mgr; l verdünnen, um eine endgültige Puromycinkonzentration von 5 & mgr; g / ml zu erhalten) und 2,9 & mgr; l Emetin (Bestand: 20 & mgr; g / ml; 2,9 & mgr; l zu der gleichen Lösung, die bereits das Puromycin enthält) zu jeder Vertiefung, die 0,5 ml enthält.
  4. Führen Sie die Schritte 3.1-3.10 wie oben beschrieben, mit einem Anti-Puromycin-Antikörper (1/1000 Verdünnung), um Puromycin zu erkennen. Idealerweise verwenden Sie zwei weitere SG-Marker in den übrigen Kanälen.
  5. Bei der Quantifizierung des Puromycin-Signals nehmen Sie alle Bilder mit der gleichen Belichtung. Wählen Sie diese Belichtung mit der hellsten (unbelasteten) Probe und nehmen Sie ein Bild so hell wie möglich ohne Sättigung.
    HINWEIS: Die Intensität des Anti-Puromycin-Fluoreszenzsignals repräsentiertDie laufende Übersetzung, da Puromycin eine Aminosäure substituiert, in das naszierende Protein einbringt und die vorzeitige Beendigung des Proteins erzwingt.

6. Bildaufnahme und -analyse

  1. Quantifizierung von Stressgranulaten
    1. Um SGs zu quantifizieren, erwerben Sie 3 - 5 Bilder mit> 100 Zellen pro Probe mit einem 40X Ziel. Alternativ können Sie Bilder mit anderen Zielen erfassen, aber dafür sorgen, dass> 100 Zellen pro Deckglas gezählt werden und dass die Vergrößerung groß genug ist, um die Granulate klar zu visualisieren. Tun Sie dies, indem Sie das Deckglas in fünf ungefähr gleiche Bereiche teilen und zufällig ein Feld aus jeder Region auswählen (Abbildung 1B ); Bilder des gleichen Feldes sollten alle Kanäle enthalten, um die Kolokalisierung von Markern zu beurteilen.
    2. Sobald alle Bilder erworben wurden, fusionieren Sie die Kanäle. Einige Kamera-Software wird dies automatisch tun, während andere manuelle Verschmelzung erfordern; Dies kann mit gemacht werdenImageJ, indem du alle Bilder öffnest und dann [Bild | Farbe | Zusammenführen von Kanälen].
    3. Manuell die Gesamtzahl der Zellen durch Zählen der Anzahl der Kerne, mit Hoechst als die Kerne Marker zählen. Manuell die Anzahl der Zellen zählen, die mehr als zwei SGs pro Zelle enthalten.
      HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise ein zusammengeführtes Drei-Kanal-Bild mit G3BP1 (grün), eIF4G (rot) und Hoechst (blau) verwenden, zählen Sie die Kerne (oder Anzahl der Zellen) mit dem blauen Kanal. Dann zählen SG-positive Zellen als solche mit zwei oder mehr gelben Foci pro Zelle. Die Granulate erscheinen gelb, da grün aus G3BP1 und rot von eIF4G gelb erscheinen, wenn kolokalisiert.
    4. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die SG positiv sind, indem Sie die Daten aus den 3-5 unabhängigen Regionen kombinieren und dann berechnen:
      Anzahl der SG-positiven / Anzahl der Kerne) * 100 = Prozent der SG-positiven Zellen
  2. Assessing Colocalization durch Line Scan Analysis - Manuelle Methode
    1. ÖffnenBildJ. Laden Sie es kostenlos herunter ()
    2. Öffnen Sie den ROI-Manager: [Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager ...].
    3. Öffnen Sie das zusammengeführte Bild in ImageJ: [Datei | Öffnen].
    4. Verwenden Sie das Zeilentool, das sich in der ImageJ-Symbolleiste befindet, fügen Sie eine Zeile hinzu, die durch einen SG geht, und achten Sie darauf, vor und nach dem SG einzuschließen. Fügen Sie diese Zeile zum ROI-Manager hinzu, indem Sie im ROI-Manager-Fenster auf [Hinzufügen] klicken.
    5. Split das verschmolzene Bild in separate Kanäle, um die Lokalisierung der einzelnen Marker auf das Granulat zu beurteilen: [Bild | Farbe | Split Channel]; Dies wird das verschmolzene Bild in drei Schwarz-Weiß-Bilder aufteilen.
    6. Stellen Sie im Schwarz-Weiß-Bild sicher, dass die Zeile ausgewählt ist. Die Zeile wird ausgewählt, wenn sie im Bild erscheint. Wenn nicht, klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf die Zeile im Panel; Dies markiert die Linie in blau im ROI-Manager-Fenster und macht die Linie sichtbar auf dem Schwarz-Weiß-Bild. Wenn die Zeile immer noch nicht erscheint, ist sicher, dass "alles anzeigen" istEckte im ROI-Manager und klicke dann auf die Zeile im Bild.
    7. Analysieren Sie die Intensität der Linie: [Analysieren | Plot-Profil]; Dies wird das "Plot Profile" -Fenster, das die Intensität des Signals über die Linie zeichnet zu bringen.
    8. Klicken Sie im Fenster "Plot Profile" auf [Liste], in dem ein Fenster mit den Rohdaten aus der Grafik aufgeführt wird. Kopiere alle Daten in diesem Fenster und füge sie in eine Tabellenkalkulation ein. Um dies zu tun, wählen Sie alle Daten im Fenster: [Bearbeiten | Alles auswählen]. Kopiere das Datum: [Bearbeiten | Kopieren]. Öffnen Sie eine Tabellenkalkulation und fügen Sie die Daten ein: [Bearbeiten | Paste].
    9. Komplette Schritte 6.2.6 - 6.2.8 für jeden Kanal separat. Sei sicher, den Kanal zu beurteilen, der beurteilt wird.
    10. In einer Kalkulationstabelle einen Liniengraphen der Ergebnisse erzeugen. Wählen Sie die Spalten aus, die Daten enthalten, indem Sie [Steuerung] drücken und auf den Buchstaben oben in jeder Spalte klicken. Dann wählen Sie Liniendiagramm: [Einfügen | Liniendiagramm].
    11. Wiederholen Sie diese Analyse für multIple Stressgranulat über mehrere unabhängige Experimente hinweg.
  3. Assessing Colocalization durch Line Scan Analyse - ImageJ Plugin
    1. Downloaden und installieren Sie das RGB-Profil-Tool von der ImageJ-Website (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Bei korrekter Installation sollte in der Symbolleiste ein rotes, grünes und blaues (RGB) -Symbol angezeigt werden.
    2. Öffnen Sie das Bild ( zB Tiff, JPG) in ImageJ: [Datei | Öffnen].
    3. Klicken Sie auf das RGB-Symbol in der ImageJ-Symbolleiste.
    4. Klicken Sie auf und ziehen Sie, um eine Zeile hinzuzufügen, die sich durch einen SG erstreckt. Ein Bild des Histogramms erscheint in einem Popup-Fenster.
    5. Speichern Sie die Daten als Bild: [Datei | Speichern unter | Tiff]. Alternativ exportieren und grafisch die Daten in einem anderen Grafikprogramm mit Schritt 6.2.8 von oben.

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Representative Results

Stress-induzierte Herde sind nicht unbedingt SGs. SGs werden als zytoplasmatische Foci klassifiziert, die mRNAs, Translationsinitiationsfaktoren und RNA-bindende Proteine ​​enthalten und im Gleichgewicht mit aktiver Translation stehen. Das obige Protokoll kann als Vorlage verwendet werden, um zu charakterisieren, ob eine gegebene Spannung bona fide SGs induziert.

SGs kolokalisieren mit anderen bekannten SG-Markern, einschließlich Proteinen und mRNA. SA und VRB induzieren zytoplasmatische Herde, die G3BP1, eIF4G und eIF3b enthalten (Abbildung 2A ). Die Kolokalisierung dieser Marker wird mittels Linienscananalyse und Einzelkanalbildern mit erhöhter Vergrößerung bestätigt (Abbildung 2A ). Zusätzlich enthalten diese Foci Mrna, wie durch PolyA FISH angegeben, und das Oligo (dT) -Signal kolokalisiert mit dem G3BP1 Immunfluoreszenzsignal ( 2B ). Es ist entscheidend zu zeigen, dass die PolyA-FISHSignal überlappt mit einem bekannten SG-Marker, da ein Stress mehrere Arten von Herden fördern könnte.

SGs treten während eines translatorisch gehemmten Zustands auf. Sowohl VRB als auch SA fördern einen translatorisch unterdrückten Zustand, wie experimentell mit Ribopuromycylierung beurteilt (Abbildung 3 ). Bona fide SGs sind im dynamischen Gleichgewicht mit aktiv translatierenden Polysomen. SA- und VRB-induzierte SGs werden mit CHX aufgelöst, das Polysomen auf mRNAs abfängt und somit die Polysom-Demontage stoppt und SGs verhindert (Abbildung 4A, 4B ). Umgekehrt werden nach der Behandlung mit puro mehr SA- und VRB-SGs induziert, da puro die Polysom-Demontage begünstigt und somit die SG-Bildung begünstigt (Abbildung 4A, 4C ).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass VRB, wie bei der positiven Kontrolle SA, bona fide SGs induziert, dass: (1) mit bekannten SG-Markern kolokalisieren, (2) sowohl Protein als auch mRNA einschließen ( Abb Re 2), (3) in Zellen gefunden, wo die Translation unterdrückt wird (Abbildung 3 ), und (4) im dynamischen Gleichgewicht mit aktiver Translation sind (Abbildung 4A-4C ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Experimentelle Diagramme. ( A ) Samenzellen auf Deckplättchen, die zuvor in eine Platte mit 24 Vertiefungen gegeben wurden, wie angegeben. Behandeln Sie die Zeilen A und B für 60 min mit SA oder VRB unter Verwendung der Konzentration in μM wie angegeben. Nach 60 min fügen Sie CHX (Endkonzentration: 20 μg / ml für Säule 2) oder puro (20 μg / ml Puromycin für Säule 4) zu dem Arzneimittel enthaltenden Medium hinzu. Fortsetzung der Inkubation für weitere 30 Minuten vor der Fixierung und Färbung. ( B ) Diagramm eines Deckglases, das die Felder angibt, die zum Zählen abgebildet werden sollen. Das Deckglas ist in fünf ungefähr gleiche Regionen unterteilt; In jeder Region wird ein Bild aufgenommen."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: SA und VRB induzieren zytoplasmatische Foci, die SG Marker anpoly (A) mRNA enthalten. ( A ) U2OS-Zellen immunostained für G3BP1 (grün), eIF3b (rot) und eIF4G (blau). Die Zellen wurden mit 100 & mgr; M SA oder 150 & mgr; M VRB für 60 min behandelt oder wurden nicht behandelt (Kontrolle). Zoomed Regionen sind vergrößert (2X) und als separate Kanäle in schwarz und weiß (unten) dargestellt. Der Graph zeigt die Zeilenabtastung eines Bereichs (Weißlinie) und zeigt das Ausmaß der Überlappung oder Kolokalisierung. Der Skalenbalken repräsentiert 10 μm. ( B ) PolyA-FISH, gekoppelt mit Immunfärbung, detektiert polyA-mRNA mit einer Oligo (dT) 40- Sonde (rot), G3BP1 (grün) wird mit einem Anti-G nachgewiesen3BP-Antikörper und Kern-DNA wird mit Hoechst-Farbstoff (blau) nachgewiesen. Zoomed Regionen (2X), Einkanal-Bilder und die Linien-Scan-Analyse zeigen Kolokalisierung. Maßstab = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: SA- und VRB-Behandlung CauseTranslation Repression. Die Immunfluoreszenz von U2OS-Zellen wurde mit Puromycin für 5 min nach den angegebenen Behandlungen pulsmarkiert. Puromycin (grün), eIF3b (rot) und nukleare DNA, gefärbt mit Hoechst (blau). Die Zellen wurden mit 100 μM SA oder 150 μM VRB für 60 min behandelt oder wurden nicht behandelt (Kontrolle). Maßstab = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um einen größeren Vers zu sehenIon dieser Figur.

Abbildung 4
Abbildung 4: SA und VRB induzieren zytoplasmatische Foci, die sich im dynamischen Gleichgewicht mit Polysomen befinden. ( A ) Allgemeines Schema, das die Polysom ​​/ SG-Beziehung beschreibt. ( BC ) U2OS-Zellen, die für G3BP1 (grün), eIF3b (rot) und nukleare DNA mit Hoechst (blau) gefärbt wurden. Die Zellen wurden mit 100 μM SA oder 150 μM VRB für 60 min behandelt oder wurden vor der Zugabe von ( B ) CHX (Cycloheximid, 20 μg / ml), ( C ) puro (Puromycin, 10 μg / ml) nicht behandelt (Kontrolle) ) Oder kein Additiv für weitere 30 min Inkubation. Die Zahlen entsprechen dem Prozentsatz der Zellen mit SGs in einem repräsentativen Experiment. Maßstab = 25 μm, in (BC). Bitte klicken Sie hier um eine größere zu sehenVersion dieser Figur.

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Discussion

Wie durch immunhistologische Studien bei multiplen Krankheiten belegt, führt chronischer Stress zur Bildung verschiedener intrazellulärer Herde. Zum Beispiel sind die meisten neurodegenerativen Erkrankungen durch intrazelluläre Aggregate von unlöslichen Proteinen gekennzeichnet. Die Anwesenheit von SG-assoziierten Proteinen in solchen Aggregaten ist oft die Grundlage für den Schluss, dass solche Herde SGs sind. Eine ähnliche Schlussfolgerung wird auch gezogen, wenn SG-Marker-positive zytoplasmatische Herde in Zellen beobachtet werden, die mit neuen Stressreizen behandelt wurden. Dieses Protokoll bietet einen einfachen Workflow, um bona fide SGs zu identifizieren.

Es müssen mehrere Kriterien erfüllt werden, damit mutmaßliche SGs als solche bestätigt werden können, einschließlich der Charakterisierung von Komposition und Dynamik. Zuerst sind SGs zytoplasmatische Herde, die translatorisch blockierte mRNPs enthalten. Der erste Ansatz besteht darin, ihre Zusammensetzung unter Verwendung von zwei mikroskopisch basierten Techniken zu charakterisieren, nämlich PolyA-FISH und IF. FISH ist eine zuverlässige Methode zur visuellenIze mRNAs, die mit SGs kolokalisieren. Eine Oligo (dT) 40- Sonde wird verwendet, um polyadenylierte mRNAs zu detektieren, die unter Stressbedingungen in SGs verpacken. Da Oligo (dT) keine deadenylierten mRNAs, die Kernkomponenten von Processing Bodies (PBs) sind, nicht nachweisen kann, ist die Anwesenheit eines starken Oligo (dT) -Signals in zytoplasmatischen Herden ein erster Hinweis (obwohl nicht genug für die Definition), dass diese Brennpunkte sind SGs Der zweite Test soll die Kolokalisation eines Poly (A) -Signals mit anderen SG-Markern ( zB G3BP1) demonstrieren (Abbildung 2A ). Dies geschieht durch die Durchführung von IF gegen SG-Markerproteine. Die SG-Marker eIF3b, eIF4G und G3BP1 werden routinemäßig verwendet, weil eIF3b und eIF4G Translationsinitiierungsfaktoren sind, die als Komponenten von 48S * -Komplexen bekannt sind und G3BP1 für die SG-Bildung erforderlich ist (Abbildung 2B ). Es ist wichtig zu betonen, dass mehr als ein SG-Marker erforderlich ist, da unterschiedliche Belastungen verschiedene SG-assoziierte Faktoren für SGs rekrutieren, und einige Stress kann cAuse-Protein-Aggregation, die für die SG-Bildung verwechselt werden könnte.

Zweitens werden SGs wegen der Translationsinhibierung gebildet. Während die Hemmung der Translation durch verschiedene Ansätze nachgewiesen werden kann ( z. B. durch traditionelle [ 35 S] Met Chase Markierung), ist die Ribopuromycylierung bevorzugt, da sie die fortlaufende Proteinübersetzung in behandelten Zellen nachweist. Diese Technik ist auch mit der Standard-Immunfluoreszenz gegen SG-Marker kompatibel und ermöglicht so die gleichzeitige Überwachung von SGs und den Grad der Translationshemmung in einzelnen Zellen. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist , fördern SA und VRB die SG-Bildung in unterschiedlichem Ausmaß. Während SA SGs in fast 100% der Zellen verursacht, fördert VRB die SG-Bildung in etwa 75% der Zellen. Die Fähigkeit, SGs zu fördern, korreliert mit dem Grad der Translationshemmung: Während unbehandelte Zellen ein hohes Basalniveau der Translation haben, hemmt SA die Translation vollständig, aber nur VRB paHemmt die Übersetzung (Abbildung 3 ).

Drittens sind SGs dynamisch und stehen im Gleichgewicht mit übersetzenden Polysomen. Die Behandlung von Zellen mit Cycloheximid vor Stress oder gleichzeitig mit Stress verhindert Polysom-Demontage und SG-Bildung. Das SG-Polysom-Gleichgewicht ist bidirektional, da gestresste Zellen, die SGs aufweisen, mit Cycloheximid behandelt werden können, um die SG-Demontage durchzuführen, indem mRNAs in Polysomen oder Monosomen gefangen werden, wann immer sie produktiv initiiert werden. Eine wichtige Kontrolle ist die Verwendung von Puromycin, das die Dehnung durch Förderung der vorzeitigen Beendigung hemmt, wodurch die Menge an nicht-polysomalen mRNPs, die für die SG-Bildung verfügbar sind, erhöht wird. Dramatische Veränderungen der SGs werden beobachtet, wenn die SA- oder VRB-Behandlung mit der CHX- oder Puro-Behandlung gekoppelt ist (Abbildung 4 ). Somit ist die Beurteilung, ob putative SGs bei der Cycloheximidbehandlung aufgelöst sind, aber durch Puromycin verstärkt oder nicht beeinflusst werden, ein wichtiger experimenteller Parameter für die Verwendung in SG identifiKation. Die Emetin-erzwungene SG-Demontage in sehr kleinen, nicht-adhärenten, primären menschlichen Knochenmark-CD34 + -Zellen wurde erfolgreich durch die Behandlung der Zellen in Suspension vor der Cytospinierung gezeigt 32 .

Natriumarsenit wird weithin verwendet, um SGs durch Induzieren der eIF2-α-Phosphorylierung 33 auszulösen, aber es sollte sorgfältig titriert werden , da es viele Proteine ​​anspricht und eine Anzahl von Signalwegen 34 , 35 aktiviert. Verschiedene Zelllinien zeigen unterschiedliche Empfindlichkeitsgrade gegenüber Natriumarsenit. U2OS sind relativ empfindlich (100 μM), während COS7, MEFs und HeLa 200 μM benötigen. DU-145 6 , primäres normales menschliches Knochenmark CD34 + Zellen 32 , menschliche Lymphoblasten 36 , Mauskortikale Neuronen 37 und Huh7-Zellen 31 benötigen 500-1000 & mgr; M.

Der hier beschriebene experimentelle Arbeitsablauf ermöglicht die Detektion von SGs in verschiedenen Zellen und unter verschiedenen Belastungen. Der wesentliche Vorteil dieses Workflows liegt darin, dass es einfach ist und die eindeutige Erkennung von bona fide SGs sowie die gleichzeitige Untersuchung der zellulären Translation in stressbehandelten Zellen ermöglicht. Dieses Protokoll verwendet U2OS-Zellen, kann aber für verschiedene Zelllinien oder sogar für Primärzellen verändert werden. Eine aktuelle und umfassende Liste der Zellen, die für Stressgranulatstudien verwendet werden, ist eine Überprüfung 11 . Die Anzahl der Zellen sollte angepasst werden, um 80% Konfluenz am Tag der medikamentösen Behandlung zu erreichen. Die Konzentration und Dauer der medikamentösen Behandlung sollte ebenfalls angepasst werden, da die Zellen unterschiedlich reagieren. Darüber hinaus, während dieses Protokoll für ein 24-Well-Format eingerichtet ist, kann es auf jede Größe Platte oder Schale angepasst werden, wo Deckgläser (beliebige Größe) können flach während der Beschichtung und Medikament behandelnNt Zelllinien, die stabil SG / PB-Marker exprimieren, wurden in Hochdurchsatz-, siRNA-basierten Bildschirmen 33 und Live-Zell-Bildgebung 38 verwendet. Bildbasiertes Screening wurde unter Verwendung von HeLa-Zellen verwendet, die für den endogenen SG-Marker PABP gefärbt waren, um chemische Verbindungen zu detektieren, die die SG-Anordnung 39 blockieren. Es wird erwartet, dass dieser Workflow in zukünftigen Studien und Anwendungen nützlich sein wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken den Mitgliedern der Iwanow- und Anderson-Labore für ihre hilfreiche Diskussion und Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [GM111700 und CA168872 bis PA, NS094918 bis PI], dem National Science Center in Polen [gewährt UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 an WS] unterstützt. WS erkennt auch das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung in Polen (Mobility Plus-Programm) und die polnisch-amerikanische Fulbright-Kommission für ihre finanzielle Unterstützung seiner Forschung in den USA an.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

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References

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