Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Biochemistry

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Summary

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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Abstract

El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados ​​en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.

Introduction

La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas dentro de las células 1 , 2 .

Además, las proteínas dictan en última instancia la función de la célula y por lo tanto dictan su fenotipo, que puede experimentar cambios dinámicos en respuesta a los factores autocrinos, parácrinos y endocrinos; Mediadores sanguíneos; temperatura; Tratamiento farmacológico; Y la enfermedad se desarrollanCión. Por lo tanto, un análisis de la expresión centrado en el nivel de proteína es útil para caracterizar el proteoma y para desentrañar los cambios críticos que se le ocurren como parte de la patogénesis de la enfermedad [ 3] .

Por lo tanto, las oportunidades que presenta la proteómica para aclarar las condiciones de salud y enfermedad son formidables, a pesar de los desafíos tecnológicos existentes. Las áreas de investigación particularmente prometedoras a las que la proteómica puede contribuir incluyen: la identificación de la expresión alterada de la proteína a cualquier nivel ( es decir, células enteras o tejidos, compartimentos subcelulares y fluidos biológicos); La identificación, verificación y validación de nuevos biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad; Y, con suerte, la identificación de nuevas proteínas objetivo que se pueden utilizar con fines terapéuticos, así como para la evaluación de la eficacia de los medicamentos y la toxicidad [ 4] .

Capturar la complejidad deEl proteoma representa un desafío tecnológico. Las herramientas proteómicas actuales ofrecen la oportunidad de realizar análisis a gran escala y de alto rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de niveles alterados de proteínas. Además, la introducción de técnicas de fraccionamiento y enriquecimiento, destinadas a evitar la interferencia causada por las proteínas más abundantes, también ha mejorado la identificación de proteínas mediante la inclusión de las proteínas menos abundantes. Finalmente, la proteómica se ha complementado con el análisis de las modificaciones postraduccionales, que progresivamente emergen como importantes moduladores de la función de las proteínas.

Sin embargo, la preparación de la muestra y la recuperación de proteínas en los especímenes biológicos en análisis siguen siendo los pasos limitantes en el flujo de trabajo proteómico y aumentar el potencial de posibles trampas [ 5] . De hecho, en la mayoría de las técnicas de biología molecular que deben ser optimizadas, los primeros pasos son homogenizat de tejidoIon y lisis celular, especialmente durante el análisis de proteínas de baja abundancia para las que no existen métodos de amplificación. Además, la naturaleza química de las proteínas puede influir en su propia recuperación. Por ejemplo, el análisis de proteínas altamente hidrófobas es muy difícil, ya que fácilmente precipitan durante el enfoque isoeléctrico, mientras que las proteínas trans-membrana son casi insolubles (revisado en la Referencia 5). Además, la variabilidad de la composición del tejido crea una barrera significativa para desarrollar un método de extracción universal. Finalmente, debido a que casi todos los especímenes clínicos son de cantidad limitada, es esencial para permitir la preparación de proteínas con máxima recuperación y reproducibilidad de cantidades mínimas de muestra [ 6] .

Este trabajo describe un protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral cardiaca humana normal, que representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico. La válvula mitral normal es un compLex estructura situada entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo del corazón ( Figura 1 ]. Desempeña un papel importante en el control del flujo sanguíneo desde la aurícula hasta el ventrículo, evitando el reflujo y asegurando el nivel adecuado de suministro de oxígeno a todo el cuerpo, manteniendo así un adecuado gasto cardíaco. Sin embargo, a menudo se considera que es un tejido "inactivo", con una baja celularidad y pocos componentes, principalmente en la matriz extracelular. Esto se debe a que, en condiciones normales, las células valvulares intersticiales residentes (VICs) presentan un fenotipo quiescente con una baja tasa de biosíntesis de proteínas [ 7] .

Sin embargo, se ha demostrado que, en un estado patológico, el número de VICs en la esponja aumenta y su síntesis de proteínas se activa, junto con otros cambios funcionales y fenotípicos [ 8] . Por lo tanto, no es sorprendente que los datos mínimosLa literatura se centra en el análisis de las válvulas mitológicas patológicas 9,10, en las que el aumento del número de VIC activados podría explicar el número relativamente elevado de proteínas identificadas.

En conclusión, el presente protocolo puede servir para desarrollar la comprensión de los mecanismos patógenos responsables de las enfermedades de la válvula mitral a través del estudio de los componentes de la válvula valvular mitral. De hecho, una mayor comprensión de los procesos patológicos subyacentes podría ayudar a mejorar el manejo clínico de las enfermedades valvulares, cuyas indicaciones actuales para la intervención se basan principalmente en consideraciones hemodinámicas.

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Protocol

En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de los donantes. El tejido para el trasplante y la investigación se recopila sólo después del consentimiento de los padres; En la hoja de consentimiento, autorizan (o no) el uso del tejido cardíaco para investigación sólo si no es adecuado para el uso clínico humano ( es decir, problemas microbiológicos, funcionales y serológicos), siguiendo las directrices del comité de ética deCentro Cardiológico de Monzino.

1. Preparación de la válvula mitral

  1. Cosechar la válvula mitral humana tan pronto como sea posible después de la explicación del órgano (tiempo de isquemia fría de 4-12 h).
  2. En una habitación limpia, retire el corazón de la bolsa de transporte que contenga una solución fría (4 ° C) ( es decir, una solución salina o medio balanceado Eurocollins o Wisconsin). Colóquelo en un cubo y colóquelo en un gabinete de bioseguridad (flujo de aire vertical de riesgo biológico, clase A, clasificación de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP)) para proceder con la preparación de la válvula.
  3. Coloque el corazón sobre un paño desechable estéril en el gabinete. Usando un bisturí desechable estéril, corte el corazón completamente, perpendicularmente a su eje principal, a nivel de los ventrículos izquierdo y derecho, a unos 4 cm del ápice.
  4. Mueva la aorta ascendente y la arteria pulmonar para mostrar el techo de la aurícula izquierda.
  5. Con fórceps y picos esterilizados en autoclave, corte alrededor de la aurícula izquierdaEl túnel de la aurícula izquierda, haciendo visible la válvula mitral y permitiendo identificar el gran folíolo mitral (anterior) y el pequeño folíolo mitral (posterior).
    NOTA: Las comisuras antero-lateral y medial posterior definen el borde del folíolo anterior y el área posterior.
  6. Usando tijeras esterilizables en autoclave y fórceps no traumáticos, disecar la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo alrededor de la circunferencia de toda la válvula mitral .
  7. Identificar la continuidad de la válvula mitro-aórtica.
    NOTA: El ventrículo izquierdo contiene toda la válvula mitral y los acordes.
  8. Separar el folíolo valvar mitral anterior del folíolo mitral posterior, cortando el folíolo posterior a lo largo de la inserción con el ventrículo (comisura).
  9. Lave el folíolo posterior en la solución salina. Cortar el folleto en trozos pequeños (<1 cm 2 ) y envolverlos individualmente en papel de aluminio. Snap-freeze con nitrógeno líquido.
    Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido.
    1. Desinfectar la mesa del gabinete con una solución de alcohol isopropílico al 70% y una solución de peróxido de hidrógeno al 6% al final del procedimiento.

2. Extracción de proteínas

  1. Utilice un fórceps para recoger la muestra almacenada en nitrógeno líquido e inmediatamente colóquela en hielo seco mientras esté envuelta en el papel de aluminio. No deje la muestra descongelar durante las transferencias.
  2. Antes de la molienda, enfríe el mortero de porcelana / zirconio y los pilones de un sistema de molienda ( por ejemplo, CryoGrinder), junto con la muestra, poniéndolos en un matraz de Dewar que contiene nitrógeno líquido (~ 500 ml).
    Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido.
  3. Ponga el mortero y las majas en una caja de poliestireno que contiene hielo seco. Retire la muestra de la lámina de aluminio y póngala en el mortero.
  4. MolerÉl muestra con el mortero grande contra el mortero 15-20 veces, con el destornillador para girar el mortero. Mezclar la muestra con la punta de una espátula pre-enfriada durante el proceso de molienda.
    1. Repita con el pequeño mortero.
  5. Transfiera la muestra molida a un tubo previamente pesado ( p. Ej., Tubo de centrífuga de 15 ml), invirtiendo el tubo, colocándolo sobre el mortero e invirtiéndolo para mover la muestra al tubo. Utilice una espátula previamente enfriada para recuperar todo el material del mortero.
    1. Mantenga el tubo con la muestra en hielo seco para evitar la descongelación de la muestra durante la transferencia.
  6. Calcular el peso neto de la muestra.
  7. Limpiar el mortero y los pilones después de cada muestra y descontaminarlos en autoclave o calentarlos a 200 ° C durante 2 h.
  8. Transferir la muestra en polvo del tubo de centrífuga al tubo de vidrio de un homogeneizador por inversión.
  9. Añadir filtro de urea filtrada(8 M de urea, 2 M de tiourea, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris y 55 mM de ditiotreitol) al tubo de vidrio, 200 mu l de tampón de urea por cada 10 mg de tejido en polvo.
    NOTA: La muestra residual en polvo que queda en el tubo de centrífuga puede recuperarse utilizando parte del volumen calculado de tampón de urea.
  10. Homogeneizar la muestra utilizando un agitador equipado con un mortero de vidrio borosilicato y un pilón de politetrafluoroetileno (PTFE). Presione lentamente el mazo sobre la muestra con un movimiento de torsión (1.500 rpm) 10 veces.
  11. Recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 ml. Extraer de nuevo la muestra restante con tampón de urea fresco, añadiendo la mitad del volumen utilizado durante la primera extracción.
  12. Repita el paso 2.10.
  13. Recuperar el sobrenadante y combinarlo con el sobrenadante de la etapa 2.11. Colocar el sobrenadante combinado en un rotador de tubo durante 30 min.
  14. Centrifugar el tubo durante 30 min a 13.000 xg y 4 ° C.
  15. Recuperar el sobrenadanteD medir la concentración de proteína usando el ensayo de proteína Bradford, según las instrucciones del fabricante. Guarde la muestra a -80 ° C hasta su uso.

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Representative Results

La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados ​​en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) 11 y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) 12 ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli 13 Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa 14 .

Para los métodos basados ​​en espectrometría de masas libres de gel ( es decir, cromatografía líquida acoplada a análisis de espectrometría de masas independiente de datos (LC / MS E ) y LC / MS E bidimensional (2D-LC / MS E ) 15 , las muestras extraídas En el tampón de urea descrito deben tratarse adicionalmente para eliminar la urea y la tiourea, lo que podría interferir con la subsiguiente digestión de las proteínas y la separación por cromatografía líquida. EsteS puede llevarse a cabo usando los kits comerciales de precipitación de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante para precipitar las proteínas. La muestra puede ser entonces disuelta en NH4HCO3 25 mM conteniendo detergentes escindibles al 0,1% para la digestión de proteínas 16 . La precipitación de las proteínas puede eliminar los componentes del tampón, afectando mínimamente el contenido de proteínas (recuperación de proteínas:> 85%), haciendo así que la muestra sea adecuada para cada tipo de análisis.

La aplicación de este protocolo para la extracción de proteínas de las válvulas mitrales humanas permitió la identificación de un total de 422 proteínas, la combinación de cuatro enfoques diferentes proteómica anteriormente descritos en detalle [ 11 , 15] . Específicamente, 169 proteínas fueron identificadas por 2-DE, 330 proteínas por fase líquida IEF, 96 proteínas por LC / MS E , y 148 proteínasPor 2D-LC / MS E (Tabla 1).

Para clasificar las 422 proteínas identificadas en términos de localización subcelular, se utilizó un software para el análisis de ontología génica (GO) ( por ejemplo, Cytoscape). La red creada con el software y su correspondiente plug-in mostró que, además de las proteínas esperadas localizadas en la región extracelular (ver la parte superior derecha de la Figura 2 ), la mayoría de las proteínas identificadas por los enfoques proteómicos eran de la región intracelular ( Es decir, citoplasma, organelos, vesículas y citoesqueleto). También se identificaron proteínas de la superficie celular ( Figura 2 ).

Los resultados fueron confirmados en tres muestras independientes valvula mitral. La inmunotransferencia se utilizó para analizar un grupo de cuatro proteínas ( es decir, septin-11, cuatro y medio LIM dominios de la proteína 1 (FHL-1), derMatopontin y alfa-cristalina B (CryAB)) que nunca han sido identificados en la válvula mitral normal ( Figura 3 ).

Figura 1
Figura 1: Estructura de la válvula mitral. Vista superior del corazón humano que muestra la válvula mitral humana cerrada ( A ) o abierta ( B ). Vista frontal del ventrículo izquierdo de un corazón humano ( C ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Análisis de las proteínas de la válvula mitral identificadas en términos de distribución celular. Cytoscape y el plugin BiNGO se utilizaron para obtaiN la distribución de términos de ontología génica (GO) a partir de las categorías de componentes celulares. El tamaño del círculo es proporcional al número de componentes de proteínas asociadas con los términos de GO seleccionados, y se informa de la escala de color para el valor de p de sobrerepresentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Análisis de inmunotransferencia de septin-11, FHL-1, dermatopontina y CryAB en extracto completo de tres folíolos de válvula mitral normal humana. La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpo monoclonal de ratón contra anticuerpos policlonales CryAB y conejo contra los anticuerpos septin-11, FHL-1 y dermatopontina. Por favorHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<Td> x <Td> <Td> Precursor de la subunidad beta de tipo 4 de proteasoma <Td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <Td> <Tr <Td> x
Adhesión Descripción 2-DE 2D-LC LC-MS E Fase líquida IEF
A6NMZ7 Colágeno alfa VI x
O00151 PDZ y la proteína 1 del dominio LIM x
O00299 Cloruro intracelular canal proteína 1 x
O00764 Piridoxal quinasa x
O14558 Proteína de choque térmico beta 6 x
O43399 Proteína del tumor D54 x
O43488 Aflatoxina B1 aldehído reductasa miembro 2 x
O43707 Alfa actinina 4 x x
O43866 Antígeno CD5 como precursor x
O60493 Clasificación nexin 3 x
O60701 UDP glucosa 6 deshidrogenasa x
O75223 Proteína no caracterizada x
O75368 SH3 dominio de ácido glutámico rico en proteínas x
O75390 Citrato sintasa precursor mitocondrial x
O75489 NADH deshidrogenasa ubiquinona hierro sulfuro proteína 3 precursor mitocondrial x x
O75608 Acil proteína tioesterasa 1 x
O75828 Carbonil reductasa NADPH 3 x
O75874 Isocitrato deshidrogenasa NADP citoplasmático x
O75955 Flotillin x
O94760 NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 x
O94788 Retinal deshidrogenasa 2 x
O95865 NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 x x
P00325 Alcohol deshidrogenasa 1B x x
P00338 L lactato deshidrogenasa Una cadena x
P00352 Retinal deshidrogenasa 1 x
P00441 Superóxido dismutasa Cu Zn x x
P00450 Precursor de la ceruloplasmina x x
P00488 Factor de coagulación XIII Un precursor de cadena x
P00491 Nucleósido fosforilasa de purina x
P00492 Hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa x
P00558 Fosfoglicerato quinasa 1 x x
P00568 Adenilato quinasa isoenzima 1 x
P00734 Protrombina x x
P00738 Haptoglobina x x x x
P00739 Precursor de la proteína relacionada con la haptoglobina x
P00751 Factor de complemento B x x x
P00915 Anhidrasa carbónica 1 x
P00918 Anhidrasa carbónica 2 x
P01008 Precursor de la antitrombina III x x x
P01009 Alfa 1 antitripsina x x x x
P01011 Antiquimotripsina Alfa 1 x x x x
P01019 Precursor del angiotensinógeno x x
P01023 Macroglobulina alfa 2 x x
P01024 Complemento C3 x x x x
P01033 Precursor del inhibidor de metaloproteinasa 1 x
P01042 Precinente de Kininogen 1 x
P01593 Ig cadena kappa región VI AG x
P01598 Ig kappa cadena VI región UE x
P01600 Ig cadena kappa VI región Hau x x
P01611 Ig cadena kappa VI región Wes x
P01620 Ig cadena kappa V III región SIE x
P01625 Ig cadena kappa V IV región Len x
P01766 Ig cadena pesada V III región BRO x x
P01781 Ig cadena V III región GAL x
P01834 Ig cadena kappa región C x x x x
P01842 Ig lambda cadena C regiones x x x
P01857 Ig gamma 1 cadena C región x x x x
P01859 Ig gamma 2 cadena C región x x x x
P01860 Ig gamma 3 cadena C región x x x
P01861 Ig gamma 4 cadena C región x x x
P01871 Ig cadena mu región C x x x
P01876 Ig alfa 1 cadena C región x x x x
P01877 Ig alfa 2 cadena C región x
P02144 Mioglobina x x
P02452 Cadena alfa 1 del colágeno x x x x
P02511 Cadena B de cristalina alfa x
P02545 Lamin AC 70 kDa lamin x x x x
P02647 Apolipoproteína AI x x x x
P02649 Apolipoproteína E x x x x
P02671 Fibrinógeno cadena alfa x x x x
P02675 Fibrinógeno beta-cadena x x x x
P02679 Cadena gamma de fibrinógeno x x x x
P02689 Proteína P2 de mielina x
P02735 Amiloide sérica Un precursor de la proteína x
P02741 Precursor de la proteína C reactiva x
P02743 Componente P del amiloide sérico x x x x
P02746 Complemento Subunidad B del subcomponente C1q x x
P02747 Complemento C1q Subcomponente subunidad C precursor x
P02748 Complemento componente C9 x x x
P02749 Beta 2 glicoproteína 1 x x x x
P02750 Precursor de la glicoproteína alfa 2 rica en leucina x
P02751 Fibronectina x x
P02760 Precursor de la proteína AMBP x x x x
P02763 Alfa 1 glucoproteína ácida 1 x x x
P02765 Precursor de la glucoproteína Alfa 2 HS x
P02766 Precursor de la transtiretina x x x
P02768 Albúmina de suero x x x x
P02774 Precursor de la proteína de unión a la vitamina D x
P02787 Serotransferrina x x x x
P02788 Precursor de la Lactotransferrina x
P02790 Hemopexina x x x x
P02792 Cadena ligera de ferritina x
P04004 Vitronectina x x x x
P04075 Fructosa bisfosfato aldolasa A x
P04083 Anexina A1 x x x x
P04179 Superóxido dismutasa Mn precursor mitocondrial x
P04196 Precursor de la glicoproteína rica en histidina x
P04217 Precursor de la glucoproteína Alfa 1B x x
P04350 Tubulina beta 4 cadena x
P04406 Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa x x x x
P04792 Proteína de choque térmico beta 1 x x x x
P05091 Aldehído deshidrogenasa precursor mitocondrial x x
Precursor del inhibidor C1 de la proteasa plasmática x
P05156 Precursor del factor I del complemento x
P05413 Corazón de proteínas de unión a ácidos grasos x
P05452 Tetranectin precursor TN x x
P05787 Queratina tipo II citoesquelético 8 x
P06396 Gelsolin x x x x
P06576 Subunidad de ATP sintasa beta precursora mitocondrial x x
P06732 Tipo de creatina quinasa M x x
P06733 Alfa alfa x x x x
P06753 Tropomiosina cadena alfa 3 x x
P07108 Proteína de unión de Acyl CoA x
P07195 Cadena L lactato deshidrogenasa x x x
P07196 Polipéptido ligero de Neurofilamento x
P07197 Polipéptido medio de neurofilamento x x
P07237 Precursor de la disulfuro de isomerasa de la proteína x x
P07339 Precursor de la catepsina D x x
P07355 Anexina A2 x x x x
P07360 Componente de complemento C8 precursor de la cadena gamma x
P07437 Tubulina cadena beta x x x x
P07585 Decorin x x x x
P07737 Profilin 1 x
P07858 Precursor de la catepsina B x
P07900 Proteína de choque térmico HSP 90 alfa x x
P07951 Tropomiosina beta x
P07954 Fumarato hidratasa precursor mitocondrial x
P07996 Trombospondina 1 x x x
P08107 Proteína de 70 kDa de choque térmico 1A 1B x x x x
P08123 Cadena alfa 2 I de colágeno x x x x
P08133 Annexin A6 x x
P08238 Proteína de choque térmico HSP 90 beta x x
P08253 Precursor de colagenasa tipo IV de 72 kDa x
P08294 Superóxido dismutasa extracelular Cu Zn precUrsor x x x
P08590 Polipéptido ligero de miosina 3 x x
P08603 Factor de complemento H x x x x
P08670 Vimentina x x x x
P08729 Queratina tipo II citoesquelético 7 x
P08758 Anexina A5 x x x x
P09211 Glutatión S transferasa P x x x
P09382 Galectina 1 x x x
P09417 Dihidropteridina reductasa x
P09493 Tropomiosina 1 cadena alfa x x
P09525 Anexo A4 x x
P09651 La ribonucleoproteína A1 nuclear heterogénea x
P09871 Complemento C1s subcomponente precursor x
P09936 Ubiquitina carboxil terminal hidrolasa isoenzima L1 x
P09972 Fructosa bisfosfato aldolasa C x
P0C0L4 Complemento C4 A precursor x
P0CG05 Yo GLambda 2 cadenas C regiones x
P0CG38 POTE miembro de la familia del dominio ankyrin I x
P10515 El componente de la acetiltransferasa del residuo de dihidrolipoylisina del complejo piruvato deshidrogenasa x
P10768 S formilglutatión hidrolasa x
P10809 Precursor mitocondrial de proteína de choque térmico de 60 kDa x
P10909 Clúster en x x x x
P10915 El hialuronano y el proteoglicano unen el precursor de la proteína 1 x x
P11021 78 kDa gProteína regulada por lucosa x x x
P11047 Subunidad de la laminina gamma 1 precursor x
P11142 Proteína cognoscitiva de choque térmico de 71 kDa x x x x
P11177 Piruvato deshidrogenasa E1 componente subunidad beta mitocondrial precursor x
P11217 Forma del glucógeno fosforilasa muscular x
P11310 Precursor mitocondrial específico de la cadena acıl CoA deshidrogenasa x
P11413 Glucosa 6 fosfato 1 deshidrogenasa x
P11766 Cadena de chi de la deshidrogenasa de la clase 3 del alcohol x
P12036 Neurofilamento polipéptido pesado x
P12109 Colágeno alfa 1 VI cadena x x x x
P12110 Colágeno alfa 2 VI cadena x x x x
P12111 Colágeno alfa 3 VI cadena x x x
P12277 Tipo de creatina quinasa B x
P12429 Anexina A3 x x
P12814 Alfa actinina 1 x x
P12829 Polipéptido ligero de miosina 4 x
P12882 Miosina 1 x
P12883 Miosina 7 x x
P12955 Xaa Pro dipeptidasa x
P13489 Inhibidor de la ribonucleasa x
P13533 Miosina 6 x x
P13611 Precursor de proteína central de Versican x x
P13639 Factor de elongación 2 x
P13716 Delta aminolevulinic acid dehydratase x
P13796 Plastin 2 x
P13804 Subunidad de la flavoproteína de transferencia de electrones precursor mitocondrial alfa x
P13929 Beta enolasa x x
P14136 Astrócito de proteína ácida fibrilar glial x
P14314 Precursor de la subunidad beta de la glucosidasa 2 x
P14550 Alcohol deshidrogenasa NADP x
P14618 Isoenzimas de piruvato quinasa M1 M2 x x x
P14625 </ Td> Precursor de la Endoplasmina x x
P15121 Aldosa reductasa x
P15259 Phosphoglycerate mutase 2 x
P16152 Carbonil reductasa NADPH 1 x
P17066 Proteína de 70 kDa de choque térmico 6 x x x
P17174 Aspartato aminotransferasa citoplasmática x
P17540 Precursor mitocondrial sarcomérico de la creatina quinasa x
P17661 Desmin x x x x
P17980 26S subunidad reguladora de proteasa 6A x
P17987 T subunidad alfa compleja de la proteína 1 x
P18206 Vinculina x x
P18428 Precursor de la proteína de unión al lipopolisacárido x
P18669 Phosphoglycerate mutase 1 x
P19105 Cadena ligera reguladora de miosina 2 x x
P19623 Spermidina sintasa x
P19652 Alfa 1 glucoproteína ácida 2 precursor x x
P19823 Inhibidor de tripsina Inter, cadena pesada H2 x
P19827 Inhibidor de tripsina inter, cadena pesada H1 x x
P20073 Anexina A7 x
P20618 Precursor de la subunidad beta tipo 1 de la proteasa x
P20774 Mimecan x x x x
P21266 Glutatión S transferasa Mu 3 x
P21333 Filamina A x x
P21796 Proteína del canal selectivo del anión dependiente del voltaje1 x
P21810 Bigwincan x x x x
P21980 Proteína glutamina gamma glutamiltransferasa 2 x x
P22105 Tenascin X x x
P22314 La enzima activadora de la ubiquitina E1 x
P22352 Precursor de la glutatión peroxidasa 3 x x
P22626 Las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas A2 B1 x
P22695 Ubiquinol citocromo c reductasa complejo núcleo proteína 2 precursor mitocondrial x
P23141 Precursor de la carboxilesterasa 1 del hígado x
P23142 Fibulina 1 x x x x
P23284 Precursor de la peptidil prolyl cis trans isomerasa B x
P23381 Tryptophanyl tRNA sintetasa citoplasmática x
P23526 Adenosilhomocisteasa x x
P23528 Cofilin 1 x
P24752 Acetil CoA acetiltransferasa precursor mitocondrial x
P25311 Zinc alpha 2 glycoproteiPrecursor x
P25705 Subunidad de la ATP sintasa alfa mitocondrial x
P25788 Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 3 x x
P25789 Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 4 x
P26447 Proteína S100 A4 x
P27348 14 3 3 proteína teta x x
P27797 Precursor de la calreticulina x
P28066 Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 5 x
P28070 x x
P28072 Precursor de la subunidad beta tipo 6 de la proteasa x
P28074 Subunidad de proteasa subtipo beta 5 precursor x
P28331 NADH ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 75 kDa precursor mitocondrial x
P28838 Citosol aminopeptidasa x
P29218 Inositol monofosfatasa x
P29401 Transketolasa x
P29692 Delta de factor de elongación 1 x
P29966 Substrato de cinasa C rico en alanina miristoilada x
P30040 Proteína reticular endoplasmática ERp29 precursor x
P30041 Peroxirredoxina 6 x x
P30043 Flavin reductasa x
P30044 Precursor mitocondrial de peroxiredoxina 5 x
P30085 UMP CMP quinasa x
P30086 Proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1 x
P30101 ProteiN disulfuro isomerasa A3 precursor x x x
P30613 Isoenzimas de piruvato quinasa RL x
P30740 Inhibidor de elastasa de leucocitos x
P31025 Lipocalin 1 precursor x
P31937 3 hidroxiisobutirato deshidrogenasa precursor mitocondrial x
P31942 La ribonucleoproteína H3 heterogénea x
P31943 La ribonucleoproteína H nuclear heterogénea x
P31946 14 3 3 proteína beta alfa x x
P31948 La fosfoproteína 1 inducida por estrés x
P31949 Proteína S100 A11 x
P32119 Peroxiredoxina 2 x x
P34931 Calor choque 70 kDa proteína 1 como x x
P34932 Proteína de choque térmico 70 kDa 4 x
P35232 Prohibitina x
P35237 Serpin B6 x
P35443 Trombospondina 4 x
P35555 Fibrilina 1 x x
P35579 Miosina 9 x x x
P35580 Miosina 10 x x
P35609 Alfa actinina 2 x
P35625 Inhibidor de metaloproteinasa 3 x x
P35998 26S subunidad reguladora de la proteasa 7 x
P36871 Fosfoglucomutasa 1 x x
P36955 Factor derivado del epitelio pigmentario x x
P37802 x x
P37837 Transaldolasa x
P38117 Subunidad beta de la flavoproteína de transferencia de electrones x
P38646 Estrés 70 proteína precursora mitocondrial x x
P39687 Miembro de la familia A de la familia de la fosfoproteína nuclear rica en leucina A x
P40121 Proteína capsuladora de macrófagos x
P40925 Malato deshidrogenasa citoplasmática x
P40926 Precursor mitocondrial malato deshidrogenasa x
P41219 Periférico x
P42330 Aldo keto reductasa familia 1 miembro C3 x
P45880 Anión dependiente del voltaje canal selectivo proteína 2 x
P47755 F subunidad α 2 de la proteína capsuladora de la actina x x
P47756 Subunidad beta de la proteína de bloqueo de la actina beta x x
P47985 Ubiquinol citocromo c reductasa hierro subunidad de azufre precursor mitocondrial x
P48047 Precursor mitocondrial de la subunidad ATP sintasa O x
P48637 Glutatión sintetasa x
P48741 Proteína de 70 kDa de choque térmico 7 x x
P49189 4 trimetilaminobutiraldehído deshidrogenasa x
P49368 T complejo de la subunidad gamma de la proteína 1 x
P49747 Proteína de matriz oligomérica de cartílago x x x x
P49748 Precursor mitocondrial de acyl CoA deshidrogenasa de cadena muy larga x
P50395 Rab inhibidor de la disociación del PIB beta x X </ Td>
P50454 Precursor de Serpin H1 x
P50995 Anexoin A11 x
P51452 Proteína fosfatasa de especificidad dual 3 x
P51884 Lumican x x x x
P51888 Prolargin precursor x x x x
P52565 Rho GDP inhibidor de disociación 1 x
P52566 Rho GDP inhibidor de disociación 2 x
P54652 Proteína de 70 kDa relacionada con el choque térmico 2 x x x x
P55072 Retículo endoplasmático transicional ATPasa x
P55083 Precursor de la glicoproteína 4 asociada a microfibrilas x x
P57053 Histona H2B tipo F x
P60174 Trifosfato isomerasa x x x
P60660 Polipéptido ligero de miosina 6 x x
P60709 Actina citoplasmática 1 x x x x
P60981 Destrin x
P61086 Ecuación de conjugación de ubiquitina E2 25 kDa x
P61088 Enzima de conjugación de ubiquitina E2 x
P61224 Ras proteína relacionada con Rap 1b precursor x
P61978 La ribonucleoproteína K heterogénea x x
P61981 14 3 3 proteína gamma x x x
P62258 14 3 3 proteína epsilon 14 3 3E x
P62491 Proteína relacionada con Ras x
P62714 Serone treonina proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica beta isoforma x
P62736 Actina músculo liso aórtico x x x
P62805 Histona H4 x
P62826 La proteína nuclear de unión al GTP funcionó x
P62873 Guanina proteína de unión de nucleótidos GIGSGT subunidad beta 1 x
P62879 Guanina proteína de unión de nucleótidos GIGSGT subunidad beta 2 x
P62937 Peptidil prolyl cis trans isomerasa A x x
P62987 Ubiquitina 60S proteína ribosomal L40 x
P63104 14 3 3 proTein zeta delta x x x x
P63241 Factor de iniciación de la traducción eucariótica 5A 1 x
P63244 Subunidad beta 2 de proteína de unión a nucleótidos de guanina como 1 x
P63267 Actina gamma músculo liso entérico x x
P67936 Tropomiosina cadena alfa 4 x
P68032 Actina alfa del músculo cardiaco 1 x
P68104 Factor de elongación 1 alfa 1 x x x
P68133 Actin alfa músculo esquelético
P68363 Tubulina cadena alfa 1B x x x
P68371 Tubulina beta 2C cadena x x x
P68402 Factor activador de plaquetas acetilhidrolasa IB subunidad beta x
P68871 Subunidad beta de la hemoglobina x x x
P69905 Subunidad alfa de la hemoglobina x x
P78371 T complejo proteína 1 subunidad beta x
P78417 Glutatión transferasa omega 1 x x
P80748 Ig lambda cadena VIII región LOI x
P98095 Fibulina 2 x x
Q01082 Cerebro de la cadena beta de Spectrin 1 x
Q01449 Cadena ligera reguladora de miosina 2 isoforma auricular x
Q01518 Adenylyl cyclase associated protein 1 x
Q01995 Transgelin Proteína del músculo liso 22 alfa x
Q03252 Lamin B2 x x
Q03591 Factor de complemento H relacionado con la proteína 1 precursor x
Q04917 14 3 3 proteína eta x x
Q06323 Subunidad 1 del complejo activador del proteasoma x
Q06828 Fibromodulina x x x x
Q06830 Peroxiredoxina 1 x x
Q07507 Dermatopontin x x x x
Q07960 Proteína activadora de Rho GTPasa 1 x
Q08257 Quinone oxidorreductasa x
Q08431 Lactadherina x x
Q12765 SEcernin 1 x
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoil CoA isomerasa precursor mitocondrial x x
Q13228 Selenium binding protein 1 x x
Q13404 La enzima de conjugación de ubiquitina E2 variante 1 x
Q13409 Dineína citoplasmática 1 cadena intermedia 2 x
Q13509 Tubulina beta 3 cadena x x x
Q13642 Cuatro y medio LIM dominios proteína 1 x
Q13765 La subunidad alfa asociada al polipéptido naciente x
P13885 N Tubulina beta 2A cadena x x
Q14194 Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 1 x
Q14195 Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 3 x x x x
Q14624 Precursor H4 de la cadena pesada inhibidor de la tripsina inter x
Q14697 Precursor de la alfa glucosidasa AB neutra x
Q14764 Mayor proteína de bóveda x
Q14767 Factor de crecimiento transformante latente beta proteína de unión 2 x x
Q14894 Mu cristalin homólogo NADP regulado hormona tiroidea proteína de unión x
Q15063 Periostin precursor x x x x
Q15084 Precursor de proteína disulfuro isomerasa A6 x
Q15113 Procollagen C endopeptidase enhancer 1 precursor x
Q15181 Pirofosfatasa inorgánica x
Q15365 Proteína de unión a Poly rC 1 x
Q15366 Proteína de unión a Poly rC 2 x
Q15582 Factor de crecimiento de transformación proteína inducida por beta x x x
Q15819 La enzima de conjugación de ubiquitina E2 variante 2 x
Q16352 Intersexo alfa x
Q16473 Putativo tenascin XA x
Q16555 Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 2 x x x
Q16698 2 4 dienoyl CoA reductasa precursor mitocondrial x
Q16891 Membrana interna mitocondrial x
Q562R1 Beta actina como la proteína 2
Q6S8J3 POTE ankyrin dominio miembro de la familia E x
Q6UWY5 Precursor de la proteína 1 similar a la olfactomedina x x
Q71U36 Tubulina cadena alfa 1A x x x
Q7Z7G0 Objetivo del precursor Nesh SH3 x x x
Q8WUM4 Proteína que interactúa con la muerte celular programada 6 x
Q8WWX9 Thioredoxin como selenoprotein M precursor x
Q92597 Proteína NDRG1 x
Q92945 Proteína 2 de enlace de elemento aguas arriba x
Q96CN7 Isochorismatase dominio que contiene la proteína 1 x
Q96CX2 Dominio BTB POZ que contiene proteína x
Q96KK5 Histona H2A tipo 1 H x x
Q96KP4 Dipeptidasa citosólica inespecífica x
Q99426 Tubulina específica chaperona B x
Q99497 Protein DJ 1 x x
Q99536 Proteína de la membrana vesicular sináptica x x x
Q99714 3 hidroxiacilo CoA deshidrogenasa tipo 2 x
Q99715 Colágeno alfa 1 XII cadena x x
Q99798 Precursor mitocondrial de Aconitate hidratase x
Q9BQE3 Tubulina cadena alfa 6 x
Q9BUF5 Tubulina beta 6 cadena x x
Q9BUT1 3 hidroxibutirato deshidrogenasa tipo 2 x
Q9BVA1 Tubulina beta 2B cadena x x x
Q9BXN1 Asporin x X </ Td> x x
Q9H0W9 Ester hidrolasa C11orf54 x
Q9H4B7 Tubulina beta 1 cadena x
Q9NRN5 Precursor de la proteína 3 similar a la olfactomedina x x
Q9NRV9 Heme proteína de unión 1 x
Q9NSB2 Queratina tipo II cuticular Hb4 x x
Q9NVA2 Septin 11 x
Q9UBR2 Precursor de la catepsina Z x
Q9UBX5 Fibulina 5 x x
Q9UK22 F sólo caja proteína 2 x
Q9Y277 Proteína del canal selectivo del anión dependiente del voltaje 3 x
Q9Y281 Cofilin 2 x
Q9Y490 Talin 1 x
Q9Y696 Cloruro intracelular canal proteína 4 x
Q9Y6C2 EMILIN 1 x x

Tabla 1: Lista de las proteínas identificadas en el extracto de tejido valvular mitral cuando se aplicaron cuatro enfoques proteómicos diferentes: electroforesis bidimensional (2-DE), LC-MS E bidimensional (2D-LC / MS E ), LC / MS E y IEF en fase líquida. Se describe el método mediante el cual se identificó cada proteína.

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Discussion

Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.

En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas muestras se diseminan como un polvo fino sobre la superficie del mortero, dificultando la recolección. Otra ventaja es que la amoladora está motorizada, lo que permite procesar un mayor número de muestras de una manera reproducible y sin fatiga adicional. Una limitación en el uso de un molino es que el tamaño de la muestra que debe ser pequeño (100 mg o menos) para que el mazo sea presionado eficazmente contra el mortero. Además, los componentes del molino deben calentarse a temperatura ambiente entre los usos para limpiar gramo. En consecuencia, el procedimiento consume mucho tiempo y, si se procesan muchas muestras diariamente, se necesitan muchos conjuntos.

Un paso crítico adicional es la preparación del tampón de extracción. Las concentraciones de sal, especialmente para la urea (8 M) y la tiourea (2 M), son bastante altas; Por lo tanto, el volumen de sal es casi la mitad del volumen total de la solución. Además, la disolución no es fácil considerando que se debe evitar el calor porque, a más de 37ºC, la urea puede conducir a la carbamilación de proteínas en los terminales N de proteínas / péptidos y en los grupos amino de cadena lateral de residuos de lisina y arginina 17 . Una vez disuelto, el tampón de urea debe filtrarse con filtros de 0,22 μm y puede almacenarse a -80 ° C durante 4 semanas sin afectar su eficacia de extracción, pero debe calentarse a más de 15 ° C antes de su uso para permitir la disolución completa .

Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, la extracción de proteínas se realiza utilizando el tampón de urea descrito, ya que es una de las soluciones de extracción de proteínas más comúnmente utilizadas para estudios proteómicos debido a su compatibilidad con el isoelectroenfoque y su eficiencia en la solubilización de las proteínas escasamente solubles. Demostraron que este tampón puede solubilizar muy eficientemente las proteínas escasamente solubles, tales como las proteínas de membrana integral 19 , o las proteínas que son altamente propensas a la agregación, tales como la tubulina 18. Además, este tampón es totalmente compatible con el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína y Puede ser utilizado directamente en 2-DE y en fase líquida IEF análisis.

Sin embargo, este tampón no es ideal para la solubilización de todas las proteínas presentes en una muestra. Es posible que diferentes tampones de extracción podrían revelar proteínas indetectables por este protocolo. Por ejemplo, es bien conocidoWn que las proteínas ribosómicas y nucleares podrían ser mejor extraídos con extracción ácida o ácido tricloroacético / acetona precipitación [ 20] , mientras que los niveles de pH alcalino son más adecuados para las proteínas de membrana [ 21 , 22] . Por lo tanto, el uso de tampones alternativos podría requerir pasos adicionales para la precipitación de proteínas para eliminar sales que interfieren con 2-DE o IEF en fase líquida.

Limitaciones de la técnica

El número de proteínas identificadas por este protocolo es relativamente bajo, pero el número de identificaciones y la cobertura del análisis proteómico puede incrementarse aún más mediante el uso de instrumentos más modernos, cuya precisión de masa y velocidad de secuenciación han aumentado dramáticamente en los últimos años 23. Es posible cubrir una gran parte del proteoma, sin ninguna etapa de prefracción, empleando un gradiente largo para el líquidoRomatografía, junto con un instrumento MS de alta resolución que tiene una velocidad de secuenciación rápida 24 .

Significado de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos

La capacidad de identificar y cuantificar proteínas en las válvulas cardíacas humanas, como la válvula mitral, es una tarea importante y desafiante que ayudará a dilucidar los mecanismos de los procesos fisiológicos / patológicos en las enfermedades valvulares. Definir los cambios del proteoma de la válvula mitral aumentará en gran medida la comprensión de la naturaleza de los procesos biológicos que están asociados con el estado de enfermedad del tejido.

El conocimiento actual sobre la fisiopatología de la válvula mitral es limitado y generalmente se obtiene a través del análisis de proteínas individuales implicadas en procesos específicos, tales como remodelación de la matriz extracelular, hemostasia, inflamación o estrés oxidativo. 9 , 10 .

La falta de estudios proteómicos completos puede atribuirse a la complejidad de este tejido de baja celularidad que es altamente rico en proteínas de la matriz extracelular ( es decir, proteoglicanos, colágeno y elastina). Estas proteínas representan alrededor del 80% de la cantidad total, dificultando el análisis de las proteínas de baja abundancia [ 26] .

Por lo tanto, fue necesario establecer un protocolo de extracción eficiente para maximizar la solubilización de proteínas con el fin de describir el proteoma de este tejido. Este protocolo permitió la extracción de ~ 50 μg de proteína de 1 mg de tejido. Este es un rendimiento relativamente bajo en comparación con el tejido "blando",Como el hígado (~ 135 μg de 1 mg de tejido), pero es suficiente para realizar un análisis de proteínas en muestras individuales. Esto es particularmente relevante cuando se define la variabilidad intraindividual de un fenómeno.

Además, este método tiene la ventaja de ser compatible con muchas aplicaciones analíticas. Las proteínas de la válvula mitral disueltas en el tampón de extracción propuesto pueden usarse directamente para la inmunotransferencia y el análisis proteómico basado en la electroforesis bidimensional y la isoelectroforesis en fase líquida 11 , 12 o, después de la precipitación de la proteína para eliminar la interferencia del componente tampón, para otros ensayos tales como Espectrometría de masas libre de gel 15 .

Con la aplicación de este protocolo de extracción, se ha obtenido una caracterización más exhaustiva de los componentes proteicos del tejido valvular mitral normal a través de la identificación de muchos componentes intracelularesLulares. Estas proteínas están localizadas en el citosol o en organelos, no sólo en la matriz extracelular, y tienen diferentes funciones moleculares y biológicas. También se identificaron otras proteínas interesantes ( es decir, CryAB, septin-11, FHL-1 y dermatopontin). Estas proteínas tienen funciones desconocidas en la válvula mitral, pero sus propiedades biológicas sugieren un posible papel en las enfermedades valvulares.

Aplicaciones o direcciones futuras después de dominar esta técnica

Con este protocolo, es posible correlacionar los datos relativos a la expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa de mRNA y análisis no inmunohistoquímicos cuantitativos. De hecho, cuando se usan conjuntamente, estos enfoques llevarán a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad, desde el mRNA a la modificación de la proteína post-traduccional. Por lo tanto, este método puede ser de interés para los investigadores centrados en la fisiopatología de la válvula cardíaca. AletaEste protocolo también se puede aplicar a la válvula mitral porcina, que se asemeja mucho a la válvula humana 27 y se utiliza como modelo experimental para la evaluación de la función de la válvula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El Ministerio de Salud de Italia apoyó este estudio (RC 2013-BIO 15). Damos las gracias a Barbara Micheli por su excelente asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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