Summary

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Published: June 14, 2017
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Summary

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Abstract

El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados ​​en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.

Introduction

La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma – que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas – ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas dentro de las células 1 , 2 .

Además, las proteínas dictan en última instancia la función de la célula y por lo tanto dictan su fenotipo, que puede experimentar cambios dinámicos en respuesta a los factores autocrinos, parácrinos y endocrinos; Mediadores sanguíneos; temperatura; Tratamiento farmacológico; Y la enfermedad se desarrollanCión. Por lo tanto, un análisis de la expresión centrado en el nivel de proteína es útil para caracterizar el proteoma y para desentrañar los cambios críticos que se le ocurren como parte de la patogénesis de la enfermedad [ 3] .

Por lo tanto, las oportunidades que presenta la proteómica para aclarar las condiciones de salud y enfermedad son formidables, a pesar de los desafíos tecnológicos existentes. Las áreas de investigación particularmente prometedoras a las que la proteómica puede contribuir incluyen: la identificación de la expresión alterada de la proteína a cualquier nivel ( es decir, células enteras o tejidos, compartimentos subcelulares y fluidos biológicos); La identificación, verificación y validación de nuevos biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad; Y, con suerte, la identificación de nuevas proteínas objetivo que se pueden utilizar con fines terapéuticos, así como para la evaluación de la eficacia de los medicamentos y la toxicidad [ 4] .

Capturar la complejidad deEl proteoma representa un desafío tecnológico. Las herramientas proteómicas actuales ofrecen la oportunidad de realizar análisis a gran escala y de alto rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de niveles alterados de proteínas. Además, la introducción de técnicas de fraccionamiento y enriquecimiento, destinadas a evitar la interferencia causada por las proteínas más abundantes, también ha mejorado la identificación de proteínas mediante la inclusión de las proteínas menos abundantes. Finalmente, la proteómica se ha complementado con el análisis de las modificaciones postraduccionales, que progresivamente emergen como importantes moduladores de la función de las proteínas.

Sin embargo, la preparación de la muestra y la recuperación de proteínas en los especímenes biológicos en análisis siguen siendo los pasos limitantes en el flujo de trabajo proteómico y aumentar el potencial de posibles trampas [ 5] . De hecho, en la mayoría de las técnicas de biología molecular que deben ser optimizadas, los primeros pasos son homogenizat de tejidoIon y lisis celular, especialmente durante el análisis de proteínas de baja abundancia para las que no existen métodos de amplificación. Además, la naturaleza química de las proteínas puede influir en su propia recuperación. Por ejemplo, el análisis de proteínas altamente hidrófobas es muy difícil, ya que fácilmente precipitan durante el enfoque isoeléctrico, mientras que las proteínas trans-membrana son casi insolubles (revisado en la Referencia 5). Además, la variabilidad de la composición del tejido crea una barrera significativa para desarrollar un método de extracción universal. Finalmente, debido a que casi todos los especímenes clínicos son de cantidad limitada, es esencial para permitir la preparación de proteínas con máxima recuperación y reproducibilidad de cantidades mínimas de muestra [ 6] .

Este trabajo describe un protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral cardiaca humana normal, que representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico. La válvula mitral normal es un compLex estructura situada entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo del corazón ( Figura 1 ]. Desempeña un papel importante en el control del flujo sanguíneo desde la aurícula hasta el ventrículo, evitando el reflujo y asegurando el nivel adecuado de suministro de oxígeno a todo el cuerpo, manteniendo así un adecuado gasto cardíaco. Sin embargo, a menudo se considera que es un tejido "inactivo", con una baja celularidad y pocos componentes, principalmente en la matriz extracelular. Esto se debe a que, en condiciones normales, las células valvulares intersticiales residentes (VICs) presentan un fenotipo quiescente con una baja tasa de biosíntesis de proteínas [ 7] .

Sin embargo, se ha demostrado que, en un estado patológico, el número de VICs en la esponja aumenta y su síntesis de proteínas se activa, junto con otros cambios funcionales y fenotípicos [ 8] . Por lo tanto, no es sorprendente que los datos mínimosLa literatura se centra en el análisis de las válvulas mitológicas patológicas 9,10, en las que el aumento del número de VIC activados podría explicar el número relativamente elevado de proteínas identificadas.

En conclusión, el presente protocolo puede servir para desarrollar la comprensión de los mecanismos patógenos responsables de las enfermedades de la válvula mitral a través del estudio de los componentes de la válvula valvular mitral. De hecho, una mayor comprensión de los procesos patológicos subyacentes podría ayudar a mejorar el manejo clínico de las enfermedades valvulares, cuyas indicaciones actuales para la intervención se basan principalmente en consideraciones hemodinámicas.

Protocol

En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan …

Representative Results

La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados ​​en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) 11 y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) 12 ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli 13 Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa 14 . <p class="…

Discussion

Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.

En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, la…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El Ministerio de Salud de Italia apoyó este estudio (RC 2013-BIO 15). Damos las gracias a Barbara Micheli por su excelente asistencia técnica.

Materials

Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

References

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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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