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Neuroscience

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Summary

In dieser Studie wird die Methodik vorgestellt, wie man mehrfache in vivo elektrophysiologische Aufnahmen aus dem hyperdirekten Weg unter Urethananästhesie durchführt.

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Haumesser, J. K., Kühn, J., Güttler, C., Nguyen, D. H., Beck, M. H., Kühn, A. A., van Riesen, C. Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp. (124), e55940, doi:10.3791/55940 (2017).

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Abstract

Konvergente Beweise zeigen, dass viele neuropsychiatrische Erkrankungen als Störungen von großräumigen neuronalen Netzwerken verstanden werden sollten. Um die pathophysiologische Grundlagen dieser Erkrankungen besser zu verstehen, ist es notwendig, genau zu charakterisieren, in welcher Weise die Verarbeitung von Informationen zwischen den verschiedenen neuronalen Teilen der Schaltung gestört wird. Unter Verwendung von extrazellulären in vivo elektrophysiologischen Aufnahmen ist es möglich, die neuronale Aktivität innerhalb eines neuronalen Netzwerks genau abzugrenzen. Die Anwendung dieses Verfahrens hat gegenüber alternativen Techniken, zB funktionelle Magnetresonanztomographie und Calciumabbildung, mehrere Vorteile, da es eine einzigartige zeitliche und räumliche Auflösung ermöglicht und sich nicht auf gentechnisch veränderte Organismen stützt. Allerdings ist die Verwendung von extrazellulären In-vivo- Aufnahmen begrenzt, da es sich um eine invasive Technik handelt, die nicht universell angewendet werden kann. In diesem Artikel wird eine einfache und einfach zu bedienende Methode dargestelltMit denen es möglich ist, gleichzeitig extrazelluläre Potentiale wie lokale Feldpotentiale und Multifunktionsaktivitäten an mehreren Standorten eines Netzwerks aufzuzeichnen. Es wird detailliert, wie eine präzise Ausrichtung von subkortikalen Kernen durch eine Kombination von stereotaktischer Chirurgie und Online-Analyse von Multi-Unit-Aufnahmen erreicht werden kann. So wird gezeigt, wie ein komplettes Netzwerk wie die hyperdirekte Cortico-Basal-Ganglienschleife in anästhesierten Tieren in vivo untersucht werden kann .

Introduction

Die jüngsten kumulativen Evidenz bei verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Parkinson'sche Krankheit (PD) und Schizophrenie deutet stark darauf hin, dass ihre Pathophysiologie auf einer kritischen Dysfunktion von erweiterten neuronalen Kreisen beruht, die oft kortikale und subkortikale Strukturen 1 , 2 , 3 beinhalten . Nach dieser Theorie entstehen die klinischen Manifestationen der Erkrankungen als Folge einer beeinträchtigten Informationsverarbeitungskapazität eines Netzwerkes von Zellen anstelle von einzelnen Zellen oder spezifischen neuronalen Elementen 1 , 2 , 3 . Um das Verständnis dieser komplexen Gruppe neuropsychiatrischer Erkrankungen zu verbessern und neue Behandlungsmöglichkeiten zu finden, ist es notwendig, die neuronale Dynamik jener ungeordneten Netzwerke bei menschlichen Patienten und in Tiermodellen im Detail zu charakterisieren. Eine excellEnt-Methode, um große Netzwerke in lebenden Probanden zu untersuchen, ist mehrfache elektrophysiologische Aufzeichnungen von extrazellulären Potentialen 4 . Mit dieser Methode ist es möglich, lokale Feldpotentiale (LFPs) gleichzeitig zu beurteilen, die in erster Linie die zeitliche Summierung von exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Strömen und Multi-Unit-Aktivität (MUA) darstellen, die durch präsynaptische Potentiale erzeugt wird. Die Aufzeichnung von extrazellulären Potentialen hat gegenüber alternativen Methoden, um Netzwerke zu untersuchen, zB funktionelle Magnetresonanztomographie und Calciumbildgebung, weil sie eine höhere zeitliche und räumliche Auflösung bietet und weil sie nicht auf gentechnisch veränderte Organismen angewiesen ist. Allerdings ist die Verwendung von extrazellulären In-vivo- Aufnahmen begrenzt, da es sich um eine invasive Technik handelt, die nicht universell angewendet werden kann.

In vivo elektrophysiologische recOrden können sowohl bei wach als auch bei anästhesierten Tieren durchgeführt werden 6 . Beide Methoden werden von spezifischen Vor- und Nachteilen begleitet. Studien in wachen Tieren erlauben die Aufzeichnung von Hirnsignalen während der Durchführung von definierten Verhaltensaufgaben, sind aber anfällig für bewegungsbezogene und andere Artefakte 7 , 8 . Aufzeichnungen in anästhesierten Tieren bieten andererseits die Möglichkeit, LFPs und MUA mit einem Minimum an Artefakten in hoch definierten kortikalen Synchronisationszuständen zu beurteilen, aber die Ergebnisse unterscheiden sich auch in gewissem Maße von dem, was in den wachenden Fächern 9 , 10 , 11 gefunden werden kann .

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass die Probenahme von LFPs besonders nützlich ist, um pathologische Veränderungen der Netzwerkaktivität abzugrenzen. Ein prominentes Beispiel dafür ist die Erforschung der Pathophysiologie der PD bei menschlichen PatientenS und Tiermodelle der Krankheit, wo es gezeigt werden konnte, dass erhöhte Beta-Oszillationen in der Cortico-Basal-Ganglien-Schleife mit Parkinson-Motorsymptomen 12 , 13 verknüpft sind. Als Konsequenz dieser Forschungsrichtung wird derzeit untersucht, ob Beta-Oszillationen als Online-Feedback-Biomarker für geschlossene tiefe Hirnstimulation 14 , 15 verwendet werden könnten.

In der vorliegenden Studie wird eine detaillierte Beschreibung der akuten mehrstufigen in vivo elektrophysiologischen Aufzeichnungen von LFPs und MUA bei Ratten, die mit Urethan betäubt sind, bereitgestellt. Es wird gezeigt, wie ein komplettes Netzwerk, wie der hyperdirekte Cortico-Basalganglienweg, elektrophysiologisch mit Standard- und kundenspezifischen Elektroden charakterisiert werden kann und wie diese Elektroden aufgebaut werden können. Es wird besonders hervorgehoben, wie eine präzise Ausrichtung von Basalganglienkernen durch Co erreicht werden kannMbining stereotaktische Chirurgie zusammen mit der Online-Registrierung von MUAs.

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Protocol

Die experimentellen Verfahren wurden nach dem deutschen Tierschutzgesetz (zuletzt überarbeitet 2014) und den europäischen Vorschriften (2010/63 / EU) durchgeführt. Experimente wurden von der örtlichen Tierschutzbehörde (LaGeSo, Berlin) genehmigt und entsprechen der lokalen Abteilung und internationalen Richtlinien.

ANMERKUNG: In der vorgestellten Methode werden zwei Modelle von Elektroden verwendet, um von dem hyperdirekten Cortico-Basal-Ganglienpfad aufzuzeichnen, der den primären motorischen Kortex (M1) mit dem subthalamischen Kern (STN) und dem substantia nigra pars retikulieren (SNr) verbindet. Für epidurale Elektrokortikogramme (ECoG) werden Aufnahmen von den M1 maßgeschneiderten niederohmigen Ag / AgCl-Elektroden verwendet. Die Aufnahmen von STN und SNr werden mit handelsüblichen hochohmigen Wolfram-Elektroden durchgeführt.

1. Konstruktion von Epidural-Ag / AgCl-Epidural-Elektroden

  1. Nimm eine ca. 5 cm langer Streifen von 99,99% reiner Silberdraht mit einem diameteR von 200 μm und entfernen Sie ggf. Beschichtungen.
  2. Halten Sie die Drahtspitze mit der Spitze nach unten in eine Flamme eines Feuerzeugs oder einer Kerze, bis die Spitze zu schmelzen beginnt. Warten Sie, bis die Spitze kugelförmig ist und einen Durchmesser von ca. 1 mm hat. Die vorgeformte Elektrode auf eine Gesamtlänge von 15 mm vom Beginn der kugelförmigen Spitze bis zum Drahtende abschneiden.
  3. Lösen Sie einen Präzisionsstecker zum Drahtende, der für das verwendete elektrophysiologische Aufnahmesystem passt. Die Lötstelle vom Drahtende zum Verbinder mit leitfähigem Silberlack abdecken. Das hilft Leitfähigkeit und führt zu einer besseren Signalqualität.
  4. Nach dem Trocknen des leitfähigen Lackes die Lötstelle mit einem 3 mm bis 1 mm Wärmeschrumpfschlauch abdecken. Verwenden Sie sorgfältig einen Uhrmacherhammer, um die kugelförmige Spitze auf die Hälfte der Dicke zu glätten.
  5. Setzen Sie auf Untersuchungshandschuhe und nehmen Sie ein fusselfreies Reinigungstuch mit 100% Ethanol, um Schmutz und Fett zu entfernen.
  6. Setzen Sie die Elektroden inEin 15-ml-Zentrifugenröhrchen oder Zellkulturrohr und füllen es mit Haushalts-Chlorbleiche (ACHTUNG, mit 2,8 g Natriumhypochlorid pro 100 g Lösungsmittel) bis die kugelförmige Spitze vollständig bedeckt ist.
    ACHTUNG: Chlorbleiche ist korrosiv; Befolgen Sie immer die Sicherheitshinweise des Herstellers.
  7. Nach 23 min die Elektroden herausnehmen und mit destilliertem Wasser großzügig spülen. Die erfolgreiche Anwendung einer Silberchloridschicht erscheint als homogene violette Farbänderung.
  8. In der Luft trocknen Nach dem vollständigen Trocknen die Elektroden mit feiner Pinzette nehmen. Mit einem feinen Pinsel, wenden Sie flüssige elektrische Isolierung. Starten Sie den Draht direkt hinter der Elektrodenspitze und decken Sie alles bis zum Schrumpfschlauch ab. Lassen Sie die Isolierung mindestens 2 Stunden lang trocknen.
  9. Zur Qualitätskontrolle eine Überprüfung der elektrischen Leitfähigkeit mit einem Multimeter durchführen. Wenn verfügbar, führen Sie Impedanz-Tests bei 1 kHz mit einem geeigneten Impedanz-Meter, während die Elektrode und TestSonde werden in einer 0,9% NaCl enthaltenden H 2 O-Lösung zusammengesetzt, ohne sich gegenseitig zu berühren. Impedanzwerte bei 1 kHz sollten ca. 8 kΩ betragen.

2. Anbringen der Elektroden an einen stereotaktischen Halter

HINWEIS: Zur gleichzeitigen Aufzeichnung von MUA und LFPs verwenden Sie Wolfram-Microwire-Elektroden mit einer Impedanz von 1,5 MΩ. Wenn der Fokus der Aufnahmen auf qualitativ hochwertigen Aufnahmen einzelner Einheiten liegt, wählen Sie microwire-Elektroden mit einer höheren Impedanz (> 5 MΩ). Wenn das Ziel der Studie ausschließlich auf LFPs gerichtet ist, können Elektroden mit niedrigeren Impedanzen akzeptabel sein. Für kleine Strukturen, für die dorsoventrale stereotaxische Einstellungen oft notwendig sind, verwenden Sie Elektrodenpaare mit einer geeigneten dorsoventralen Spitzenabscheidung (in diesem Fall 250 μm). Darüber hinaus bietet dies den Vorteil einer lokaleren Referenzelektrode, falls erforderlich. Die stereotaxischen Koordinaten werden immer von der untersten Elektrode und a gemessenRe berechnet in Bezug auf die Bregma.

  1. Nehmen Sie einen serienmäßigen stereotaxischen Elektrodenhalter mit Acrylblock und Klemme und legen Sie ihn auf einer ebenen Fläche im Sichtfeld eines Operationsmikroskops fest.
  2. Lose das erste Paar Elektroden mit Acrylblock des Halters mit Klebestreifen (3 mm x 8 mm) mit feinen Pinzetten fixieren. Die Elektroden sollen den Acrylblock ca. 12 mm
  3. Die zweite bipolare Elektrode vorsichtig neben der ersten Elektrode fixieren. Für die Ausrichtung der Strukturen des Hyperdirect-Weges sollte der Abstand 2 mm betragen ( Abbildung 1 ). Für die meisten Standard-Stereotax-Elektrodenhalter ist dies die angrenzende Aussparung. Verwenden Sie eine Bremssattellehre, um zu überprüfen. Verschiedene Netzwerke können auf die gleiche Weise angefahren werden. Hierzu kann der Acrylblock zu einem gewissen Grad gedreht werden.
  4. Stellen Sie das zweite Paar von Elektroden ein, indem Sie es sorgfältig in eine Position schieben, in der die ventralste Spitze etwa 200 istUmgesetzt gegenüber der ersten Elektrode ( Abbildung 1 ). Tun Sie dies unter mikroskopischen Vision. Verwenden Sie dazu eine 30 G Kanüle (Außendurchmesser 300 μm), um den Abstand besser abzuschätzen.
  5. Drücken Sie auf das Klebeband und befestigen Sie es mit der Metallklemme des Halters.

3. Chirurgie

  1. Für elektrophysiologische Aufnahmen verwenden Sie Urethan (ACHTUNG) für die Anästhesie.
    Achtung: Urethan ist giftig und krebserregend, daher immer die Sicherheitsbestimmungen und das Datenblatt des Stoffherstellers einhalten.
  2. Eine Lösung von 200 mg / ml Urethan in 0,9% iger NaCl-Kochsalzlösung vorbereiten.
  3. Verabreichen Sie insgesamt 1,3 g / kg Körpergewicht Urethan intraperitoneal (IP). Abhängig von der Rattenbelastung könnte es sinnvoll sein, die Dosis in zwei Dosen mit einem 15-minütigen Intervall zwischen den Injektionen aufzuteilen, um die Sicherheit der Anästhesie zu erhöhen.
  4. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit pEdal-Entzugsreflex und andere geeignete Reflexe. Wenn die Anästhesie nicht tief genug ist, um eine Operation durchzuführen, injizieren Sie 0,15 g / kg Körpergewicht von Urethan-IP und warten noch 15 min.
  5. Wenden Sie eine Augensalbe an, um Hornhautentwässerung zu verhindern.
  6. Ständig überwachen Atemfrequenz und Pedal Entnahme Reflex während der Anästhesie. Verwenden Sie ein kleines Tier Heizkissen mit Temperaturkontrolle, um sicherzustellen, dass eine physiologische Körpertemperatur während der Operation beibehalten wird. Vor dem Beginn der elektrophysiologischen Aufnahmen wechseln Sie zu einer nicht-elektrischen Alternative ( zB Natriumacetat-Kopfpolster).
  7. Rasiere das Fell neben der dorsalen Seite des Kopfes, um ein sauberes chirurgisches Feld zu erreichen. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle mit einem geeigneten chirurgischen Desinfektionsmittel. Fixiere das Tier im stereotaktischen Rahmen.
  8. Führen Sie einen 2 cm langen Einschnitt der Kopfhaut in sagittaler Richtung mit einem Skalpell. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Schädel-Aponeurose leicht abzuschaben und den Schädel zu desinfizieren. Verwenden Sie coTtonknospen, die in 3% H 2 O 2 eingeweicht wurden , um das übrige Gewebe zu entfernen.
  9. Verwenden Sie einen Elektrokauter oder Thermokocher, um die Blutung zu kontrollieren, falls erforderlich. Stoppen Sie Blutungen aus dem Schädelknochen und Hypoderm, wenn die Blutung nicht spontan nach 1-2 min aufhört und den Blick auf den Schädel hindert.
  10. Stellen Sie den Schneidezahnstab ein, bis der Kopf in flacher Schädelposition positioniert ist, was bedeutet, dass die Bregma und Lambda als stereotaxische Referenzpunkte in der gleichen Ebene liegen. Dies ist am wichtigsten, um eine hohe chirurgische Präzision zu erreichen. Verwenden Sie ein Standard-Stereotax-Ratten-Ausrichtungswerkzeug, kalibrieren Sie die angegebene Spitze zum Bregma unter mikroskopischem Sehen und stellen Sie die Schneidezange ein, bis die vorgesehenen Punkte für das Bregma und Lambda auf dem Werkzeug gleichzeitig den Schädel berühren.
    HINWEIS: Eine Ansicht von einer Seite mit fokussiertem Licht von der anderen kann helfen, diesen Zustand zu bestimmen. Alternativ nehmen Sie einen stereotaxischen Halter mit einer feinen Kanüle und messen die dorsoventralen Koordinaten von Bregma aNd lambda unter mikroskopischen vision. Passen Sie die Schneidezelle an, bis die dorsoventralen Koordinaten von Bregma und Lambda gleich sind.
  11. Verwenden Sie einen stereotaxischen Halter mit Kanüle, kalibrieren Sie den Bregma und berechnen Sie dann die Position aller Bohrlöcher am Schädel. Mit dem stereotaxischen Halter markieren Sie die Positionen der zu bohrenden Löcher entweder durch sorgfältiges Kratzen des Schädels oder durch Verwendung einer chirurgischen Farbmarkierung. Die Koordinaten hierfür hängen von den Zielen ab, Koordinaten mit Bezug auf das Bregma sind für den Hyperdirect-Pfad in Tabelle 1 angegeben , einschließlich der vorgeschlagenen Koordinaten für zerebelläre Referenzelektroden.
  12. Mit einem Mikrobohrer alle Löcher sorgfältig bohren. Für die STN und SNr bohren Sie ein gemeinsames Loch (ca. 2 mm x 3 mm groß). Alle anderen Bohrlöcher sollten einen Durchmesser von ca. 1 mm haben.
  13. Nehmen Sie zwei feine Kanülen (mindestens 27 G) und biegen Sie ihre Spitzen, um eine hooked Form, mit einer harten Oberfläche oder Pinzette zu bilden. Verwenden Sie diese, um alle Trümmer zu entfernenS von den Bohrlöchern, und sorgfältig schneiden und entfernen Sie die Dura mater in der gemeinsamen STN / SNr Loch.
  14. Spülen Sie die Bohrlöcher mit physiologischer Kochsalzlösung. Tragen Sie einen Tropfen physiologischer Kochsalzlösung alle 15 min auf die Bohrlöcher, um das Gehirn und die Dura vor dem Austrocknen zu verhindern.
  15. Nehmen Sie einen Mikrobohrer und passende Edelstahl-Mikroschraube ( z. B. eine M 1,2 mm x 2 mm Schraube), bohren Sie ein Loch und schrauben Sie eine Mikroschraube zwischen den Bohrlöchern der Referenz-Epidural-Elektroden über dem Kleinhirn ein, machen Sie dasselbe für die M1-Epidural-Elektroden.
  16. Schieben Sie die selbstgebauten Ag / AgCl-Epidural-Elektroden in die Bohrlöcher für die Referenzelektroden und M1-Elektroden. Führen Sie die Elektrodenspitze mit einer feinen Pinzette und schieben Sie sie direkt unter den Schädelknochen in das Bohrloch.
  17. Fixieren Sie alle Epidural-Elektroden mit Zweikomponenten-Dental-Acryl. Achten Sie darauf, den Bregma-Punkt nicht zu decken und das gemeinsame STN / SNr-Loch nicht zu beeinträchtigen.
  18. Setzen Sie den vorbereiteten Halter mit dem Wolfram-Microwire-Elektrod einEs in den stereotaxischen Rahmen.
  19. Kalibrieren Sie die ventrale Elektrode, die auf das STN gerichtet ist, auf das Bregma. An die berechnete Position über dem gemeinsamen STN / SNr-Loch anpassen und die Elektroden unter mikroskopischem Anblick auf das Gehirn absenken. Stellen Sie sicher, dass die Wolfram-Mikrowellenelektroden reibungslos in das Gehirn gehen.

4. Elektrophysiologische Kartierung und Aufnahmen

HINWEIS: Für diesen Schritt ist ein Faraday-Käfig und ein mehrkanaliges elektrophysiologisches Aufzeichnungssystem mit Aufzeichnungssoftware erforderlich, das Online-Filterung und Online-Spike-Sortierung ermöglicht. Verwenden Sie vorzugsweise ein System, das mit einem Vorverstärker arbeitet, der in der Nähe des Kopfes der Tiere positioniert ist, um das elektrische Rauschen und die Artefakte auf ein absolutes Minimum zu halten. Neben den Wolfram-Microwire-Elektroden sind mindestens eine Epidural- und eine Referenzelektrode erforderlich, um Aufnahmen des hyperdirekten Weges durchzuführen. Es wird empfohlen, epidural und referenc einzufügenE Elektroden paarweise, ohne dass sie sich gegenseitig berühren, hilft dies bei Störungen und ermöglicht verschiedene Arten der Referenzierung in der Datenanalyse.

  1. Setzen Sie einen mobilen Faraday Käfig über den stereotaxischen Rahmen. Wenn nur ein stationärer Faraday-Käfig vorhanden ist, bewegen Sie den stereotaxischen Rahmen vorsichtig in den Faraday-Käfig, während sichergestellt wird, dass tiefe Hirnelektroden nicht in das Gehirn abgesenkt werden, bis der stereotaxische Rahmen in seiner endgültigen Position ist.
  2. Verbinden Sie die Elektroden mit der Kopfstufe des elektrophysiologischen Aufbaus. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektroden mit geeigneten Referenzkanälen verbunden sind.
  3. Richten Sie die Aufnahmesoftware ein: Bandpassfilter (0,05-8,000 Hz) und verstärken Sie (Verstärkung 1.500-2.000x) das Rohdatensignal. Verwenden Sie einen Online-LFP- und Spike-Filter mit entsprechenden Einstellungen (Bandpassfilter 0,05-250 Hz für LFPs, Bandpassfilter 300-8.000 Hz für MUA). Für alle Filter einen Butterworth-Filter verwenden.
  4. Richten Sie eine Spike-Schwelle, falls zutreffend, für onlin einE spike sortieren Die meisten Aufnahmesoftware ermöglicht die Einrichtung einer Spike-Schwelle, die ein Amplitudenwert ist, oberhalb dessen ein Signal als Spike durch die Software markiert wird. Diese Schwelle kann entweder mathematisch als Faktor oder Standardabweichung der mittleren Amplitude des gefilterten Spikesignals bestimmt werden oder kann vorzugsweise durch visuelle Inspektion von Datensegmenten <500 ms bestimmt und als Zeile über dem Signalrauschen grafisch aufgebaut werden Benutzer interface.
    HINWEIS: Die Absicht, eine Spike-Schwelle einzurichten, besteht darin, Spikes und Sortiereinheiten zu zählen, um darüber zu informieren, wie viele Neuronen gegenwärtig aufgezeichnet sind und wie ihre Spikes geformt werden.
  5. Langsam die Wolfram-Microwire-Elektroden auf 1 mm dorsal des Targets senken, was STN für hyperdirect-Weg ist. Warten Sie, bis sich das Signal bei Bedarf stabilisiert hat.
  6. Für die elektrophysiologische Kartierung die Elektroden ventral in Schritten von 100 μm vorschieben. Bei jedem Schritt das Ausfeuchtungsmuster auswertenAßen und form von spikes Vergleichen Sie diese mit den typischen Beispielen in Abbildung 2 . Häufig zeigen dichte Kerne schnell und kontinuierlich über mehrere dorsoventrale Schritte hinweg, während faserreiche Strukturen in nachfolgenden ventralen Schritten niedrige Brenngeschwindigkeiten und weniger homogene Spikeaktivitäten zeigen.
  7. Für den hyperdirekten Weg ist darauf zu achten, dass die ventrale Elektrode im Inneren des STN liegt.
    HINWEIS: Die STN wird erreicht, wenn ein erheblicher Anstieg der MUA ventral der Zona incerta festgestellt wird. Ventral zum STN, das Spiking stoppt fast vollständig, weil die Elektrode die interne Kapsel erreicht hat. Wenn die ventralste Elektrode in STN ist, sorgt die Konfiguration der Wolfram-Mikroelektroden für die hintere, zweite Elektrode in SNr. Dorsoventrale Feinabstimmung in kleinen Schritten könnte notwendig sein, um typische MUA in STN und SNr zur gleichen Zeit aufzuzeichnen. Beachten Sie, dass die Häufigkeit von MUA von der Anzahl der tatsächlich aufgenommenen Neuronen und auf dem ebenen Gehirn abhängtAktivierung.
  8. Sobald sich die Elektroden in den gewünschten Strukturen befinden, richten Sie Online-Filterung und Spikesortierung ein (siehe Abbildung 4 ) und starten dann die Aufzeichnung der Daten. Typische Beispiele für die verschiedenen kortikalen Synchronisationszustände, die in den LFP-Aufzeichnungen identifiziert werden können, sind in Abbildung 3 dargestellt .

5. Ende des Experiments

  1. Wenn Aufnahmen gemacht werden, heben Sie die Elektroden langsam aus dem Gehirn und spülen sie sofort mit physiologischer Kochsalzlösung aus. Die Elektroden können nach gründlicher Spülung und Sichtkontrolle wiederverwendet werden. Entladungs-Biegeelektroden
  2. Euthanisieren Sie die Tiere durch eine IP-Injektion einer Überdosierung von Urethan (2,5 g / kg Körpergewicht).
    HINWEIS: Urethan sollte nur für die endgültigen Verfahren verwendet werden.
  3. Wenn eine histologische Verifikation der Elektrodenposition oder anderer histologischer Färbeverfahren erforderlich ist, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und verarbeiten dasGewebe passend.
    HINWEIS: Abhängig von den beabsichtigten Färbemethoden kann eine transkardiale Perfusion notwendig sein. Für die Nachuntersuchung der Elektrodenposition genügt eine Standard-Nissl-Färbung in den meisten Fällen, um die Elektrodentrajektorie in zB koronalen Hirnabschnitten zu visualisieren. Weitere Ansätze zur Erleichterung der histologischen Zielverifizierung sind die Verwendung von elektrisch induzierten Läsionen an das Hirngewebe durch Anlegen eines elektrischen Stroms über die Aufzeichnungselektroden oder das Aufbringen von biokompatiblen Farbstoffen vor der Elektrodeneinführung 16 , 17 .

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Representative Results

Mit den hierin verwendeten Aufzeichnungselektroden ist es möglich, LFPs aus dem primären motorischen Kortex, dem subthalamischen Kern und den substantia nigra pars reticulata und MUA aus dem STN und SNr zu probieren. Anfänglich werden LFPs und Multi-Unit-Aktivitäten zusammen in einem Breitband-Signal aufgezeichnet. Danach werden LFPs und MUAs durch Bandpassfilter (0,05-250 Hz für LFPs und 300-4000 Hz für MUA) getrennt.

Für die korrekte Ausrichtung von subkortikalen Kernen, insbesondere von kleinen Strukturen wie dem STN, ist es vorteilhaft, die geplanten stereotaktischen Koordinaten mit dem online aufgezeichneten MUA-Signal auszurichten. Für die Elektrodenbahn, die auf die STN-Kennlinie ausgerichtet ist, kann das MUA-Muster aufgezeichnet werden ( Abbildung 2 ) 9 , 20 .

Für spätere Schritte der Analyse ist esOftmals obligatorisch, einzelne Einheiten aus der Multi-Unit-Aktivität nach prinzipieller Komponentenanalyse zu definieren ( Abbildung 4 ).

In den LFP-Aufnahmen aus dem M1 können zwei spontan abwechselnde kortikale Synchronisationszustände identifiziert werden: der aktivierte Zustand (AS) und der Zustand der Slow Wave Activity (SWA) ( Abbildung 3 ) 18 , 19 . Während der SWA-Zustand von langsamen Oszillationen mit hoher Amplitude von etwa 1 Hz dominiert wird, zeichnet sich das AS durch schnellere Schwingungen mit geringerer Amplitude aus ( Abbildung 3 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Aufbau der Deep Brain Microwire Elektroden in einem Standard Stereotaxic Holder. Beachten Sie die Spitzenabtrennung zwischen A, dem Elektrodenpaar für dieSTN und B, das Elektrodenpaar für die SNr in dorsoventraler Richtung von ca. 200 μm und anterioposteriorer Richtung von ca. 2 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Charakteristische Multi-Unit-Aktivität von einer Dorsoventralen Elektroden-Trajektorie Targeting der STN. ( A ) Multi-Unit-Aufnahmen des ventralen posteromedialen Thalamuskerns (VPM), der Zona incerta (ZI), des subthalamischen Kerns (STN) und der Substantia nigra pars reticularis (SNr). Die VPM zeigt spärliche und unregelmäßig beabstandete Hochamplitudenspitzen. Dieses Muster der Spikes hört auf, wenn man sich dem ZI nähert. Wenn die Elektrode in das STN ein typisches Hochfrequenz-Zündmuster mit kurzen Bursts mit mittlerer Amplitude eintrittUde kann beobachtet werden. Das SNr kann durch sein hohes Amplituden- und reguläres Zündmuster identifiziert werden. ( B) STN-Trajektorien, die auf Bilder von einem Ratten-stereotaktischen Atlas 21 überlagert sind. Oberteil: koronale Ebene. Unterteil: Sagittale Ebene. Beachten Sie das Übergeben der Elektrodenspitze durch VPM und ZI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Kortikale Synchronisationszustände in LFP-Aufnahmen aus dem primären motorischen Cortex während der Urethananästhesie. ( A ) Repräsentative 600 s LFP-Aufzeichnung der primären motorischen Kortex. Zeitperioden mit hoher Frequenz, niedrige Amplitudenaktivität entsprechend dem aktivierten Zustand (i) und Zeitperioden mit einem langsameren Rhythmus und hoch Er-Amplitude, die dem langsamen Wellenaktivitätszustand (ii) entspricht, kann differenziert werden. ( B ) Entsprechende Zeit-Frequenz-Kurve über ein Intervall von 600 s, die die 0-20 Hz relative Leistung der in (A) dargestellten LFPs darstellt. Warmer Färbungen zeigen eine höhere relative Leistung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Sortierung einzelner Einheiten aus STN Multi-Unit-Aktivität. ( A ) Dreidimensionale Ansicht von Geräteclustern im Merkmalraum nach der Hauptkomponentenanalyse Jeder Cluster repräsentiert eine mutmaßliche Einheit. ( B ) Spike-Wellenformen und Spike-Wellenform-Mittelwerte, die den Clustern in (A) entsprechen.0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Koordinaten von Bregma STN SNr M1 Referenz 1 Referenz 2
Anterior-posterior -3.6 -4,8 +3.0 -10,0 -10,0
Medial-lateral +2,5 +2,5 +3.0 +3.0 -3,0
Dorsal-ventral -8.0 n / a n / a n / a n / a

Tabelle 1: Stereotaxische Koordinaten für die Aufzeichnung der Hyperdirect CoRtico-basal Ganglia Pathway. Alle Punkte werden aus dem Bregma-Referenzpunkt am Schädel in mm gemessen; Na- nicht anwendbar

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Discussion

In der vorliegenden Studie wird die Methode gezeigt, wie man extrazelluläre elektrophysiologische Signale gleichzeitig von mehreren Standorten eines gegebenen Netzwerks unter Verwendung des Beispiels des hyperdirektigen Cortico-Basal-Ganglienpfades aufzeichnet, der das M1 mit dem STN und SNr in Nagetieren verbindet.

Ein kritischer Schritt bei der Aufzeichnung kleiner subkortikaler Strukturen wie der STN ist die präzise geführte Insertion der Aufzeichnungselektroden in das Target. In der vorgestellten Methode sorgt die Betreuung von zwei entscheidenden Schritten für eine hohe Genauigkeit des Targeting. Bei der Vorbereitung des Tieres in den stereotaktischen Apparat, bevor die Elektroden in das Gehirn eingeführt werden, ist es zwingend erforderlich, dass der Schädel in die "flache Schädel" -Position 22 gebracht wird . Um die flache Schädelposition zu erreichen, wird die Position des Schneidezahnstabes des stereotaktischen Rahmens bis zu den Höhen der Bregma- und Lambda-Referenzpunkte o geändertN der Schädel befindet sich auf der gleichen dorsoventralen Ebene 21 . Nur durch die Sicherstellung dieser Position können in stereotaktischen Atlanten gefundene Koordinaten mit hoher Präzision auf das jeweilige Labortier angewendet werden, da die Atlanten auf der flachen Schädelposition 21 basieren. Auch die experimentellen Beweise beweisen, dass die Zielgenauigkeit, die eine individualisierte flache Schädelposition verwendet, einer festen Verstellung der Schneidezange 23 überlegen ist. Die Position der Aufzeichnungselektroden in der dorsoventralen Ebene sollte durch die ständige Registrierung der Mehrfachaktivität fein abgestimmt werden. Die verschiedenen Kerne und weißen Stoffstrukturen entlang der Elektrodenbahn zeigen charakteristische Brandmuster ( Abbildung 2 ), mit denen die Position der Elektrode 9 , 20 nachjustiert werden kann.

Ein weiterer wichtiger Schritt in der vorgestellten Methode ist die Platzierung der rEwigkeitselektrode In dem vorgestellten Protokoll wurde eine Position oberhalb der Kleinhirnrinde gewählt, da an dieser Stelle die Referenzelektrode die Cortico-Basalganglien-Aktivität nicht erkennt, die der zentrale Punkt der Studie war. In Studien mit einem Interesse an Analysemethoden, die anfällig für Volumenleitung sind, sollte eine lokale Referenz bevorzugt werden 5 .

Urethan ist ein weit verbreitetes Anästhetikum für die Aufnahme von neuronalen extrazellulären Potentialen in der Tierforschung 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . Der Grund dafür ist, dass eine Einzeldosis von Urethan eine stabile und lang anhaltende Narkose für 8 - 12 h mit nur einer begrenzten Depression der Zentralnervensystemaktivität im Vergleich zu anderen Anästhetika erzeugen kann 27 . Allerdings, Urethan AnästhesieA aktiviert auch das sympathische Nervensystem, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie zB Hyperglykämie führen kann. Aufgrund seiner lang anhaltenden Wirkung und des Mangels an einer potenten Droge, um ihre anästhetische Wirkung zu bekämpfen, sollte Urethan nicht für wiederholte Experimente verwendet werden, die durch Stunden oder Tage getrennt sind. Wenn es geplant ist, mehrere Aufnahmesitzungen auf demselben Tier durchzuführen oder wenn es einen technischen Grund gibt, Urethan nicht zu verwenden, dann kann die Gasanästhesie mit Isofluran und Injektionen von Arzneimitteln wie Ketamin und Xylazin sinnvolle Alternativen für elektrophysiologische In-vivo- Experimente sein 28 , 29 Der Nachteil dieser Narkose-Regime ist, dass sie häufiger Überwachung und Anpassungen benötigen als die Verwendung von Urethan, wegen ihrer kurzen Halbwertszeit und der Akkumulation der Medikamente im Laufe der Zeit. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass Urethan weniger mit physiologischem B interferieren könnte Regenaktivität als andere Anästhetika 30 .

Alle hierin detaillierten Aufzeichnungsbedingungen bestimmen, wie die erhaltenen Daten weiter verarbeitet und offline analysiert werden können. Daher ist es zwingend erforderlich, alle Einstellungen an die Anforderungen der geplanten Analyseschritte anzupassen. Da es viele Möglichkeiten für die Analyse von Mehrkanal-extrazellulären Aufnahmen gibt, kann die Verwendung von verfügbaren Open-Source-Toolboxen vorteilhaft sein 31 .

Die Aufzeichnung von extrazellulären Potentialen in vivo ist eine Methode, die eine einzigartige zeitliche und räumliche Auflösung von Hirnsignalen bietet, die alternativen Methoden wie funktionelle Magnetresonanztomographie und Calciumbildgebung überlegen ist. Die vorgestellte Methode kann nicht nur auf die Aufzeichnung des hyperdirekten Weges angewendet werden, sondern kann leicht an eine Vielzahl anderer experimenteller Modelle und Forschungsfragen angepasst werdenF "> 24 , 32 , 33. Da es sich um eine stereotaktische Chirurgie handelt, gibt es viele Forschungsstufen, wo es nicht angewendet werden kann und wo eine nicht invasive Methode gewählt werden soll.

In Zukunft sollte eine Kombination der präsentierten extrazellulären Multi-Site-Aufzeichnungsmethode mit optogenetischen Werkzeugen realisiert werden, um unser Verständnis der Netzwerk-Dysfunktion, die verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen zugrunde liegt, weiter zu verbessern, um neue Behandlungen zu finden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, für die Finanzierung unserer Studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl custom epidural electrodes Goodfellow GmbH
D-61213 Bad Nauheim, Germany
info@goodfellow.com
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes
Stereotaxic holder with acrylic block David Kopf Instruments,
7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders
Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance Microprobes.com
18247-D Flower Hill Way  Gaithersburg, Maryland, 20879 USA
Product-ID WE3ST31.5A5-250um The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible.
Rat alignment tool David Kopf Instruments,
7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula
Two-component dental acrylic Associated Dental Products Ltd.
Kemdent Works, Purton, Swindon
Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based)
Faraday cage Self-construction A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh
Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities OmniPlex® Neural Data Acquisition System
Plexon Inc
6500 Greenville Avenue, Suite 700
Dallas, Texas 75206
USA
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community.

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