Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

Bioengineering

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Summary

Le but du présent protocole est de générer un modèle de fractures vertébrales liées à l’ostéoporose rat nu qui peut être évalués longitudinalement en vivo à l’aide d’une microcomputed semi-automatique axée sur la tomographie quantitative analyse structurale.

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Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

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Abstract

Fractures vertébrales liées à l’ostéoporose (OVCFs) sont un besoin commun et cliniquement non satisfait avec l’augmentation de la prévalence dans le vieillissement de la population mondiale. Des modèles animaux de FOCR sont essentiels pour le développement préclinique de stratégies ingénierie tissulaire translationnelle. Alors qu’un certain nombre de modèles existe actuellement, ce protocole décrit une méthode optimisée pour induire de multiples défauts vertébraux hautement reproductibles dans un seul rat nu. Une tomographie de roman microcomputed semi-automatique longitudinale (µCT)-base d’une analyse structurelle quantitative des anomalies vertébrales est aussi détaillée. Brièvement, des rats ont été projetés à plusieurs points de temps post-op. L’analyse du jour 1 a été réorientée vers une position standard, et un volume standard d’intérêt a été défini. Scans µCT ultérieures de chaque rat ont été enregistrées automatiquement à l’analyse de la journée 1 donc le même volume d’intérêt a été ensuite analysé pour évaluer d’une néo-formation osseuse. Cette approche versatile adaptable à une variété d’autres modèles où analyse longitudinale axée sur l’imagerie pourrait profiter d’un alignement semi-automatique 3D précis. Globalement, ce protocole décrit un système facilement quantifiable et facilement reproductible pour la recherche sur l’ostéoporose et l’OS. Le protocole suggéré prend 4 mois pour induire l’ostéoporose dans nues ovariectomisées et entre 2,7 et 4 h à générer, d’images et d’analyser les deux défauts vertébraux, selon la taille du tissu et du matériel.

Introduction

Plus de 200 millions de personnes dans le monde souffrent d’ostéoporose1. Pathologique sous-jacent diminution de la densité minérale osseuse (DMO) et microarchitecture osseuse altérée augmenter la fragilité osseuse et, par conséquent, le risque relatif de fracture2. L’ostéoporose est tellement répandue et nuisible à la santé que l’OMS a défini un problème majeur de santé publique. En outre, comme la population mondiale est prévue pour l’âge, l’ostéoporose devrait devenir encore plus fréquente.

Fractures vertébrales ostéoporotiques sont les fractures de fragilité plus courants, estimées à plus de 750 000 par an aux Etats-Unis. Ils sont associés à une morbidité significative et aussi bien comme une mortalité plus élevée de neuf fois taux3. Dans les essais cliniques, actuellement disponibles interventions chirurgicales, telles que la vertébroplastie et en kyphoplastie, se sont avérées pour être pas plus efficace qu’une imposture traitement4,5, laissant seulement gestion de la douleur disponible pour ces patients. Les traitements actuels de FOCR étant limitées, il est impératif de développer un modèle animal qui peut répliquer le trouble6,7,8. Ces modèles animaux pourraient faciliter tant l’enquête sur les méthodes actuelles de traitement et le développement de nouvelles thérapies qui se traduira en pratique clinique. L’ostéoporose a été induite et maintenue chez les animaux de modèle par le biais de l’administration d’un régime faible en calcium (LCD) en combinaison avec une ovariectomie1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. pour davantage de modéliser la perte osseuse associée à OVCFs, défauts osseux vertébral ont été établis dans des rats immunocompétents ostéoporotiques 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. Dans ce travail, un modèle de défaut vertébral de rats immunodéprimés atteints d’ostéoporose modélisé est présenté. Ce nouveau modèle peut servir à évaluer les thérapies à base cellulaire impliquant des cellules souches provenant de diverses sources et espèces pour la réparation des fractures difficiles, tels que OVCFs.

L’imagerie osseuse est une partie cruciale de l’évaluation des maladies osseuses et des fractures. Les méthodes d’imagerie avancées ont été développés pour l’évaluation précise de la modification de la structure osseuse et de stratégies de régénération25. Parmi eux, l’imagerie µCT a émergé comme une méthode non invasive, facile à utiliser et peu coûteuse qui fournit des images 3D à haute résolution. L’imagerie µCT a plusieurs avantages par rapport aux autres modalités dans l’évaluation des patients atteints d’ostéoporose, qui offre une haute résolution 3D bone microarchitecture26 qui peuvent ensuite être quantitativement analysés. Ce dernier peut alors servir à comparer les effets thérapeutiques des traitements proposés. En effet, l’imagerie in vivo µCT est un étalon-or pour la régénération de défaut vertébral suivi1,16,27. Cependant, quelques publications28,29,30,31 ont utilisé des outils d’enregistrement automatisé pour réduire la dépendance par rapport à l’utilisateur, interpolation, précision erreur et µCT analyse axée sur l’imagerie. Récemment, nous avons été les premiers à utiliser une procédure d’enregistrement pour améliorer l’analyse de la régénération osseuse dans un OS Standard Sub, comme expliqué dans ce protocole32 .

La méthode décrite ici peut être utilisé pour étudier l’effet des thérapies cellulaires roman pour OVCFs, sans être gêné par le hôte réponses de cellules T qui pourraient rejeter xénogéniques ou allogéniques de cellules. L’ostéoporose est induite chez de jeunes rats par ovariectomie (OVX) et un écran LCD de 4 mois. Le jeune âge des rats OVX, combinée avec l’écran LCD, nous permis d’atteindre une masse osseuse basse pointe, imitant l’ostéoporose postménopausique par menant à la perte osseuse irréversible. Cela peut s’expliquer en partie par le fait que, au cours de l’écran LCD et à environ 3 mois d’âge, la transition de rats de l’os de modélisation de remodelage de phase à la vertèbre lombaire33, ce qui augmente la probabilité de maintenir l’ostéoporose au cours temps. À l’aide de jeunes animaux rend ce modèle plus économique, car ils coûtent moins cher. Néanmoins, il est limité par intrinsèquement sans compter les changements biologiques chez l’animal de vieillissement.

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Protocol

toutes les expérimentations animales ont été effectuées en vertu d’un protocole approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Cedars-Sinai Medical Center (protocole # 3609). L’anesthésie a été administrée pendant toutes les procédures d’imagerie et chirurgies. Tous les animaux étaient logés conformément aux protocoles approuvés de IACUC.

Remarque : le protocole expérimental du présent protocole est illustré à la Figure 1. Acheter des rats âgés de six semaines avec leurs ovaires enlevés chirurgicalement et les nourrir un LCD composé de phosphate de calcium et 0,77 % 0,01 %. Après une période de 4 mois et d’un écran LCD, percer un défaut vertébral de taille critique dans les corps vertébraux lombaires (L4-L5) quatrième et cinquième. Après la chirurgie, l’image les rats le jour 1 et les semaines 2, 4, 8 et 12 après le défaut de mise en place. Localiser les défauts marginaux sur le scan du jour 1, réorienter vers une position standard et définir un volume cylindrique d’intérêt (VOI). Enregistrer automatiquement les scans µCT ultérieures (c'est-à-dire, pour les semaines 2, 4, 8 et 12) de chaque rat à la position standard définie pour l’analyse correspondante à jour 1. Appliquer le jour 1 prédéfinis VOI pour les scans enregistrés. Évaluer la densité osseuse du volume et la masse volumique apparente des voi.

1. induction of Osteoporosis

  1. mis six semaines athymiques ovariectomisées rats sur un écran LCD composé de phosphate de calcium et 0,77 % 0,01 % de 4 mois.
  2. Commutateur de retour à un régime alimentaire normal.
    Remarque : Ces rats seront considérées comme une " des rats ostéoporotiques " ci-après.

2. Modèle de défaut vertébral

Remarque : le moment est de 40-50 min par animal.

  1. Autoclave tout chirurgical des outils avant la chirurgie.
  2. Dans le cas de plusieurs chirurgies, stériliser tous les instruments chirurgicaux.
    1. Laver les outils et les placer dans un bain sonicateur pour 5 min. placer dans un ensemble de stérilisateur boudin chaud à 250 ° C pendant 20 s. autoriser les outils se refroidir pendant 5 min.
  3. Anesthésie Induce.
    1. Place le rat ostéoporotique dans la chambre de l’induction attaché à une machine d’anesthésie avec un système central de balayage. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène et de maintenir par cône de nez à l’isoflurane 2 à 3 %. La pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
    2. S’appliquent à un stimulus d’orteil-pincée pour assurer un plan adéquat de l’anesthésie. Si aucune réponse n’est constatée, ouverture de la procédure.
  4. Placez le rat anesthésié en décubitus dorsal sur un coussin chauffant (37 ° C) et étendre les membres en utilisant un système de rétraction fixateur magnétique ( Figure 2 a).
    Remarque : La température du coussin chauffant est importante pour la prévention de l’hypothermie, comme un rat anesthésié est incapable de réguler sa température corporelle.
  5. Raser la zone abdominale à l’aide d’un rasoir électrique. Il tamponner à base d’iode antiseptique et chlorhexidine gluconate de 0,5 %, suivie de l’éthanol à 70 %.
  6. Le rat injecter carprofène (5 mg/kg de poids corporel (BW), sous-cutanée (SQ)) avant d’entamer la procédure chirurgicale.
  7. Utiliser un scalpel stérile pour couper la peau. Commencer l’incision de 1 cm en dessous du processus xiphoïde et couper à travers la ligne médiane (~ 5-8 cm) ( Figure 2 b).
  8. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à pratiquer une incision de l’aponévrose par le biais de la linea alba pour accéder à la cavité abdominale ( Figure 2).
  9. Exposer la cavité abdominale à l’aide d’écarteurs ( Figure 2D).
  10. Faire dévier les intestins vers la droite du rat pour exposer l’aorte abdominale et le rein gauche ( Figure 2E). Palper la colonne lombaire avant de procéder à l’exposer. Pour éviter la déshydratation, utiliser des gazes imbibés stériles avec une solution saline stérile pour envelopper les organes internes.
  11. Thermocautery d’utilisation pour les exposer dans les couches de la face antérieure des corps vertébraux lombaires L4-5 et de les isoler du tissu conjonctif et les muscles environnants ( Figure 2F -G).
    Remarque : Thermocautery devrait servir à contrôler le saignement au cours de la dissection.
  12. Utiliser un tampon de coton stérile imprégnée de sérum physiologique stérile pour enlever les tissus sanguins et résiduel de la vertèbre L4. Utiliser une fraise de perceuse trépan stérile (~ 2 mm de diamètre) pour percer un défaut de 5 mm de profondeur osseuse dans le centre de la face exposée antérieure du corps vertébral (Figure 2 H-I).
    Remarque : Appliquer une pression minimale à percer seulement le cortex ventrale et l’OS trabéculaire sous-jacent ; Évitez de percer à travers le cortex dorsal. Notez que les vertèbres des rats ostéoporotiques sont très fragiles. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le défaut et appliquez une pression pour arrêter le saignement, le cas échéant.
  13. Répéter l’étape 2.11 sur la vertèbre L5 pour créer un total de 2 défauts par rat ( Figure 2J).
  14. Retourne les intestins dans la cavité abdominale.
  15. Utiliser une suture chirurgicale résorbable synthétique de vicryl (3-0 vicryl incolores 27 " cône SH) dans un motif continu pour la suture de l’aponévrose ( Figure 2 K).
  16. Fermer la peau à l’aide d’une suture non résorbable de nylon monofilament 4-0 dans un motif simple interrompu ( Figure 2 L).
  17. Appliquer 100 µL d’adhésif topique de la peau sur le dessus de la suture de la peau et entre eux pour assurer la fermeture complète de la peau.
  18. Injecter le rat sonnerie amorcez tiède (37 ° C) ' solution s (1CC/100 g, BW, SQ) pour prévenir l’hypothermie et déshydratation.
  19. Injecter le rat de buprénorphine (0,5 mg/kg de poids vif, SQ) avant la chirurgie et tous les 8 à 12 h pour soulager la douleur après l’opération si nécessaire.
  20. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. En outre, de ne pas retourner un animal qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré.
  21. Après que l’animal a récupéré sur le coussin chauffant, retourner à sa cage.
    NOTE : Maison les rats individuellement (c.-à-d., dans des cages séparées) pour prévenir les rat-de-rat mutilé les sutures et enroulés.
  22. Placer chow trempée dans l’eau dans une boîte de Pétri sur le plancher de la cage pour quelques jours post-op aider à atteindre la nourriture les rats.
  23. Administrer carprofène (5 mg/kg de poids vif, SQ) 24h après chirurgie pour soulager la douleur toutes les 24 h si nécessaire.
  24. Enlever les sutures de la peau, tandis que l’animal est inférieur à 2 % isoflurane anesthésie 10-14 jours après les opérations.

3. Balayage de la gamme

Remarque : le timing est 30-40 min par animal.

  1. Le lendemain de l’intervention chirurgicale, placez le rat ostéoporotique dans le compartiment d’induction attaché à une machine d’anesthésie avec un système central de balayage. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène et de maintenir par le cône de nez à 2-3 % isoflurane.
  2. Scan le rat à l’aide d’un scanner µCT in vivo. Répéter le balayage pour l’analyse longitudinale de la régénération osseuse.
    Remarque : Assurez-vous que tous les animaux sont analysés en utilisant les mêmes paramètres (p. ex., l’énergie des rayons x, numérisation de moyenne intensité, voxel taille et résolution d’image) et dans un similaorientation de la r. Par exemple : l’énergie des rayons x, kVP 55 ; courant, µA 145 ; taille de voxel, 35 µm ; incréments, 115 µm ; et temps d’intégration, 200 ms ; avec les échantillons dans du PBS. Se référer à Bouxtein et al. 34 pour plus d’explications et de considérations impliqués dans rongeurs µCT numérisation pour une évaluation de la microstructure de l’OS. Idéalement, la plus haute résolution de numérisation disponible serait utilisée pour tous les scans ; Cependant, scans haute résolution nécessitent des temps d’acquisition, génèrent de grands ensembles de données et exposent les animaux à plus des rayonnements ionisants. Ce dernier peut introduire des effets indésirables, y compris la guérison des fractures une diminution. Par conséquent, le compromis entre des données supplémentaires et de temps d’acquisition doivent être examiné attentivement.

4. Séparation vertébrale

Remarque : le moment est de 20-30 min par exemple.

  1. Contour de la vertèbre d’intérêt, comme illustré dans la Figure 3 a-I. n’oubliez pas d’inclure toutes les parties de la vertèbre tout en excluant les pièces qui appartiennent aux vertèbres adjacentes.
    1. Cliquez sur " programme d’évaluation µCT " et sélectionnez l’exemple dans le menu.
    2. Contour de chaque tranche à l’aide de la souris.
    3. Utilisation du " Z " bar pour aller à la tranche suivante.
  2. Sauver la vertèbre profilée dans un fichier séparé ( Figure 3J -K) en cliquant sur " File " → " GOBJ Save " tous les deux tranches.

5. définition de la VOI pour une évaluation Quantitative longitudinale

Remarque : les étapes suivantes dépendent si l’analyse est de 1 jour après la chirurgie (vertèbre de référence) ou de la date ultérieure points ( cibler les vertèbres).

  1. Vertèbre référence.
    Remarque : Le moment est de 20-30 min par échantillon.
    1. Z-rotation, mesurer l’angle des marges à l’aide d’une XY-tranche du centre du défaut ( Figure 4 a -B).
      1. Sur le plan Z, allez à la zone de la vertèbre où le défaut est plus clair et écran capture la vertèbre.
      2. Dans un logiciel de présentation, préparer un objet en forme de rectangle qui rentrera dans le vice.
      3. Faire pivoter l’image de la vertèbre, telle que le défaut fait face vers le haut et les défauts marginaux est parallèles aux côtés du rectangle.
      4. Mesure de l’angle de rotation (faites un clic droit sur l’image → " Format photo " → " taille ").
      5. Utiliser l’angle mesuré pour faire pivoter la vertèbre ( Figure 4).
        1. Ouvrir une nouvelle fenêtre de DECterm (" Gestionnaire de Session " → " Applications " → " DECterm ").
        2. Run " ipl " :
        3. Ipl > turn3d
        4. -entrée [en] >
        5. -sortie [out] >
        6. -turnaxis_angles [0,000 90,000 90.000] > 90 90 0
        7. -turnangle [0,000] > angle mesuré
        8. -img_interpol_option [1] >
    2. X-rotation, mesurer l’angle des marges à l’aide une YZ-tranche du centre du défaut ( Figure 4 -E). Utilisez l’angle mesuré pour faire pivoter la vertèbre ( Figure 4F).
      1. Cliquez sur " YZ " dans " uCT programme d’évaluation " et répétez les étapes 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > isq
      3. -aim_name [en] >
      4. -isq_filename [default_file_name] > insérer le répertoire du fichier ISQ (p. ex., " DK0 : [MICROCT. DONNÉES. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -dim [-1-1 -1] >
    3. Flip la vertèbre pivotée en changeant le plan XY au plan ZX.
      1. Ouvrir une nouvelle fenêtre de DECterm (" Gestionnaire de Session " → " Applications " → " DECterm ").
      2. Run " ipl " :
      3. Ipl > flip
      4. -entrée [en] > à
      5. -entrée [out] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. Définir la VOI.
      1. Tirage au sort une circulaire contour du défaut à l’aide d’une tranche du centre du défaut en sélectionnant l’icône contour circulaire en " programme d’évaluation uCT " ( Figure 6 a). Copie que le contour et le coller sur toutes les tranches dans le défaut ( Figure 6 b).
        Remarque : Étant donné que tous les défauts ont été créés en utilisant la même procédure, analyser le même nombre de tranches et, par la suite, le volume total (TV) pour tous les échantillons.
  2. Vertèbre cible.
    Remarque : Le moment est de 10-20 min par échantillon.
    1. Charge le DICOM files de la cible et les vertèbres de la référence à la fenêtre principale du logiciel d’analyse image.
      Remarque : Pour éviter les changements de valeur de niveaux de gris, définissez la même sortie type de données que les fichiers DICOM originales dans le menu de chargement.
    2. Registre à la référence de la vertèbre.
      1. Lancement la " 3D Voxel enregistrement " module et la vertèbre de référence comme l’entrée le " Volume de Base " et la vertèbre de cible comme le " Match Volume. " cliquez sur " Registre " pour enregistrer les vertèbres ( Figure 5).
    3. Enregistrer les fichiers enregistrés en utilisant les mêmes données de type et l’importer dans un environnement µCT.
    4. Appliquer le VOI.
      1. Appliquer le VOI défini pour la vertèbre de référence à la vertèbre cible enregistré en cliquant sur " programme d’évaluation uCT " → " File " → " GOBJ charge " et en sélectionnant le GOBJ créé précédemment. Vérifier que la VOI et les défauts sont concentriques.

6. MicroCT analyse

Remarque : la synchronisation est 10-20 min par exemple.

  1. Envoyer la VOI pour évaluation à l’aide d’un programme d’évaluation de µCT ( Figure 6).
    NOTE : Assurez-vous d’utiliser les mêmes paramètres lors de l’analyse toutes les VOIs. Veillez à ce que le seuil est fixé suffisamment élevé pour omettre le bruit de fond avec une perte minimale de l’OS. Si l'on utilise un biomatériau radio-opaque, un certain nombre de stratégies pourrait être utilisé pour analyser la formation osseuse. S’il y a une différence de densité entre le tissu de biomatériaux et d’os, ce biomatériau peut être segmenté sur 35 , 36. Dans le cas contraire, les enquêteurs pourraient évaluer qualitativement les différences dans la formation osseuse entre les groupes expérimentaux.

7. L’euthanasie

  1. PPlace ostéoporotique rat dans la chambre de l’induction attaché à une machine d’anesthésie. Induire l’anesthésie à l’isoflurane de 5 % à 100 % d’oxygène.
  2. Entretien anesthésie par l’intermédiaire de coiffe et effectuer l’euthanasie par incision de la cavité thoracique pour produire un pneumothorax bilatéral 37.

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Representative Results

Utilisant ce protocole, on peut l’image et de quantifier la régénération de n = 8 modélisés anomalies vertébrales ostéoporotiques à travers différents moments. La correspondance anatomique obtenue par la procédure d’enregistrement permet l’analyse de la VOI même à tous les points dans le temps. Il en résulte une analyse histomorphométrique 3D longitudinales très précises, même lorsque les marges de la malformation originale ne sont plus reconnaissables. Nous avons utilisé cinq points dans le temps (jour 1, semaine 2, semaine 4, 8 et 12e semaines) à titre d’exemple pour l’évaluation longitudinale de la régénération osseuse (Figure 7). La régénération peut être évaluée par l’évaluation qualitative des coupes 2D et 3D images (comme illustré à la Figure 7 a) et par la comparaison quantitative de la qualité (AD) (Figure 7 b) et la quantité d’OS (BVD). Les indices morphométrique suivants peuvent être déterminés pour l’OS nouvellement formé : (i) TV, y compris les volumes osseux et des tissus mous (TV, mm3) ; (ii) le volume des tissus minéralisés (BV, mm3) ; (iii) la densité du volume osseux (BV/TV) ; et la densité minérale osseuse (iv) (BMD, hydroxyapatite mg par cm3). Plus précisément, la formation osseuse minimale (augmentation de 5 % la densité osseuse volume) a été observée 2 semaines après le défaut de mise en place. Après deux semaines, aucune différence significative dans la formation des os ont été observées par rapport aux points plus tard dans le temps. Dans l’ensemble, bien qu’il y avait une certaine formation osseuse, qui a culminé à environ 10 % par semaine 8, c’était assez minime pour maintenir l’OS Sub au fil du temps.

Figure 1
Figure 1 : conception de protocole. Les étapes clés dans le protocole sont décrites. Premières rates ovariectomisées nues soumises à quatre mois d’un régime de faible teneur en calcium (LCD) ont été exploitées pour créer des défauts de taille critique standards à deux vertèbres lombaires. Les rats ont été projetés le jour 1 et post-opératoire semaines 2, 4, 8 et 12. L’analyse du jour 1 a été réorientée vers une position standard, et une VOI cylindrique a été défini en utilisant les défauts marginaux. Scans µCT ultérieures de chaque rat ont été enregistrées automatiquement à la position standard définie pour l’analyse correspondante à jour 1. Le jour que 1 VOI prédéfini a ensuite été appliquée pour les scans enregistrés. La densité osseuse du volume et la densité apparente de la VOI ont servi à évaluer néo-formation osseuse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : chirurgie vertébrale défaut. Les étapes principales de la génération chirurgicale des anomalies vertébrales sont illustrées. Tout d’abord, les rats ont été placées sur un coussin chauffant (A). Une incision médiane a été effectuée par le biais de la peau (B), puis de la linea alba (C) pour exposer la cavité abdominale (D). Les intestins se retrouvaient pour exposer la paroi abdominale postérieure (E), et la colonne lombaire a été exposée à l’aide de thermocautery (flèche, F-G). Défauts ont été forés dans le quatrième (H, flèche pointant vers la foret ; J’ai, flèche pointant vers le vice) et cinquième (J, flèches pointant vers les défauts) des corps vertébraux lombaires. Enfin, l’aponévrose (K) et la peau (L) sont suturées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : séparation de la vertèbre. Les étapes principales de la minceur de la vertèbre d’intérêt sont indiqués. (A-I) Profilée (ligne verte) tranches 2D représentant l’axe de la longueur d’une vertèbre s’affichent. Une représentation 3D du rachis complet (J) peut être comparée à la vertèbre séparée (K). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : positionnement de la vertèbre de référence. Des tranches représentant dans deux plans sont indiqués d’une vertèbre avant et après la rotation d’une position standard. Tout d’abord, à l’aide d’un représentant de XY-tranche (A), l’angle (B, vert) nécessaire pour faire pivoter le défaut (B, la place rouge) à devenir parallèles à l’axe y (B, jaune) est déterminée et ensuite utilisé pour créer l’image pivotée (C ). Ensuite, l’angle (E, vert) pour faire pivoter le défaut (E, place rouge) à devenir parallèles à l’axe z (E, jaune) à l’aide d’une représentant de YZ-tranche (D), est déterminé et ensuite utilisé pour créer l’image pivotée (F ). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : cible d’enregistrement vertèbre. Des tranches représentant à trois avions de la vertèbre (marqué en vert) de la cible et la vertèbre de référence (marqué en rouge) avant (A-C) et après inscription (D-E) sont indiquées. Notez la couleur jaune, indiquant le chevauchement entre les vertèbres de cible et de référence et les flèches blanches qui pointent vers OS vert après la régénération, indiquant la formation osseuse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : analyse VOI. Représentant tranches en deux plans avec le volume moulant d’intérêt sont indiqués. Un contour circulaire est placé au centre de la défectuosité d’une représentante ZX-tranche (A). Après toutes les ZX-tranches de contournage, le volume de défaut complet peut être vu dans le plan XY (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : analyse longitudinale de la régénération de défaut vertébral. Résultats de l’analyse qualitative et quantitative des os représentatives régénération apparaissent. (A) A représentant défaut vertébral à divers moments est représenté dans chaque panneau comme une image 3D frontale (panneau supérieur) avec la formation osseuse dans le vide, indiquée en rouge, une image 2D sagittale (panneau central) et une image 2D axiale (panneau inférieur). L’analyse quantitative de la formation osseuse dans les vides a été réalisée. Volume d’OS (B) la densité et la masse volumique apparente (C) ont été calculées et comparées à l’aide d’un multiple mesure bidirectionnelle ANOVA avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Les barres d’erreur représentent SEM. ***-p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez sur ellee pour obtenir une version agrandie de cette figure.

Mesures Problème Raisons possibles Solution
2.3 Animal haletant sous anesthésie Livraison excédentaire isoflurane Réduire la concentration d’isoflurane livré à l’animal.
Animaux répond à l’orteil pincée Prestation insuffisante isoflurane Augmenter la concentration de l’isoflurane.
2.7-2.12 Des saignements abondants Lésions vasculaires Utilisez un coton-tige stériles pour appliquer la pression ou cautérisation pour arrêter le saignement.
L’animal a des difficultés à respirer Le diaphragme a été perforé Euthanasier l’animal pour éviter l’étouffement.
Fuite du contenu intestinal Le tractus gastro-intestinal a été perforé Euthanasier l’animal afin de prévenir d’autres complications. Empêchez-le en soulevant l’aponévrose loin sous-jacent intestins avant des couper.
Sang se dégage sur le site de forage Un vaisseau sanguin a été perforé Appliquer un tampon de coton stérile jusqu'à ce que le saignement s’arrête.
Animal secoue soudain pendant le forage La perceuse est allé trop profonde et endommagé la moelle épinière Euthanasier l’animal afin de prévenir d’autres complications.
Le défect osseux semble incomplète La perceuse ne vont pas assez profonde Repositionner la tête de perçage à l’intérieur de la défectuosité et de percer plus profond
2.15-2.24 Sauts de suture La suture a été tirée trop serré Remplacer toute la suture. Si la rupture se produit souvent, utilisez une suture plus épaisse de taille.
Animal est lent à se rétablir de l’anesthésie L’animal est en état d’hypothermie Augmentez la température du coussin chauffant ou appliquer une autre source de chauffage (lampe de chauffage par exemple).
Les sutures sont ouverts Les sutures sont placées plus ou moins, ou l’animal a fait une activité intense Réappliquer les sutures et appliquer Dermabond directement sur les sutures et entre eux.
3 Image numérisée s’affiche avec une résolution faible, bruyante ou disséminée Paramètres de numérisation doivent être ajustés Ajustez les paramètres du protocole de balayage. Se référer à Bouxsein et autres pour plus d’instructions pour la numérisation.
Image numérisée apparaît floue L’animal déplacé au cours du processus de numérisation Nouvelle analyse de l’animal. Si le mouvement continue, augmenter la concentration en isoflurane.
5 L’enregistrement de vertèbre cible n’a pas été réussie Séparation vertébrale n’a pas été faite correctement Reformer la vertèbre : Assurez-vous que toutes les parties de la vertèbre sont inclus et excluent toute les structures adjacentes.
Grande différence dans le positionnement des vertèbres Repositionner la vertèbre de cible dans la même orientation que la vertèbre de référence à l’aide de rotations et flip (étape 29 a).
Analyser ne peut pas reconnaître correctement les structures osseuses Appliquer un seuil dans le module d’enregistrement pour supprimer le bruit de fond d’échantillons d’os.
Les vertèbres enregistrés sont différents Créer des images 3d de vos échantillons et aligner les vertèbres corrects dans les différents moments.
6 Le volume total (TV) diffère entre les échantillons Soit un nombre différent de tranches ou un contour différent ont été utilisé Assurez-vous de toujours utiliser la même taille de contour et le même nombre de tranches.
Valeur (BMD) de la densité minérale osseuse est anormal Calibrage inadéquat de plus Calibrer le créneau des normes correctes d’hydroxyapatite

Tableau 1 : dépannage. Les problèmes et les solutions potentielles sont présentées pour les différentes étapes dans le protocole.

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Discussion

L’ostéoporose est la cause la plus répandue des fractures vertébrales causées par une augmentation de la charge sur la colonne vertébrale et qui aboutissent à l’effondrement du corps vertébral. Toutefois, il est pratiquement impossible de générer une blessure à un rongeur qui réplique authentiquement une semblable tassements vertébraux. Au lieu de cela, chercheurs en créant un vide cylindrique dans le centre du corps vertébral pour imiter OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. puisqu’il n’y a pas de cohérence dans la littérature en ce qui concerne la taille des défauts, un défaut de taille critique a été défini comme celui qui ne guérit pas spontanément pleinement sans une intervention dans les 3 mois post-op16,17.

Bien que la méthode de la combinaison ovariectomie avec un écran LCD pour amener rapidement l’ostéoporose a été précédemment publié1,13, nous étions les premiers à montrer que l’application de cette approche aux résultats des rats athymiques dans un efficace, rapide, et diminution irréversible de l’OS trabéculaire vertébral volume et minérale densité40. Il s’agit d’un modèle reproductible de petits animaux qui est sans être gêné par le système immunitaire rongeur et que ne fait pas ont besoin d’ajouté immunosuppression, tel qu’utilisé par d’autres24.

Notre protocole chirurgical généré plusieurs défauts critiques identiques de vertébral lombaire40. Cela se traduit par des défauts très cohérentes et facilement comparables et quantifiables sur animaux. Nous croyons que les défauts produites à l’aide de cette approche sont supérieurs aux modèles de défaut vertébral générées dans les vertèbres caudales1,19,41 car la queue du rat est soumise à des forces biomécaniques qui sont significativement différentes de celles portant sur la colonne lombaire de rat.

Étapes critiques au sein de ce protocole comprennent évitant l’hypothermie peropératoire et prenant attention lorsque vous percez les vertèbres fragiles des ovariectomisées nues après un écran LCD. Après avoir généré le défaut vertébral, elle est contrôlée par une séquence temporelle d’en vivo µCT balayages aux points de temps programmé pour l’évaluation longitudinale de la réparation osseuse. Il est essentiel de conserver les mêmes paramètres de numérisation. Les vertèbres sont ensuite profilés et séparées du reste de l’analyse. Un volume total identique pour tous les scans d’une vertèbre de contournage et éviter les changements de valeur en niveaux de gris sont essentiels. Un disponible dans le commerce plusieurs algorithme d’enregistrement image facilite l’extraction de planification anatomiquement correspondante VOIs à tous les points de moment ultérieur. Enfin, ces VOIs sont analysés pour volume osseux, densité apparente, etc.. Il est essentiel d’analyser toutes les VOIs en utilisant les mêmes paramètres. Cette technique fournit une analyse extrêmement précis et simple longitudinale µCT 3D qui n’est pas dépendante de l’utilisateur.

Cette méthode pourrait être appliquée à toute analyse de régénération osseuse longitudinale défaut. Le modèle de défaut vertébral utilisé ici est un modèle idéal pour cette application, car sa structure osseuse est unique et peut être facilement enregistré à la même position anatomique. Cependant, toute régénération osseuse puisse être analysée dans les mêmes conditions en séparant correctement l’os même d’intérêt tout au long de l’analyse longitudinale. Il est impératif d’inclure des échantillons d’os séparées avec les mêmes caractéristiques anatomiques. Ce problème potentiel et autres sont décrits dans le tableau 1, ainsi que les raisons possibles et solutions suggérées. La correspondance anatomique obtenue par la procédure d’enregistrement ne peut apparaître que si les échantillons comprennent les mêmes caractéristiques anatomiques. L’enregistrement permet à l’utilisateur d’appliquer la VOI prédéfini exacte de la première analyse à tous les points de temps restant, ce qui entraîne une analyse histomorphométrique 3D très précis dans le temps. La densité osseuse volume et densité apparente de la VOI peuvent servir à évaluer néo-formation osseuse.

Bien que potentiellement largement applicable, le modèle présenté ici n’est pas sans limites. L’utilisation des rats nude athymique pourrait considérer comme une limitation, car il pourrait potentiellement masquer certains processus immunitaire qui peuvent être importante pour la régénération. Deuxièmement, l’ostéoporose grâce à une combinaison d’une ovariectomie et un écran LCD chez de jeunes rats, publiée antérieurement1,13, de la modélisation est limité dans sa capacité à imiter la biologie de la population de patients âgée. En troisième lieu, les OVCFs ont été modélisés par une intervention chirurgicale, comme les autres animaux d’avoir des fractures liées à l’ostéoporose sont des primates42. Enfin, tandis que le rat le rachis lombaire est le meilleur modèle disponible pour le rachis lombaire humaine — où se développent la plupart des fractures vertébrales — le manque de poids axial gardant à la colonne vertébrale rongeur est également une limitation.

Ce protocole est modulaire et par conséquent peut être facilement modifié pour les besoins du chercheur. Par exemple, les rats athymiques ovariectomisées pourraient être utilisés pour étudier les autres fractures liées à l’ostéoporose. Un chercheur choisit d’utiliser notre approche à l’analyse de régénération osseuse semi-automatique, elle pourrait être appliquée à n’importe quel modèle de fracture à l’aide de la structure longitudinale imaging, pas nécessairement micro-la tomodensitométrie. En outre, des informations supplémentaires pourraient recueillies par simultanément à l’aide d’autres modalités d’imagerie comme l’imagerie par résonance magnétique.

Le modèle de FOCR présenté dans le présent protocole pourrait servir à étudier de nouvelles approches thérapeutiques pour ce comblés sur le plan clinique. En outre, notre approche d’analyse semi-automatique peut être utilisé avec succès pour effectuer une analyse similaire qui dépend moins de l’utilisateur et offre une précision meilleure que les autres méthodes16. Particulièrement remarquable est le fait que nous avons utilisé le logiciel de visualisation et d’analyse disponible dans le commerce qui peut être utilisé par n’importe quel chercheur — logiciel prenant en charge les autres modalités d’imagerie, comme l’imagerie par résonance magnétique et l’imagerie nucléaire. Par conséquent, nous pensons que cette méthode est très généralisable et est seulement limitée par la disponibilité des capacités d’imagerie in vivo et logiciel d’inscription.

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Disclosures

Cette recherche a été financée par une subvention de la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (TR2-01780).

Acknowledgments

La recherche a été financée par une subvention de la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (TR2-01780).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

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References

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