Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L’acide sialique (Sia) est un constituant très important des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. En raison de sa position à des terminaisons non réductrice des oligo - et polysaccharides, ainsi que ses caractéristiques chimiques, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur différent. En modifiant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule, l’acide sialique dépendant des interactions seront par conséquent influencées. Cela peut être utile pour étudier les interactions acide sialique-dépendante et a le potentiel d’influencer certaines maladies d’une manière bénéfique. Par l’intermédiaire de glycosylation métabolique (MGE), l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée. Dans les présentes, cellules, tissus ou même ensemble animaux est traités avec C2-modified dérivés de N- acétylmannosamine (ManNAc). Ces sucres aminés agissent comme molécules précurseurs de l’acide sialique donc métabolisés en acide sialique espèces correspondantes et sont exprimées sur glycoconjugués. En appliquant cette méthode produit des effets fascinants sur divers processus biologiques. Par exemple, il peut réduire considérablement l’expression de l’acide polysialique (polySia) dans les cellules neuronales traitées et affecte donc la différenciation et la croissance neuronale. Ici, nous montrons la synthèse chimique de deux des plus courants dérivés C2-modification N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) ainsi que de N- butanoylmannosamine (ManNBut) et en outre montrer comment ces non naturels sucres aminés peuvent être appliquées dans les expériences de culture cellulaire. L’expression des espèces acide sialique modifié est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et plus analysée par spectrométrie de masse. Les effets sur l’expression acide polysialique ont été élucidés par Western blot, en utilisant un anticorps acide polysialique disponible dans le commerce.

Introduction

L’acide sialique est un monosaccharide qui se trouvent généralement à la termini non réductrice des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. Parmi tous les monosaccharides, l’acide sialique présente des caractéristiques chimiques uniques. Il a un squelette d’atomes C 9, un groupe carboxylique en position de C-1, qui est déprotoné et ainsi négativement chargées sous des conditions physiologiques et une fonction amine en position C-5. Bien que plus de 50 variantes d’acide sialique naturels ont été caractérisés à ce jour1, la forme prédominante de l’acide sialique trouvée chez l’homme est l’acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac). Autres mammifères expriment également des quantités plus élevées de N- GLYCOLYLNEURAMINIQUE acide (Neu5Gc)2,3.

En raison de sa position exposée en glycoconjugués, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur, par exemple, la liaison dépendant d’hémagglutinine du virus de la grippe à hôte cellules4. Un épitope acide sialique avec des fonctions biologiques importantes, en particulier au cours de l’embryogenèse et dans le système nerveux, est l’acide polysialique. L’acide polysialique est un polymère de jusqu'à 200 acides sialiques liés à 2,8 alpha. Le transporteur de la protéine majeure de l’acide polysialique est la molécule d’adhésion cellulaire neuronal (NCAM). Polysialic acide expression module la propriété adhésive de la NCAM qu’expression acide polysialique diminue l’adhérence et augmente la plasticité du système nerveux5.

Changements dans l’expression de l’acide sialique (poly) affecteront en fin de compte une multitude d’interactions biologiques différentes. Ceci peut être utilisé pour étudier les processus dépendants connus acide sialique au niveau moléculaire, de découvrir les interactions glycoconjugués roman, ou d’explorer des approches thérapeutiques possibles. Il existe différentes méthodes disponibles permettant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée, par exemple le traitement avec l’acide sialique glycosidases spécifique (sialidases), l’inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide sialique6 ,7,8, ou faire tomber ou changement de l’expression de l’enzyme clé de la biosynthèse de l’acide sialique9.

Une autre méthode polyvalente pour moduler l’expression de l’acide sialique est MGE (génie métabolique également connu sous le nom d’oligosaccharide, MOE). Dans les présentes, cellules, tissus ou même les animaux sont traités avec non naturels dérivés de ManNAc portant modifications C2-aminés. Étant des molécules précurseurs de l’acide sialique, après absorption cellulaire, ces analogues de ManNAc sont les acides sialiques métabolisés à non-naturelles unidirectionnels et peuvent être exprimées sur glycoconjugués sialylés. Les cellules traitées avec ManNAc dérivés transportant aliphatiques C2-modifications, telles que ManNProp ou ManNBut, intègrent l’acide N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou l’acide N- butanoylneuraminic (Neu5But) dans leur glycoconjugués10 , 11. à l’aide de groupes fonctionnels à la position C2 de ManNAc, les naturels les acides sialiques non naturels peuvent être couplés, par exemple, via la ligature de Staudinger ou la cycloaddition de bases azoture, avec les colorants fluorescents et donc visualisées sur la surface de cellule12.

L’expression de ces acides sialiques de non naturel a des effets intrigantes sur nombreux processus biologiques, y compris les infections pathogènes, l’adhérence et la migration des cellules tumorales, d’adhérence cellulaire générale, ainsi que de vascularisation et de différenciation (pour révision Voir : Wratil et al. 13). il est intéressant, MGE avec N-acyl modifié mannosamines peut également être utilisé pour gêner l’expression de l’acide polysialique. L’acide polysialique est généré par deux polysialyltransferases différentes (ST8SiaII et ST8SiaIV). Il a été démontré, que polysialyltransferase ST8SiaII est inhibée par l’acide sialique unnatural précurseurs, tels que ManNProp ou ManNBut14,15. En outre, il a été démontré dans les cellules de neuroblastome humain que ManNProp ou ManNBut application réduit également sialylation au total15.

MGE avec N-acyl modifié mannosamines est un facile d’appliquer la méthode qui a été utilisé avec succès, non seulement dans les mammifères et la culture de cellules de bactéries mais aussi dans tout animaux de différentes espèces, telles que Caenorhabditis elegans16, poisson zèbre17ou souris18,19,20,21. En particulier les dérivés de ManNAc portant modifications aliphatiques, y compris ManNProp et ManNBut, sont négligeable cytotoxiques, même à des concentrations millimolaires dans un milieu de culture cellulaire ou de plasma sanguin. En outre, ils sont relativement faciles à synthétiser.

Ici, nous donne des détails sur comment utiliser MGE avec la N-acétyl modifiés mannosamines. Tout d’abord, la synthèse chimique de deux des dérivés ManNAc plus largement utilisés dans ce domaine, ManNProp et ManNBut, s’explique. Ensuite, nous montrons comment MGE peut être appliqué dans une expérience in vivo . À titre d’exemple, la lignée de cellules de neuroblastome Kelly a été choisie pour démontrer une diminution d’expression de l’épitope polysialique par Western blot après le traitement avec les dérivés de ManNAc. Les acides sialiques non naturelle sur la surface de la cellule ont été quantifiés par HPLC et plus analysés par spectrométrie de masse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation des tampons et réactifs

  1. Préparation de solution de méthylate de sodium 3 mM
    1. Dissoudre le méthylate de sodium 8,1 mg dans 50 mL de méthanol (3 mM) dans une bouteille de verre de 100 mL avec une barre de remuer. Conserver à température ambiante (RT) pendant plusieurs semaines.
  2. Préparation de tampon Tris-HCl
    1. Combinez les 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl et 146 mg EDTA dans un flacon de verre de 100 mL avec une barre de remuer et dissoudre dans 80 mL d’eau.
    2. Ajouter hydroxyde de sodium (1 M, dans l’eau) ou HCl (20 %, dans l’eau) à la solution de l’agitation, tout en respectant le pH en utilisant un pH-metre et ajuster le pH à 8.0.
    3. Ajouter le volume d’eau nécessaire pour obtenir un volume final de 100 mL. Filtrer la solution à l’aide d’un système de filtration stérile de 0,22 µm.
      Remarque : 100 mL Tris-HCl tampon contiendra NaCl 150 mM, 10 mM Tris-HCl et 5 mM EDTA (pH 8,0). La solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  3. Préparation de la solution de l’aprotinine
    1. Dissoudre 10 mg aprotinine dans 1 mL d’eau (1,54 mM). Partie aliquote de la solution d’aprotinine dans 10 x 1,5 mL-plastique tubes (100 µL). Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  4. Préparation de la solution leupeptine
    1. Dissoudre 10 mg leupeptine dans 2 mL d’eau (10 mM). Partie aliquote de la solution de leupeptine 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  5. Préparation de la solution de fluorure (PMSF) phénylméthylsulfonyle
    1. Dissoudre 34,8 mg PMSF dans 2 mL d’éthanol (100 mM). Partie aliquote de la solution PMSF à 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  6. Préparation de la solution 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dichlorhydrate (DMB)
    1. Mélanger 15,62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoéthanol et 48 µL, bisulfite de sodium-solution (39 %) et ajouter 9,6 mL d’eau (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoéthanol et bisulfite de sodium 0,19 %). Partie aliquote de la solution DMB en 40 x 1,5 mL-plastique tubes (250 µL). Boutique abri de la lumière à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  7. Préparation de la solution (TFA) d’acide trifluoroacétique 1 M
    1. Ajouter 770,3 µL de 100 % TFA à 9,23 mL d’eau dans un tube en plastique de 15 mL (1 M). Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  8. Préparation de la solution AGT 120 mM
    1. Ajouter 92,4 µL AGT (100 %) à 9,91 mL d’eau (120 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  9. Préparation de solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 400 mM
    1. Dissoudre 160 mg NaOH dans 10 mL d’eau (400 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  10. Préparation du tampon de lyse Western blot
    1. Dissoudre 5,84 g de NaCl, 0,1 g de Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2et 1 g Triton-X100 dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,8. Conserver à 4 ° C. Ajouter 100 µL de chaque inhibiteur de la protéase (aprotinine, leupeptine et PMSF) avant d’utiliser le tampon de lyse.
  11. Préparation de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) tampon
    1. Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,5 g et 0,1 g SDS dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,3. Magasin à température ambiante.
  12. Préparation du tampon de Western blot
    1. Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,1 g dans 90 mL d’eau et ajouter 10 mL d’éthanol. Magasin à température ambiante.
  13. Préparation de la solution de blocage
    1. Dissoudre 1 g de puissance de lait sans gras dans une solution saline tamponnée au phosphate de 25 mL (PBS). Préparez toujours frais.

2. synthèse des ManNProp et des N-acyl-modification Mannosamines

  1. Dissoudre 431,2 mg de chlorhydrate de mannosamine en solution de méthylate de sodium 3 mM 10 mL dans un flacon de verre de 50 mL avec une barre de remuer.
  2. Laisser refroidir le mélange sur la glace à 0 ° C. À la solution en remuant, ajouter lentement goutte à goutte 210 chlorure de propionyle µL (2,4 mmol), ou chlorure de butanoyl 248 µL (2,4 mmol) de synthétiser les ManNProp ou ManNBut, respectivement. Incuber le mélange en remuant à 0 ° C pendant 4 h.
  3. Transvaser la solution dans un tube en plastique de 50 mL. Piquez 4-8 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Congeler rapidement la solution à l’aide d’azote liquide et ensuite lyophiliser (gel sec) pendant 48 heures ou jusqu'à ce qu’il soit complètement sec.
  4. Mélanger 350 g de gel de silice 60 avec 750 mL d’éthyle acétate/méthanol/eau (15:2:1) (il s’agit d’une suspension). Remplir une colonne de verre (35 mm de diamètre et 70 cm de longueur) avec la suspension du gel de silice 60 et laver la colonne préparée avec un autre 100 mL éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) avant utilisation.
  5. Dissoudre les produits séchés de l’étape 2.3 (produit sec de 5 g) dans 10 mL d’éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) et la charge à l’aide d’une pipette sur la silice gel colonne. Recueillir les fractions 4 mL après 500 mL (pour ManNProp). Remarque : ManNBut va éluer de la colonne après environ 700 mL.
  6. Transférer les fractions éluées dans les tubes en plastique de 15 mL. Piquez 3-6 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Rapid geler la solution à l’aide d’azote liquide et par la suite il lyophiliser jusqu'à ce qu’il soit complètement sec.
    Remarque : Les produits lyophilisés peuvent être stockés pendant plusieurs mois à température ambiante.
  7. Vérifier la pureté des produits par spectrométrie de masse (voir section 9).
    Remarque : Vous pouvez également pureté peut également être vérifiée par 1H résonance magnétique nucléaire (RMN).

3. Culture cellulaire

  1. Cellules de neuroblastome de Kelly culture dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % sérum de veau fœtal, 100 pénicilline U, streptomycine 100 mg, 2 mM de L-glutamine contenant 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp ou 5 mM ManNBut, à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Les cellules cultivées dans un milieu sans ManNAc ou ses analogues sont utilisés comme un contrôle.
  2. Avant l’application de la mannosamines, détacher les cellules de neuroblastome Kelly en incubant les pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS) et compter à l’aide d’un compteur de Neubauer-chambre ou cellule. Les cellules aux numéros définis selon la taille du plat/plaque de graines.
    1. Pour mesurer l’acide sialique monosaccharides, graines 1 x 105 cellules de 500 µL de milieu dans une plaque de 48 puits vitroplants. Pour l’analyse des acides polysialique, graines 1 x 106 cellules dans 3 mL de milieu sur une boîte de Petri de cellule de diamètre 6 cm. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2. Remplacer le support de toutes les 24 h.
      Remarque : L’effet de MGE augmente avec la durée totale du traitement. Pour un rendement métabolique élevé traiter les cellules pendant 5 à 7 jours.
  3. Après le traitement, décanter le milieu. Laver les plaques/plats avec du PBS. Détacher les cellules en les incubant pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS). Neutraliser la trypsine en ajoutant le même volume de milieu de culture cellulaire dans les cellules individuelles. Transférer les cellules individuelles dans des tubes en plastique de 15 mL. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 500 x g et éliminer le surnageant.
    1. Ajouter 5 mL des cellules de PBS et centrifuger (voir étape 3.3). Répétez la procédure de nettoyage deux fois plus.
      Remarque : Le culot de cellules lavées sans surnageant peut être stocké à-20 ° C pendant plusieurs jours. Si l’expression de l’acide polysialique doit être élucidé continuent à l’article 10.

4. cellule Lysis pour analyse par CLHP

  1. Préparation du tampon de lyse HPLC
    1. Mélanger 5 mL Tris-HCl de tampon, 5 µL de solution d’aprotinine, 20 µL de solution de leupeptine et 50 µL de solution de PMSF.
      NOTE : tampon de lyse de HPLC de 5 mL contient 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinine, 40 µM leupeptine et 1 mM PMSF (pH 8,0). Ce tampon toujours doit être préparé fraîche avant de la lyse cellulaire.
  2. Remettre en suspension les granules des cellules recueillies (étape 3.3) chaque dans 500 µL glacee HPLC-tampon de lyse et ultra-laisser agir les échantillons avec une aiguille de processeur ultra sonique trois fois pour une période de 30 s à feu moyen-vif amplitudes. Laisser refroidir les échantillons sur glace pendant au moins 1 min entre les cycles.

5. la séparation de la Fraction de Membrane

  1. Centrifuger les échantillons de cellules lysées pendant 2 h à 20 000 x g et 4 ° C. Séparer le surnageant (environ 480 µL), représentant des protéines cytosoliques, dans des tubes en plastique de 1,5 mL. Déterminer la concentration de protéines de ces fractions en utilisant, par exemple, le Bradford ou dosage bicinchoninic acid (BCA).
    NOTE : La concentration de la protéine (environ 1 mg/mL) des fractions cytosoliques peut plus tard être liée aux quantités mesurées de l’espèce de l’acide sialique respecté. Le plomb représente la fraction de membrane, qui est utilisée à l’étape 6.1.

6. acide hydrolyse

NOTE : Oligo - et polysaccharides dans les membranes cellulaires sont hydrolysés en monosaccharides. En outre, possible O-modifications dans les monosaccharides sont hydrolysés, aussi bien. C’est nécessaire pour l’analyse quantitative de HPLC, parce que l’écrasante majorité des acides sialiques dans les fractions membranaires est naturellement intégrée à glycoconjugués et pourrait éventuellement porter O-acétyl ou O- lactolyl modifications.

  1. Ajouter 150 µL 1 M TFA-solution pour les fractions de membrane séparées (pellet du chapitre 5). Incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C sous agitation à 200-600 tr/min.
  2. Centrifuger les échantillons pour environ 30 min à 20 000 x g et 21 ° C à l’aide de tubes filtre 0,5 mL avec 3 membranes d’exclusion kDa, jusqu'à ce que le volume de la phase supérieure est inférieure à 20 µL.
    Remarque : Cette étape est importante pour éliminer les débris moléculaire plus élevé.
  3. Transférer la phase inférieure contenant des molécules plus petites, notamment l’espèce acide sialique, dans des tubes en plastique de 2 mL. Piquez 2-4 trous dans les bouchons des tubes en plastique avec une aiguille fine. Rapid congeler les échantillons à l’aide d’azote liquide et ensuite leur lyophiliser du jour au lendemain.
    Remarque : Les échantillons séchés peuvent être stockés pendant plusieurs jours à RT., remplacera un cap sans trous pour une conservation plus longue.

7. fluorescent étiquetage

  1. Remettre en suspension les échantillons séchés à 10 µL de solution de TFA 120 mM et ajouter 50 µL de solution de DMB. Transférer les échantillons dans des tubes de sombre 1,5 mL pour les protéger des rayons ultraviolets.
  2. Pour les normes, dissoudre 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, dans l’eau) ou 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, dans l’eau) dans 10 µL de solution de TFA 120 mM en tubes sombres de 1,5 mL. Ajouter 50 µL de solution de DMB.
  3. Incuber les échantillons de la membrane cellulaire et les normes pour 1,5 h à 56 ° C abri de la lumière. Après l’incubation, ajouter 4 ml 400 mM solution de NaOH à chaque échantillon pour arrêter la réaction d’étiquetage.

8. analyse par CLHP

Remarque : Les échantillons étiquetés sont analysés sur un système HPLC équipé d’une colonne C18 RP (110 Å, granulométrie 3 µm, 4.6 x 150 mm), un détecteur de fluorescence et un collecteur de fraction. Les solvants utilisés sont le méthanol, l’acétonitrile et l’eau. Veillez à dégazer tous les solvants avant les mesures, si le système de CLHP manque un dégazeur interne.

  1. Régler la température de la colonne à 40 ° C et de configurer le détecteur de fluorescence avec 373 nm pour l’excitation et 448 nm pour l’émission, respectivement. Injecter le volume d’échantillon de 10 µL et séparez les sondes pendant 50 min à 0,5 mL/min débit par méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86) comme l’éluant. Pour l’analyse de spectrométrie de masse, recueillir les pics d’intérêt.
    Remarque : Neu5Gc est censé d’éluat après 6-8 min, Neu5Ac après 9 à 12 min, Neu5Prop après 17-23 min et Neu5But après 38-44 min. Les échantillons fractionnés peuvent être conservés pendant plusieurs heures à 4 ° C, abri de la lumière.
  2. La mesure de chaque échantillon, laver la colonne pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min (volumes de colonne 1,5 ≈) avec méthanol/acétonitrile/eau (6:25:69) et rééquilibrer le système pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min avec méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86).
  3. Pour une analyse quantitative, calculer l’aire sous la courbe des pics d’intérêt en utilisant le logiciel d’exploitation du système HPLC respectifs22acide sialique.
    NOTE : Données obtenues peuvent être liées à la Neu5Ac ou la norme Neu5Gc et aux concentrations mesurées de protéine dans les fractions cytosoliques (voir section 5.1).

9. mass Spectrometry analyse de l’acide sialique Monosaccharides

NOTE : Pics de rétention HPLC d’intérêt peuvent être davantage analysés par spectrométrie de masse par chromatographie liquide (CL)-ionisation par électrospray (ESI-MS), afin de vérifier l’espèce de l’acide sialique contre nature.

  1. Pour l’analyse de spectrométrie de masse, injecter 20 µL de l’échantillon prélevé dans un système de détecteur sélectif LC/masse (MSD) avec 79,9 % de méthanol, alcool isopropylique à 20 % et 0,1 % d’acide formique comme éluant, débit 0,5 mL/min, 4 kV de tension capillaire et 350 ° C température capillaire 22 , 23.
  2. Dans le logiciel d’évaluation du système LC/MSD respectif, sélectionnez le pic d’intérêt dans le chromatogramme d’ion totale. Découvre le spectre de masse du pic résolu. Afficher le rapport masse/charge positive entre 300 et 700.
    NOTE : DMB étiquetage des acides sialiques conduit à une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 g/mol. Les espèces de l’acide sialique marquée DMB ont les masses moléculaires suivantes : DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol communs adduits sont l’acétonitrile, de sodium ou de l’alcool isopropylique.

10. immunobuvardage, d’acide polysialique dans les cellules de neuroblastome Kelly

  1. Préparation des lysats cellulaires
    1. Ajouter tampon de lyse de Western blot 1 mL pour les pellets de la cellule à l’étape 3.3 et vortex. Incuber pendant 30 minutes sur la glace. Vortex toutes les 5 min. Centrifuger les échantillons pendant 1,5 h 20 000 x g et 4 ° C. Récupérer le surnageant contenant les protéines des cellules lysées.
    2. Déterminer la concentration de protéine les fractions protéiques, par exemple, le Bradford ou le dosage de la BCA. Diluer les échantillons à une concentration de protéines de 1,5 µg/µL de tampon de lyse.
    3. Préparer les échantillons pour la SDS-PAGE, en ajoutant 10 µL de tampon de Laemmli sample à la fraction de protéine 90 µL (1,5 µg/µL) et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Utiliser les gels SDS-acrylamide 8 % avec 20-30 µL poches et 0,75 ou 1 mm épaisseur. Exécutez le gel à 25 mA pendant 2 h à température ambiante.
    2. Retirez soigneusement le couvercle en verre du gel. Couper et jeter la partie supérieure du gel contenant les poches de chargement. Placer le gel sur une membrane de nitrocellulose (0,2 µm), gonflée dans le tampon de Western blot. Les protéines de transfert sur nitrocellulose conformément à la recommandation du système (p. ex., 250 mA pendant 1 h à 4 ° C).
    3. Enlever la membrane de nitrocellulose du système buvard. La tache avec Ponceau tache rouge pour visualiser les protéines. Transférer la membrane de nitrocellulose dans une chambre en plastique et ajouter 10 mL de solution de blocage. Incuber pendant 1 heure à ta ou toute la nuit à 4 ° C.
    4. Décanter la solution de saturation et ajoutez l’anticorps monoclonal anti-polySia 735 (1 µg/mL) dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à RT ou toute la nuit à 4 ° C. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.
    5. Ajouter anti-souris IgG secondaires anticorps polyclonal (1 µg/mL) couplé à la peroxydase de raifort (HRP) ou une étiquette fluorescente dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.
    6. Le transfert de la membrane sur une plaque d’un imageur approprié. Détecter le signal selon les instructions du fabricant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les chromatogrammes HPLC de le fluorescent étiquetés Neu5Ac et les normes de Neu5Gc sont représentés dans la Figure 2. À l’aide de la méthode décrite ci-après, DMB-étiqueté Neu5Gc élue généralement entre temps d’élution 7-9 min et DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Plusieurs petits pics sur le chromatogramme apparaissent généralement entre 2 à 6 min. Ces pics représentent DMB n’a pas réagi et intermédiaires de réaction25.

La figure 3 montre les chromatogrammes représentatifs des lysats cellulaires. Par rapport à des chromatogrammes des normes DMB-étiquetés (Figure 2), ces chromatogrammes plusieurs pics indéfinis sont visibles. C’est probablement à cause de l’impureté interne des lysats cellulaires et sur le fait que le DMB non seulement réagit avec l’acide sialique espèces, mais aussi avec d’autres acides α-cétoniques présents dans les lysats cellulaires, y compris le pyruvate, le succinate et α-cétoglutarate26. La présence de petites quantités d’acides sialiques portant O-modifications d’acétyle qui n’ont pas été clivés par hydrolyse acétique pourraient également discuter comme raison de ces pics indéfini23. Chromatogrammes de cellules lysées de non traitées sont comparées avec les chromatogrammes de cellules qui ont déjà été traitées avec ManNAc ou ses analogues. Tel qu’illustré ici, le traitement avec ManNAc souvent conduit à un appauvrissement de la couche presque entier de Neu5Gc sur la surface de la cellule. Chromatogrammes de cellules lysées traitées avec Neu5Prop ou Neu5But, les pics sont visibles qui n’apparaissent pas dans les chromatogrammes des cellules non traitées. Ces pics (pour ManNProp traitées cellules vers 19 min, heure d’élution et pour ManNBut les cellules à 42 min) indiquent l’apparition des correspondantes acides sialiques non-naturelles, Neu5Prop et Neu5Gc. Tel que décrit à l’article 8.3 du protocole, les chromatogrammes HPLC peuvent être analysées afin de quantifier les quantités d’espèces différentes d’acide sialique dans les lysats cellulaires.

Le fait que les pics de rétention HPLC distincts correspondent à certaines espèces de l’acide sialique a été vérifié par spectrométrie de masse. Représentant-ien données recueillis pics HPLC d’intérêt sont représentées dans la Figure 4: le spectre de la crête de rétention DMB-Neu5Ac recueilli dans le panneau gauche supérieur, DMB-Neu5Gc dans le panneau supérieur droit et les deux espèces de l’acide sialique non-naturelles, DMB-Neu5Prop et DMB-Neu5But dans les panneaux inférieurs gauche et droit. La réaction avec DMB conduit à une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 Da, par rapport à l’espèce acide sialique qui n’est pas étiquetés avec cette teinture. Dans les spectres de masse, lors de l’affichage du rapport masse/charge positive des échantillons injectés entre 300 et 700, plusieurs pics sont visibles. Cela est dû à la formation de la sonde marquée par DMB respectée d’adduits. Sans compter que l’ion protoné [M + H]+, le sodium adduits [M + Na]+ [M + 2Na- h]+ apparaissent. Comme l’acétonitrile (ACN) est présent lors de l’analyse de LC, il peut être trouvé comme un adduit dans les spectres de masse (montré à la Figure 4, DMB-Neu5Gc : panneau droit supérieur). En raison de la fragmentation causée par les activations de décompensation collisionnelle générées dans la région de transport d’electronspray entre le capillaire et le premier skimmer, déshydraté acide sialique [M + H]+-H2O les espèces peuvent également être observés (indiqué pour DMB-Neu5Ac, Figure 4: panneau gauche supérieur)23,27. Dans la configuration de la LC, DMB-Neu5Gc élue peu après les espèces n’ayant pas réagis ou partiellement réagies DMB. Par conséquent, la sonde de DMB-Neu5Gc recueillie peut-être contenir des impuretés causées par ces intermédiaires de réaction. Cela sert comme une explication de l’apparition de pics indéfinis dans le spectre de masse de DMB-Neu5Gc (Figure 4: panneau droit supérieur).

Traitement des cellules de neuroblastome de Kelly avec ManNProp ou ManNBut conduit à une expression réduite de l’acide polysialique sur NCAM, comme illustré par l’analyse par Western blot de la membrane cellulaire de cellules lysées (Figure 5). Acide polysialique apparaît normalement car un frottis à son hétérogénéité en taille et en charge (≈ 200 kDa). Traitement par analogues de ManNAc conduit à la réduction de l’acide polysialique sur la surface de cellules : plus les aliphatiques N-acyl côté chaîne, plus la réduction28.

Figure 1
Figure 1 : Le principe général de MGE avec N-acyl modifiés mannosamines. Après le traitement avec la N-acyl modifié mannosamines, ces analogues de ManNAc sont métabolisée de façon unidirectionnelle (métabolisme intracellulaire) acides sialiques non-naturelles correspondants. Ceux-ci sont transportés vers l’appareil de Golgi, transférés à l’accepteur oligosaccharide respectifs par sialyltransférases et exprimées à la surface de la cellule comme a (ici, une glycoprotéine). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : chromatogrammes représentatifs des normes DMB marqué l’acide sialique. DMB-étiqueté Neu5Ac (panneau du haut) et Neu5Gc (panneau inférieur) ont été analysés par HPLC. Retention fois (lignes pointillées) et des pics des deux acides sialiques ont été déterminées après injection de 10 ng de l’espèce de DMB-étiqueté respecté dans le système de CLHP. Des chromatogrammes représentatifs indiqués dans les présentes, DMB-Neu5Gc éluée après environ 8 min temps de rétention et DMB-Neu5Ac à 11 min, respectivement. Plusieurs petits pics sur le chromatogramme apparaissent généralement entre 2 à 6 min, représentant des intermédiaires DMB et réaction n’a pas réagis. Une petite fraction de DMB-étiqueté Neu5Ac apparaît comme une souillure mineure dans la norme DMB-Neu5Gc (panneau inférieur). Ce chiffre a été modifié de référence22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : caractérisation des acides sialiques membranaires par DMB-HPLC. Cellules sont cultivées en absence (non traitée, le haute Comité) ou en présence avec 5 mM ManNAc (second panneau du haut), ManNProp (troisième table ronde de haut), ou ManNBut (panneau inférieur), respectivement pendant 7 jours. Le milieu a été changé chaque 24 h. cellules ont été récoltées et fractions membranaires ont été préparées, étiquetées avec DMB et analysées par HPLC. Par comparaison avec les chromatogrammes des normes DMB marqué l’acide sialique (Figure 2), les pics aux temps de rétention entre 8-9 min ont été identifiés comme DMB-Neu5Gc et les pics entre 10 et 11 min comme DMB-Neu5Ac. Par rapport aux pics obtenus à partir d’injection de normes DMB marqué l’acide sialique, chromatogrammes de lysats cellulaires montrent des pointes supplémentaires, non définis. C’est à cause de l’impureté interne des sondes, ainsi que sur le fait que DMB peut réagir non seulement avec de l’acide sialique présent dans les lysats cellulaires, mais aussi avec d’autres acides α-cétoniques présents dans les lysats cellulaires, y compris le pyruvate, le succinate et α-cétoglutarate. Les pics qui apparaissent uniquement dans les chromatogrammes des échantillons de cellules cultivées en présence de N-acyl modifiée mannosamine analogues indiquent les acides correspondants marqués DMB non-naturelles sialique. Ce chiffre a été modifié de référence22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : masse des spectres de DMB marqué l’acide sialique espèces que l'on trouve dans les lysats cellulaires. Pics de rétention HPLC d’intérêt (voir Figure 3) ont été recueillies et analysées par la suite par ESI-MS. 20 µL des rétentions recueillies pics ont été injectées dans le système LC-MSD. Réaction avec DMB conduit à une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 Da par rapport aux espèces n’ayant pas réagi acide sialique correspondantes. Les spectrogrammes de rapport masse/charge positive provenant d’espèces différentes d’acide sialique sont représentés (DMB-Neu5Ac : panneau gauche supérieur, DMB-Neu5Gc : panneau droit supérieur, DMB-Neu5Prop : panneau gauche inférieur, DMB-Neu5But : panneau droit inférieur). Due à la formation d’adduits plusieurs pics sont visibles. Sans compter que l’ion protoné [M + H]+, sodium adduits [M + Na]+ [M + 2Na- h]+ apparaissent. L’acétonitrile, qui est présent lors de l’analyse de LC, se retrouve comme un adduit (panneau supérieur droit). Déshydratés DMB-Neu5Ac, qui est généré par la fragmentation de l’instrument [M + H]+-H2O peut être observée (panneau supérieur gauche). La sonde de DMB-Neu5Gc recueillie peut-être contenir des impuretés causées par DMB n’ayant pas réagi, mais aussi réaction intermédiaires vus comme des pics indéfinis supplémentaires (panneau supérieur droit). ACN, l’acétonitrile ; H, l’hydrogène ; Na, sodium. Ce chiffre a été modifié de référence22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : analyse de la polysialylation de la NCAM. Cellules de neuroblastome Kelly ont été cultivés en absence ou présence de 5 mM ManNAc, ManNProp ou ManNBut pendant 7 jours. Les cellules ont été récoltées et les protéines ont été séparés sur gel SDS-acrylamide de 8 % et analysées par Western blot à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-polySia 735. Notez que polySia apparaît comme un frottis en raison de son hétérogénéité dans nombre de Sia, résultant en différentes tailles et frais de polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Si les synthèse chimique dérivés de ManNAc, ManNProp et ManNBut sont analysés par spectrométrie de masse, seulement le pic de masse correct pour les deux spécimens doit être identifié. Par conséquent, les produits peuvent supposer avoir une pureté supérieure à 99 %. Petites quantités de Neu5Gc, qui se trouve normalement pas dans les cellules humaines29, sont détectées dans les fractions membranaires des cellules lysées. Cela se produit probablement par une voie de récupération qui recrute des Neu5Gc de sialoglycoconjugates de sérum de veau fœtal dans les médias30. Traitement avec le précurseur naturel de la biosynthèse de l’acide sialique, ManNAc, réduit considérablement l’expression de l’épitope Neu5Gc sur la surface de la cellule.

Demande de mis à jour le mannosamines est négligeable toxique pour toutes les cellules étudiées jusqu'à présent. Cellules acceptent des concentrations millimolaires accrue de sucre dans le milieu, ce qui est nécessaire, puisqu’il n’y a aucun transporteurs spécifiques pour une N- acylmannosamines. Il a été démontré que les voies de transduction de signal sont activés à la demande de N- acylmannosamines, qui pourrait affecter les cellules croissance ou différenciation31,32. Si cela est dû à un motif de sialylation modifiées ou tient compte des effets directs sur la sialylation modifiée ne connaît pas jusqu'à présent. La croissance des cellules en présence les analogues modifiés C2 ManNAc, ManNProp ou ManNBut se traduit par l’expression des espèces acide sialique non-naturelles transportant correspondantes N-acyle. L’efficacité métabolique des deux testé N-acyl modifié mannosamines varie. Traitement avec ManNProp conduit généralement à l’expression de le Neu5Prop correspondant à la surface des cellules et une expression réduite de Neu5Ac ainsi que Neu5Gc. Autres N-acyl modifiée mannosamine analogues, comme Ncyclopropylcarbamyl - mannosamine, ont tendance à avoir une encore plus l’efficacité métabolique22.

Des études antérieures ont révélé que les précurseurs sialique interfèrent avec polysialylation. Polysialic acides sont presque exclusivement exprimés la NCAM. Fait intéressant, les NCAM peut être polysialylated par deux polysialyltransferases distincts, exprimés dans l’appareil de Golgi (ST8SiaII et ST8SiaIV). Il s’est avéré que ManNProp, ManNBut et autres N-acyl-mis à jour le mannosamines gêner polysialylation, et que c’est principalement en raison de l’interaction avec les ST8SiaII14. Cette sialyltransférase est exprimée au cours du développement et est important pour le développement du cerveau. Il est intéressant également, plusieurs tumeurs d’origine neuronale ré-exprimer ST8SiaII augmenter leur malignité et plus loin en les rendant indétectables de la système immunitaire33. En revanche, l’application de ManNAc conduit à une augmentation de polySia, car elle conduit à une augmentation de CMP-Neu5Ac, qui est le substrat naturel de ces deux polysialyltransferases.

MGE est une méthode unique d’introduire de nouveaux acides sialiques sur les protéines d’intérêt (p. ex. érythropoïétine) et de moduler ainsi sa fonction. En outre, il peut être utilisé pour moduler la glycosylation de surface cellulaire, qui pourrait être d’intérêt pour beaucoup de maladies, telles que le cancer, puisque beaucoup de cellules cancéreuses essaient d’échapper au système immunitaire en exprimant des niveaux élevés d’acide sialique. La méthode présentée ici permet : tout d’abord, à effectuer à l’aide de cultures de cellules de glycosylation et Deuxièmement, pour analyser engineered glycanes de prouver la glycosylation réussie. La méthode est très robuste et jusqu'à présent, aucun pièges ne sont rapportés ; en revanche, la méthode a été étendue afin d’introduire des groupes actifs chimiques pour effectuer clic-chimie sur cellules13.

Nous présentons ici deux ManNAc analogues avec aliphatiques N-acyl côté chaîne modifications qui sont relativement simples à synthétiser, même par les laboratoires avec moins d’équipement et moins d’expérience en synthèse chimique. Les groupes qui sont plus familiers à la chimie organique pourraient synthétiser d’autres analogues de ManNAc avec des structures plus complexes et utilisez-les pour MGE, y compris les analogues de ce que l'on appelle « bioorthogonal », qui peuvent être utilisés, par exemple, pour visualiser sialylés glycoconjugués. Il y a des articles de synthèse donnant un aperçu de la N-acétyl-mannosamine dérivés qui ont été synthétisés à ce jour13,34. Nazidoacétyle - mannosamine (ManNAz), une substance qui est fréquemment utilisée, de visualiser des glycanes sialylés, est disponible dans le commerce. En raison de la perméabilité de la membrane faible de ManNAc analogues, il peut être avantageux d’utiliser des produits dérivés de ces sucres avec hydroxyl-groupes protégés, par exemple, peracétylés ManNAc analogues. Après être entré dans le cytoplasme, les groupes protecteurs sont clivés par les estérases cytoplasmiques, libérant ainsi les monosaccharides actif35,36,37. Toutefois, peracétylés ManNAc analogues exposent cytotoxicité plus élevée par rapport aux dérivés correspondants non protégés.

Dans ce manuscrit, nous avons choisi des cellules de neuroblastome immortalisées pour nos expériences avec MGE. En règle générale, MGE (surtout avec ManNProp et ManNBut) peut être appliquée dans une grande variété de lignées cellulaires, y compris les lignées cellulaires immortalisées (voir Wratil et al. 13 par exemple) et les cellules primaires38,,39. En outre, MGE a été utilisé avec succès pour modifier sialylation in vivo à40 c. elegans, zebrafish17,41, souris19,20,42et rat 43 , 44. la durée du traitement et la concentration des analogues dans les expériences de MGE ManNAc peuvent varier pour affecter l’efficacité métabolique de cette méthode. D’après notre expérience, traitement plus long et des concentrations plus élevées correspondent avec meilleur remplacement des espèces naturellement acide sialique glycoconjugués par mis à jour le Neu5R. Si des concentrations très élevées de ManNAc dérivés doivent être utilisés, la cytotoxicité du traitement doit être évaluée, par exemple, par l’analyse de MTT ou le test de réduction de résazurine.

Dans ce manuscrit, nous vous suggérons d’utiliser ultra-sonication pour l’homogénéisation de la cellule. Autres méthodes de lyse cellulaire ont été testés dans notre laboratoire, y compris les douncing sur la glace (environ 250 coups) et français de perturbation de la presse (10 000 lb/po2, 4 passages), avec des résultats comparables concernant la quantité d’acide sialique détectée dans les échantillons. L’avantage d’homogénéisation ultra-sons est qu’elle a besoin de peu de temps et ne nécessite pas l’ajout de DNAase aux échantillons avant la lyse.

Nous avons concentré notre analyse sur les fractions de membrane de lysats cellulaires, parce que nous voulions montrer des altérations dans la sialylation de membrane liée glycoconjugués. Dérivés de l’acide sialique et leurs concentrations peuvent être mesurées dans le cytosol des cellules, également après que la fraction membranaire a été séparée par centrifugation à grande vitesse, selon la même méthode, tel que décrit ci-dessus. Toutefois, les concentrations d’acide sialique dans le cytosol sont jusqu'à 100 x plus faible par rapport à l’acide sialique expression sur la membrane cellulaire7. Ainsi, les plus grandes quantités de cellules sont nécessaires pour générer des résultats fiables. Le pool de l’acide sialique-CMP cytosolique, activé peut être mesuré indirectement par les fractions cytosoliques de lysats cellulaires avec le borohydrure de sodium avant hydrolyse7,45le prétraitement. Pour hydrolyser l’acide sialique dans glycoconjugués et acide sialique avec modifications hydroxyle, les cellules sont incubées avec 1 M TFA. Autres solutions acides peuvent être utilisées pour l’hydrolyse, ainsi, 2 M par exemple, l’acide propionique, acide acétique 2 M ou 1 M HCl.

Un éventuel problème rencontré au cours de l’analyse par CLHP, c’est que les pics d’intérêt sont chevauchent avec des pics indéfinis. C’est particulièrement problématique lorsque la quantité d’acide sialique dans un échantillon doit être calculée par l’aire sous la courbe d’un pic de certains. Pour séparer un pic d’intérêt d’un pic indéfini, d’ajuster la concentration de l’acétonitrile dans le solvant HPLC (± 3 %). Nous suggérons d’utiliser des concentrations de solvants stables pour analyse par CLHP, donnant l’avantage de préparer le mélange de solvant avant de chromatographie en phase. Par conséquent, notre méthode exige qu’une seule pompe HPLC et est réalisable pour un large éventail de différents systèmes HPLC. Si plus d’une pompe est disponible dans le système de CLHP, un gradient isocratique avec des concentrations croissantes d’acétonitrile peut être appliqué, par exemple, de 4 à 9 % en 35 min45. En utilisant cette technique, le temps de rétention de certains pics HPLC sera considérablement modifié. Cette stratégie permet également d’atteindre la meilleure séparation de chevauchement des pics. Désorption-ionisation laser assistée par matrice spectrométrie de masse (MALDI-MS) a été établie pour vérifier l’expression de modification espèces acide sialique sur la surface cellulaire45et ce sert comme un équivalent à la méthode de ESI-MS présentée ici .

En raison de l’hydrophilicité de ManNAc analogues et l’absence de transporteurs spécifiques pour l’absorption de ces dérivés46, des concentrations élevées sont nécessaires dans les expériences MGE avec ces composés. Par conséquent, dans les expériences de l’échelle vers le haut et, en particulier dans des essais in vivo , grandes quantités des analogues ManNAc respectifs sont nécessaires montrant une limitation possible de cette technique. En revanche, suivant les lignées cellulaires utilisées, un certain nombre minimal de cellules traitées est nécessaire pour obtenir des résultats fiables dans l’analyse CLHP. D’après notre expérience, un minimum d’environ 100 000 cellules adhérentes ou 150 000 cellules en suspension (1-2 puits d’une plaque de 96 puits avec cellules confluentes) est suffisant. Cela peut devenir un goulot d’étranglement, si l’analyse doit être réduite, par exemple lors des approches de dépistage.

Avec les méthodes présentées dans ce manuscrit, l’acide sialique et ses dérivés peuvent être détectés dans les lysats cellulaires. Cependant, la structure et la composition des glycoconjugués dans les cellules traitées avec des dérivés de ManNAc ne peuvent être évaluées avec la technique décrite dans les présentes. Résolution de la structure des glycoconjugués, e.g.,N- et O- glycanes, nécessite généralement une plus grande expérience et une facilité de glycomique47. À notre connaissance, jusqu'à présent, aucune donnée n’est disponible sur la structure distincte des glycoconjugués des cellules qui ont été traitées avec ManNAc analogues.

Analyse par Western blot de l’acide polysialique est une méthode très rapide et facile. Toutefois, les données obtenues par cette méthode ne sont pas quantitatives, puisque la détection utilise les anticorps et chimiluminescence. Par conséquent, l’utilisation de méthodes HPLC est un avantage par rapport à éponger occidental. Néanmoins, nous vous suggérons d’utiliser la méthode immunoblotting, car il est facile à appliquer et connus pour fonctionner de manière très fiable.

L’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modifiée aussi par des méthodes autres que MGE. Comme indiqué ci-dessus, les cellules peuvent être traitées avec sialidase, une enzyme qui clive les résidus d’acide sialique des glycoconjugués de manière relativement imprécise. Traitement de la sialidase induit par conséquent hyposialylation dans les cellules traitées. Malheureusement, traitement sialidase est une technique assez limitée, car il est cytotoxique, pas possible pour le traitement à long temps et ne s’applique pas dans des expériences in vivo . Une autre technique pour induire des hyposialylation dans les cellules est en utilisant des inhibiteurs de la biosynthèse de l’acide sialique. Une variété d’inhibiteurs n’est disponible que soit cibler l’enzyme clé de la biosynthèse de l’acide sialique, l’UDP -N- acétylglucosamine-2-épimérase /N- acétylmannosamine-kinase (GNE/MNK), ou le groupe des sialyltransférases6, 7,8,,48. Un de ces composés, un acide sialique de C3-fluorés analogique, a été montré pour réduire l’expression de l’acide sialique vie souris49. Les animaux traités avec cette substance, cependant, ont montré une insuffisance hépatique, une dysfonction rénale irréversible et retard staturo-pondéral49. Ces résultats confirment le rôle crucial des Neu5Ac en fonction du foie et des reins et indiquent plus loin les limites des inhibiteurs de la sialylation pour des expériences in vivo . Une troisième méthode pour générer des cellules avec cellule altérée sialylation surface est en interférant avec l’expression des enzymes qui sont cruciaux pour la biosynthèse de l’acide sialique. Une précipitation de la GNE/MNK dans les cellules immortalisées, par exemple, a été montrée pour rendre ces cellules hyposialylated 9. La possibilité de relativement facilement knock-in et - gènes dans cellulaires et in vivo utilisant le roman et bien reconnu CRISPR-Cas9 technique pourraient conduire à nouvelles découvertes au sujet de la biosynthèse de l’acide sialique et cellules de surface sialylation.

L’avantage de MGE comparativement aux techniques décrites ici, est que c’est facile à utiliser et adaptable à une myriade d’expériences différentes, de in vitro des essais de tests de base et des expériences in vivo de cellules. Une autre méthode de mesure de l’expression et les concentrations de l’acide sialique différentes espèces dans des échantillons de cellules est par chromatographie échangeuse d’anions haute performance (HPAEC) avec détection électrochimique pulsée50. En utilisant que cette méthode, l’expression de l’acide sialique est mesurée directement et non après marquage avec un colorant fluorescent. L’avantage de cette méthode est qu’il peut être utilisé aussi pour analyser les monosaccharides autres que l’acide sialique et ses dérivés dans les échantillons cellulaires et protéines. Malheureusement, la sensibilité du HPAEC est plus faible comparativement à détection fluorimétrique d’acide sialique-DMB. Ainsi, HPAEC est limitée à des expériences avec la disponibilité de grand échantillon montants51.

Les méthodes décrites dans les présentes peuvent servir à révéler des caractéristiques inconnues des glycoconjugués. Une multitude d’exemples pour l’utilisation de MGE pour étudier les interactions dépendant de l’acide sialique déjà il existe13, montrant la faisabilité de cette technique dans le contexte d’un large éventail de configurations expérimentales.

De nos jours, MGE avec N- acetylmannosamines est principalement utilisé par les chercheurs dans le domaine de la glycobiologie. Nous espérons que cette technique sera reconnue par un large public comme un outil polyvalent pour modifier des glycoconjugués. D’autres domaines, y compris l’oncologie, neurologie, immunologie et virologie seront bénéfique pour adapter cette technique à leurs propres fins. Ces recherches REGLABLE pourrait permettre la découverte des domaines encore inexplorés et donc donner une meilleure compréhension de la santé et la maladie. Au début des études, par exemple, cette technique a été utilisée pour produire des glycoprotéines avec mis à jour le glycosylation, qui plus tard servent pour in vivo de la vaccination. Dans certains cas, le traitement avec de tels vaccins glycoengineered conduire à la production d’anticorps qui exposés avancé d’avidité et de toxicité pour les cibles respectifs52,53. D’autres avec succès utilisé MGE pour élaborer un modèle pour la thérapie ciblée de tumeur dans souris54. Une autre étude a montré que la systémique en vivo injection de ManNProp promu de régénération nerveuse55. Dans le cas de polySia, il a été démontré que diminue l’expression de cet épitope dans les cellules de neuroblastome par les méthodes présentées dans ce manuscrit, augmente la sensibilité de ces cellules tumorales à rayonnement ou un traitement avec des médicaments anticancéreux56.

Les montants de l’acide sialique mesurées dans les échantillons peuvent différer selon la méthode utilisée pour détacher les cellules traitées. Dans ce manuscrit, l’incubation avec la trypsine a été utilisée pour détacher des cellules. Si d’autres techniques doivent être utilisées, telles que gratter les cellules ou le traitement de longue date avec PBS + EDTA, les quantités d’acide sialique mesurées dans les échantillons peuvent différer. Même adapter le temps d’incubation avec la trypsine peut avoir un impact sur les concentrations de l’acide sialique, mesurées par la suite. D’après notre expérience, l’impact de la méthode de détachement cellulaire sur les montants de l’acide sialique mesurée est inférieure à 15 %, mais si les résultats doivent être normalisées et comparées, cela pourrait devenir un important goulot d’étranglement. En outre, la méthode pour la lyse des cellules peut affecter le résultat de l’analyse CLHP. Ainsi, il est recommandé au lecteur de normaliser le détachement cellulaire et lyse dans leurs expériences.

Pour obtenir la séparation de la fraction de membrane dans les lysats cellulaires, nous avons utilisé la centrifugation pendant 2 h à 20 000 x g et 4 ° C (point 5.1). Autres protocoles de centrifugation peuvent affecter la séparation et, par conséquent, les montants de l’acide sialique détectées dans les échantillons. Un composé essentiel au sein de ce protocole est DMB, car il est très sensible à la lumière et se dégrade au fil du temps. Ici, nous avons recommandé aux petites aliquotes de la DMB-solution et le magasin comme les stocks à - 20 ° C, abri de la lumière (section 1.6.1). De cette façon la DMB-solution peut être conservée pendant plusieurs semaines. Si les résultats de l’analyse HPLC-DMB montrent diminuant les signaux pour les espèces de l’acide sialique ou augmentant les signaux au cours des 6 premières minutes de la mesure de l’HPLC, représentant DMB et ses produits de réaction, nouveau DMB-solution doit être préparée. Ne pas recongeler et réutilisation DMB-solution après décongélation il. Après DMB étiquetage, tous les échantillons devraient être analysés immédiatement. Si un plus grand nombre d’échantillons (> 10) doivent être analysés, ces échantillons devraient être divisés en plus petits insignes et progressivement marqués à DMB. Ainsi que les sondes marquées à la DMB doivent être protégés de la lumière à tous les deux la réaction étiquetage fois. Après élution, l’espèce de l’acide sialique marquée DMB devrait être analysés immédiatement par ESI-Mme Direct couplage de l’HPLC avec le système ESI-MS (dans une configuration de LC-ESI-MS) n’est pas nécessaire, mais il peut être avantageux d’obtenir une meilleure qualité de la spectrométrie de masse analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions L. D. Nguyen, pour la relecture du manuscrit et des échanges fructueux. En outre, nous remercions Dernedde J. et H. G. Nguyen pour nous aider à préparer le tournage vidéo. La plupart des scènes de la vidéo ont été abattus dans les laboratoires de R. Tauber. Nous remercions également l’Institut Max Planck pour les colloïdes et interfaces et de nous donner libre accès à leurs installations de spectrométrie de masse. RH a été appuyée par la DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics