Laser Doppler: Een instrument voor het meten alvleesklier Islet microvasculaire Vasomotion In Vivo

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Alvleesklier islet microvasculaire vasomotion regelt islet bloed verspreiding en onderhoudt de fysiologische functie van β eilandjecellen. Dit protocol wordt beschreven met behulp van een laser Doppler-monitor om de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in vivo te bepalen en te beoordelen van de bijdragen van de alvleesklier islet microcirculatie alvleesklier-gerelateerde ziekten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Liu, M., Zhang, X., Li, B., Wang, B., Wu, Q., Shang, F., Li, A., Li, H., Xiu, R. Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo. J. Vis. Exp. (133), e56028, doi:10.3791/56028 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Als een functionele status van de microcirculatie is microvasculaire vasomotion belangrijk voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen en de verwijdering van kooldioxide en afvalproducten. De bijzondere waardevermindering van microvasculaire vasomotion misschien wel een cruciale stap in de ontwikkeling van de microcirculatie-gerelateerde ziekten. Daarnaast is het zeer gevacuoliseerd alvleesklier rotseilandje aangepast ter ondersteuning van de endocriene functie. In dit opzicht lijkt het mogelijk om te concluderen dat de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion invloed kan zijn op de functie van de alvleesklier eilandje. Analyseren van de pathologische veranderingen van de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion wellicht een haalbare strategie om te bepalen van bijdragen die alvleesklier islet microcirculatie maakt gerelateerde ziekten, zoals diabetes mellitus, Pancreatitis, enz. Dus, dit protocol wordt beschreven met behulp van een laser Doppler bloed stroom monitor om de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion te bepalen en vast te stellen parameters (waaronder gemiddelde bloedverspreiding, amplitude, frequentie en relatieve snelheid van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion) voor de evaluatie van de microcirculatory functionele status. In een streptozotocin-geïnduceerde diabetische muismodel vastgesteld we hebben een verminderde functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion. Kortom, kan deze aanpak voor de beoordeling van alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in vivo mechanismen met betrekking tot ziekten van de alvleesklier islet openbaren.

Introduction

Als een parameter van de functionele status van microcirculatie, microvasculaire vasomotion neemt verantwoordelijkheid voor de levering en uitwisseling van zuurstof, voedingsstoffen en hormonen en is van cruciaal belang voor de verwijdering van stofwisselingsproducten, zoals koolstofdioxide en afvalstoffen van de cel 1. microvasculaire vasomotion regelt ook bloed stroom distributie en weefsel perfusie, zulks afbreuk doet aan lokale microcirculatory bloeddruk en reacties op ontsteking, die oedeem in vele ziekten kan veroorzaken. Microvasculaire vasomotion is daarom uiterst belangrijk om de fysiologische functie van organen2,3,4, weefsels en cellen van de component. De bijzondere waardevermindering van microvasculaire vasomotion misschien wel één van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de microcirculatie-gerelateerde ziekten5.

Laser Doppler werd oorspronkelijk ontwikkeld voor observatie en kwantificering op het gebied van de microcirculatie onderzoek6. Deze techniek, samen met andere technische benaderingen (bijvoorbeeld laser spikkel7transkutane zuurstof, enz.), werd beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling van de bloedstroom in de microcirculatie. De grondgedachte dat de bloedverspreiding van lokale microcirculatie (dat wil zeggen, de haarvaten, arteriolen, venules, enz.) kan worden bepaald door apparaat uitgerust met laser Doppler, is gebaseerd op het beginsel van Doppler shift. De golflengte en frequentie van de gestimuleerde emissie licht gewijzigd als lichte deeltjes bewegende bloedcellen in microvessels ondervinden, of zij onveranderd blijven. Daarom in de microcirculatie zijn het nummer en de snelheid van bloedcellen de belangrijkste factoren met betrekking tot de omvang en de frequentieverdeling van het Doppler-verschoven licht, terwijl de richting van de microvasculaire bloedstroom niet relevant is. Met behulp van verschillende methoden, een verscheidenheid aan weefsels zijn gebruikt voor microcirculatory studies, inclusief de mesenteries en dorsale huidplooien kamers van muizen, ratten, hamsters, en zelfs mens8. Echter, in het huidige protocol, focussen we op de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion, die wordt geëvalueerd met behulp van laser Doppler en een zelfgemaakte beoordelingssysteem voor de parameter.

Alvleesklier islet microcirculatie bestaat voornamelijk uit de alvleesklier eilandje microvessels en onderscheidende kenmerken vertoont. Een alvleesklier islet capillaire netwerk toont een vijf-keer-hogere dichtheid dan de capillaire netwerk van haar exocrine tegenhanger9. Voorzien van een geleider voor de levering van input glucose en verspreiden insuline, leveren endotheel eilandjecellen zuurstof metabolisch actieve cellen in islet β-cellen. Bovendien, opkomende bewijs toont ook aan dat het eilandje microvessels gaat niet alleen bij het reguleren van insuline genexpressie en overleving van de β-cel, maar ook in het beïnvloeden van de functie van β-cel; bevordering van β-celproliferatie; en een aantal vasoactieve, angiogenic, stoffen en groeifactoren10produceren. Daarom in dit opzicht afleiden we dat de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion kan islet β-cel functie beïnvloeden en in de pathogenese van ziekten zoals acute/chronische pancreatitis, diabetes en andere meedoen alvleesklier-gerelateerde ziekten.

Analyseren van de pathologische veranderingen van de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion misschien wel een haalbare strategie om de bijdragen van de alvleesklier islet microcirculatie naar de hierboven vermelde ziekten. Een stapsgewijze procedure met een beschrijving van de aanpak om te bepalen alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in vivo bieden hier. Typische metingen worden vervolgens weergegeven in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Tot slot, de voordelen en beperkingen van de methode worden gemarkeerd in de discussie, samen met verdere toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende agentschappen. Dit protocol wordt gedemonstreerd werd uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van het Instituut van microcirculatie dier ethische Commissie (IMAEC) op de Peking Unie medische College (PUMC).

1. dieren

  1. Vóór het begin van het experiment, houden drie BALB/c muizen per kooi, met gecontroleerde temperatuur (24 ± 1 ° C) en luchtvochtigheid (55 ± 5%), onder een 12-h licht-donker cyclus. De muizen vrije toegang verlenen tot regelmatige voedsel en water.
  2. Willekeurig verdelen de muizen in een niet-diabetische controlegroep en een diabetische groep. Nauwkeurig wegen van elke individuele muis en bereken het geïnjecteerde volume met behulp van het lichaamsgewicht van elke muis.
  3. De muizen voor 4 uur vóór streptozotocin (STZ) injectie snel en regelmatig water als normale bieden over experimentele dag 1.
  4. 0,1 M Natriumcitraat buffer met een pH van 4.3 voor te bereiden. 1 mL van de oplossing in een 1.5-mL microcentrifuge buis gebracht en de microcentrifuge buis wikkel in aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling aan licht.
  5. Los de STZ in Natriumcitraat buffer (pH 4.3) om een eindconcentratie van de werken van 5 mg/mL vóór gebruik.
  6. Geven de muizen van de diabetische groep intraperitoneaal injecties van STZ bij een dosis van 40 mg/kg met een spuit van 1 mL en een 25-G naald. Injecteer de muizen van het besturingselement niet-diabetische met dezelfde hoeveelheid Natriumcitraat buffer (pH 4.3).
  7. De muizen terug te zetten in de kooien en hen te voorzien van regelmatige voedsel en water van 10% sucrose.
  8. Herhaal stap 1.3-1.7 op experimentele dagen 2 tot en met 5 (dat wil zeggen, de volgende 4 opeenvolgende dagen).
  9. De 10 gewichtspercenten sacharose water vervangen door regelmatig water na de laatste injectie van de STZ.
  10. Snel de muizen gedurende 6 uur, maar geef ze gratis toegang tot water, en hun bloedsuikerspiegel meten negen dagen later (experimentele dag 14). Het verzamelen van een bloedmonster uit de ader van de staart te bevestigen hyperglycemie met behulp van een bloed glucose monitoring systeem.
    Opmerking: Muizen met bloed glucose niveaus > 200 mg / dL worden beschouwd diabetische.

2. voorbereiding van het Instrument

  1. Reinig de optische oppervlakken van de sondepunt en sonde-connector van het apparaat laser Doppler met een zachte, niet-schurend doek te verwijderen van stof en deeltjes. Steek de kabel in de poort van het instrument (figuur 1A).
  2. Monteer de kalibratie-stand doordat de flux standaard in thermisch evenwicht met experimentele omgeving (kamertemperatuur, meestal gedurende 30 minuten). Schud de flux standaard zachtjes gedurende 10 s en laat het rusten gedurende 2 minuten.
  3. Plaats de container flux standaard in het midden van de kalibratie-base. Aanpassen van de klem tot de maximale hoogte en beveiligen van de sonde in de klem zodanig dat deze naar beneden naar de container wijst. Zorg dat de flux standaard onder de sonde correct gepositioneerd is.
  4. Langzaam verplaatsen de sonde omlaag totdat de tip is goed ondergedompeld in de flux-standaard Selecteren en druk op "kalibratie" op de laser Doppler apparatuur en kiest u het kanaal van de werken die de sonde op is aangesloten. Voer de kalibratieprogramma totdat een aankondiging van de "Kalibratie succesvol" wordt weergegeven op het scherm van laser Doppler apparatuur.
  5. Beveilig de sonde die met behulp van de houders van de sonde. Handmatig veilig de sonde om te vermijden verkeer.
  6. Het handhaven van de laboratoriumruimte bij constante temperatuur (24 ± 1 ° C) en luchtvochtigheid (~ 50-60%).
  7. Geen externe licht (zoals fluorescerende en spot lampen) uitschakelen voordat u het experiment om te voorkomen dat externe licht-geïnduceerde verandering uitvoert.

3. voorbereiding van de dieren

  1. Autoclaaf de chirurgische instrumenten en laten afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
  2. Geven de muizen 10 min om te acclimatiseren aan de experimentele omgeving voor het opsporen van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion door laser Doppler.
  3. Vul een spuit van 1 mL met 1 mL 3% pentobarbital natrium. Injecteer de pentobarbital natrium oplossing (75 mg/kg i.p.) anesthetize van de muizen.
  4. Betrekking hebben op de ogen van de muis met vooraf bevochtigd medische gaas om te voorkomen dat droogte.
  5. Zorg ervoor dat de muis volledig bewustzijn verliest en niet langer reageert op de staart of achtervoet met een tang wringt. Toezicht op de narcose gedurende het gehele verdoving en intraoperatieve evenement elke 15 min. handhaven de narcose door aanvulling met 10% van de eerste injectie hoeveelheid de pentobarbital oplossing wanneer nodig.
  6. Plaats een verwarming pad met een semi-isolerende laag onder het dier en plaats het dier in liggende positie en het overbrengen van de werkplek van de laser Doppler apparatuur. De muis naar het werkplatform met chirurgische tape vast.
  7. Doekje de buikhuid van de muis met betadine, waarna 75% ethanol wordt gebruikt om de buikstreek schone wisser.
  8. 2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) mengsel subcutaan injecteren.  Knip een ~ 3 cm-diameter gat in het midden van een spons van gaas. Dekking van de abdominale regio met de spons van gaas.
  9. Til de buikhuid met een tang en maken een eerste verticale insnijding langs de middellijn van de buik met behulp van een scalpel of huid schaar.
  10. Pak de onderliggende spier met een tang en incise voor het invoeren van de buikholte. Niet verwonden de organen. Vouw de huid en onderliggende spieren over de borst te onthullen van de buikholte. Zachtjes bloot de alvleesklier lichaam en de milt met behulp van een paar blunt-nosed tang.

4. data-acquisitie voor analyse

  1. Stormloop naar de software van de laser Doppler apparatuur door te klikken op "Bestand" → "New" om een nieuwe meting-bestand te maken. Configureren van de aangesloten monitoren, onder het tabblad "Algemeen", stelt de follow-up duur "Gratis uitgevoerd." Gebruik de standaardinstelling voor de "LDF Monitor" tab. Klik op "Volgende".
  2. Instellen van de grafiekweergave in "weergave in het dialoogvenster instelling." Selecteer de "Flux, Conc, snelheid" kanalen door het controleren van de respectieve vakken. Selecteer de volgende parameters: 'Data source voor het kanaal' en 'Label, eenheden en kleur. Klik op "Next."
  3. Gebruikersinformatie over het onderwerp en de meting (dat wil zeggen, naam en onderwerp nummer, operator, toezicht op tijd, opmerkingen, etc.) invullen "informatie in het dialoogvenster bestand" en klik op "Next" om te voltooien de meetconfiguratie.
    Opmerking: Een meting venster wordt automatisch gemaakt door de software (figuur 1B).
  4. Handmatig vooraf de elektrode aan de alvleesklier. Zorg ervoor dat de afstand tussen de sonde en alvleesklier weefsels binnen 1 mm. Een ongepaste afstand geeft een kunstmatig verhoogd of verminderde bloed stroom lezing.
  5. Klik op het pictogram van de werkbalk "Start" te beginnen met opnemen van de gegevens van bloed microvasculaire perfusie eenheden (PU). Het verzamelen van de gegevens van de PU voortdurend voor 1 min elke run. Klik op 'Stop' als u wilt stoppen van de meting. Selecteer "Bestand" → "Opslaan als" om de naam en sla het bestand klaar meting.
  6. Handmatig verplaatsen de sonde na elke run om additieve effecten en de gelokaliseerde uitputting van contractiele te voorkomen en ontspanning capaciteit. Herhaal stap 4.1-4.4 om te oogsten Multi-Point (dat wil zeggen, drie willekeurig gekozen punten uit de alvleesklier weefsel) microvasculaire PU gegevens voor elke muis. Meten van de PU-gegevens van een niet-reflecterende plaat als een controle van de basislijn.
  7. Sluit de buikspier-laag en de huidlaag met een hechtdraad. Plaats de dieren in schone kooien achter de experimenten.
  8. Houd het dier warm door het plaatsen van de kooi herstel half-op de verwarming pad.
    Opmerking: Let op warmte, hygiëne, vloeistof en voedselinname en infectie. Muizen met 2 mg/kg gedurende 48 uur Carprofen als postoperatieve pijn management beheren.  Euthanasie uitvoeren door het injecteren van 150 mg/kg natrium pentobarbital i.p. Wanneer muizen worden waargenomen te zijn in een staat van ernstige pijn of leed dat niet kan worden verlicht.

5. berekening van de Parameters van de microvasculaire Vasomotion

  1. De opdracht "Uitvoer" van de laser Doppler software de tijd en PU onbewerkte gegevens exporteren als een *.xlsx bestand en open het bestand in een werkblad.
  2. Berekenen van de gemiddelde basislijn perfusie unit (PUb) (zie stap 4.6).
  3. De gemiddelde bloedverspreiding (PUeen) voor 1 min van een meting als volgt berekenen: gemiddelde bloedverspreiding (PUeen) = PU - PUb (vergelijking 1).
  4. Bereken de frequentie (cycli/min) voor elke 1 min van meting.
    Opmerking: De frequentie van de microvasculaire vasomotion wordt gedefinieerd als het aantal pieken die hebben plaatsgevonden in een golf microvasculaire vasomotion per minuut.
  5. Bereken de amplitude (ΔPU) voor elke 1 min van meting.
    1. De amplitude van de microvasculaire vasomotion berekenen als het verschil tussen het maximum (PUmax) en de minimum (PUmin): Amplitude (ΔPU) = PUmax - PUmin (vergelijking 2).
  6. Bereken de relatieve snelheid (PU) voor elke 1 min van meting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een foto van de microvasculaire vasomotion meting laser Doppler apparatuur uitgerust met een halfgeleider-laserdiode wordt weergegeven in figuur 1A. De software van de interface van de gebruiker wordt weergegeven in figuur 1B. Met behulp van de methode die hierboven vermeld, werden de hemodynamische parameters van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion voor zowel niet-diabetische controle en diabetesmuizen ontdekt. Een aantal technieken, waaronder laser Doppler flowmetrie, weerspiegeld verstrooid licht, infrarood spectroscopie en beeldvormende technieken, zijn gebruikt om het microvasculaire vasomotion bestuderen aangezien het eerst werd gedefinieerd. Tabel 1 geeft een overzicht van onderzoeksgroepen en gepubliceerde artikelen die laser Doppler technologie gebruiken om te bepalen van de rol van de microcirculatie in diabetes en daarmee samenhangende ziekten.

In het algemeen, worden de microcirculatory voorwaarden van de alvleesklier islet vertegenwoordigd door de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion met de microvasculaire parameters, met inbegrip van gemiddelde bloedverspreiding amplitude, frequentie, relatieve snelheid (Figuur 2). Schematisch diagram van de representatieve microvasculaire vasomotion bestaat voornamelijk uit periodieke contractie en ontspanning fasen (figuur 2A). De hemodynamische verschijnselen presenteren een patroon van bloedverspreiding stroom in microvasculaire netwerken. PU gegevens verzameld door laser Doppler apparatuur werkten aan grafiek scatter diagrammen en het patroon van de distributie van microvasculaire bloedverspreiding Toon. In het huidige protocol waren de distributiepatronen van alvleesklier islet microvasculaire bloedverspreiding bij niet-diabetische en diabetische muizen totaal verschillend (figuur 2B). Een lagere schaal van bloedverspreiding van alvleesklier islet microvasculaire vasomotion werd waargenomen in diabetesmuizen ten opzichte van de niet-diabetische controle. Het ritme van contracties en versoepeling van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion was chaotisch en onregelmatige in STZ-geïnduceerde diabetesmuizen, terwijl niet-diabetische controles had ritmische oscillaties (figuur 2C en figuur 2D). Wij de gegevens van de 5-s van alvleesklier islet microvasculaire bloedverspreiding binnen de stippellijnen in figuur 2C en figuur 2D uitgepakt en aangetoond dat de chaotische fluctuaties van de alvleesklier islet microvasculaire perfusie in diabetesmuizen bloed zoekgeraakt naar de vermogen voor het regelen van de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion, die in reactie plaatsvindt op de bloed glucose fluctuation (figuur 2E).

Bovendien moeten alvleesklier eilandjes om te reageren op hyperglycemie, sufficient en biorhythmic flow-bloedverspreiding voor het vervoer van insuline. De alvleesklier islet microvasculaire vasomotion parameters (waaronder gemiddelde bloedverspreiding, amplitude en frequentie relatieve snelheid) werden vervolgens berekend en kwantitatief geanalyseerd op basis van de PU-profielen. Zoals blijkt uit Figuur 3, vergeleken met niet-diabetische besturingselementen, was de gemiddelde bloedverspreiding van de alvleesklier islet microcirculatie daalde in STZ-geïnduceerde diabetesmuizen (figuur 3A). Ondertussen waren er significant dalingen in de amplitude (figuur 3B) en frequentie (Figuur 3 c) van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in STZ-geïnduceerde diabetesmuizen hebt genoteerd. De relatieve snelheid van alvleesklier islet bloedverspreiding sterk gedaald in de STZ veroorzaakte diabetici groep in vergelijking met de niet-diabetische controle (figuur 3D). Zoals hierboven vermeld, was de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion verminderde in diabetesmuizen. Wij speculeren dat ritme afwijkingen, samen met een verminderde frequentie, de amplitude, en de relatieve snelheid van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion, kunnen resulteren in een deficiency van microvasculaire bloedverspreiding, die kan beschadigen eilandjecellen β en verminderen insuline secretie.

Figure 1
Figuur 1. Apparaat gebruikt om te bepalen alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in vivo. A. foto van de meting apparaat gebruikt om te bepalen van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion van muizen. De sonde contactdozen en laser tuimelschakelaar zijn in het linker paneel. De vloeibare kristalvertoning is in het middelste deelvenster. Menuknoppen (dat wil zeggen, omhoog, omlaag, en voer knoppen) en de power light - emitting diode zijn in het rechter paneel. De randapparaten (bijvoorbeeld computers en kabels) worden niet weergegeven. B. Screenshot ter illustratie van de typische elementen en grafiek kanalen van de laser Doppler apparaat software. "Flux," "Conc," "DC," en "Snelheid" meting lezingen worden weergegeven in de grafiek kanalen. "Flux" vertegenwoordigt weefsel microvasculaire bloedverspreiding, "Conc" vertegenwoordigt het weefsel microvasculaire bloedcel concentratie "DC" vertegenwoordigt de gemiddelde intensiteit van reflecterend licht en "Speed" vertegenwoordigt de relatieve snelheid van de microvasculaire bloedstroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in muizen. De bloedverspreiding van alvleesklier islet microvasculaire vasomotion werd beoordeeld door een laser Doppler apparatuur, en de functionele status werd geanalyseerd. A. schema van parameters met betrekking tot microvasculaire vasomotion. AC vertegenwoordigt de amplitude van een contractie microvasculaire vasomotion, Ar vertegenwoordigt de amplitude van een versoepeling van de microvasculaire vasomotion Tc Hiermee geeft u de lengte van de tijd van een microvasculaire vasomotion contractie en Tr Hiermee geeft u de lengte van de tijd van een microvasculaire vasomotion ontspanning. B. distributie patroon van alvleesklier islet microvasculaire bloedverspreiding bij niet-diabetische en diabetische muizen. Rode stippen: niet-diabetische muizen. Blauwe stippen: diabetesmuizen. De groene stippellijn geeft de afbakening tussen het bloed van niet-diabetische en diabetische microvasculaire perfusie patroon. C. de microvasculaire vasomotion alvleesklier eilandje in de controlegroep werd beoordeeld op basis van de dynamische microvasculaire perfusie van de bloed-flow. D. de microvasculaire vasomotion alvleesklier eilandje in de diabetesmuizen werd beoordeeld op basis van de dynamische microvasculaire perfusie van het bloed flow. E. Diagram van vertegenwoordiger (5-s-gamma) alvleesklier islet microvasculaire vasomotion tussen de niet-diabetische controle en diabetesmuizen. Rode lijn: niet-diabetische controle. Blauwe lijn: diabetesmuizen. PU: perfusie eenheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Quantification van de parameters van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion. Alvleesklier islet microvasculaire vasomotion parameters, met inbegrip van gemiddelde bloedverspreiding, amplitude en frequentie relatieve snelheid werden geanalyseerd en vergeleken tussen niet-diabetische controle en diabetesmuizen. A. Quantification van de gemiddelde bloedverspreiding (PU/min) van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion bij niet-diabetische en diabetische muizen. De B. amplitude (ΔPU), C. frequentie (cycli/min) en D. relatieve snelheid (PU) van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion daalden in diabetesmuizen dan bij niet-diabetische controle muizen. De amplitude van de microvasculaire vasomotion werd berekend als het verschil tussen het maximum (PUmax) en de minimum (PUmin). De frequentie van de microvasculaire vasomotion werd gedefinieerd als het aantal pieken of dalen die hebben plaatsgevonden in een golf microvasculaire vasomotion per minuut. De gegevens werden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD (n = 6 in elke groep). P < 0,05, **P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Ziekten Object Apparaat Refs nr.
Endotheel functie H LDF, LSCI 11, 12, enz.
DN H, R LDF 13, 14, 15, enz.
DR H LDF 16, 17, 18, enz.
Huid/cutane microcirculatie H LDF 11, 19, 20, enz.
Cardiale microcirculatie R LDF 21
Slechthorendheid M LDF 22
DN, diabetische neuropathie. DR, diabetische retinopathie. LDF, laser Doppler flowmetrie.
LSCI, laser speckle contrast imaging. R, rat. H, mens, M, muis.

Tabel 1. De rol van de microcirculatie in diabetes en zijn complicaties. Onderzoeksgroepen hebben laser Doppler gebruikt om te bepalen van de rol van de microcirculatie in diabetes en de complicaties voor decennia. Verwante artikelen in de afgelopen jaren worden hier opgesomd. Deze gepubliceerde artikelen zich vooral richten op het endotheel disfunctie, diabetische neuropathie (DN), diabetische retinopathie (DR), huid en cutane microvasculaire waardevermindering en relatief zeldzame complicaties, zoals cardiale microcirculatie dysfunctie en gehoor bijzondere waardevermindering. DN: diabetische neuropathie. DR: diabetische retinopathie. LDF: laser Doppler flowmetrie. LSCI: laser spikkel contrast imaging. R: de rat. H: menselijke. M: muis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de gevallen waarbij microvasculaire dysfunctie (bijvoorbeeld diabetes, acute pancreatitis, perifere microvasculaire ziekten, enz.), leiden bepaalde ziekten tot verminderde doorbloeding. Dan veranderingen in de bloedstroom zijn er belangrijke indicatoren, zoals microvasculaire vasomotion, die een afspiegeling van de functionele status van de microcirculatie. De specifieke indicator, microvasculaire vasomotion, wordt meestal gedefinieerd als de trilling van de microvasculaire Toon in microvasculaire bedden. In het huidige protocol zorgt een microvasculaire bloedverspreiding monitoring systeem voor de directe visualisatie en de kwantitatieve analyse van de functionele status van microvasculaire vasomotion. Onze benadering van microcirculatory evaluatie kan door het identificeren van dynamische veranderingen in bloedverspreiding selectief worden toegepast op de gerichte weefsels en organen. Verslagen gepubliceerd door andere fracties over het gebruik van laser Doppler voor het bepalen van de rol van microvasculaire bloedverspreiding in diabetes en zijn complicaties werden samengevat in tabel 1. In de huidige studie, om aan te tonen van onze aanpak, werd de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion van diabetesmuizen geëvalueerd.

Microvasculaire vasomotion is erkend als een parameter van de functionele status van microcirculatie en is geschikt voor het reguleren van bloedverspreiding stroom door het aanpassen van de distributie in de lokale weefsel23. De microvasculature van de alvleesklier, die kan worden verdeeld in eilandjes, acini en leidingen, is bestudeerd voor decennia. Kortom, deze scheiding van de alvleesklier in verschillende delen is voor gemak, alleen omdat de microvasculature eigenlijk onderling verbonden en homogeen als een biologische entiteit24. Dit microvasculature-netwerk ondersteunt de regulering van de alvleesklier islet bloedstroom. Vandaar, wij gewend parameters van de functionele status, bepaald door laser Doppler, alvleesklier islet microvasculature vasomotion vertegenwoordigen. Echter vanwege de kenmerken van de alvleesklier het platform, we nog steeds niet om een beslissing na het toepassen van de huidige methode om na te gaan of de bloedverspreiding is afgeleid van het endocriene deel of van het exocrine deel van de alvleesklier. Met behulp van islet-specifieke etikettering van kleurstoffen, zoals dithizone en neutraalrood, kan uitgegroeid tot een van de mogelijke manieren om het begrijpen van deze kwestie, ten minste tot op zekere hoogte.

Een belangrijk aspect van de meting stap is de afstand tussen de sonde en het weefsel van de alvleesklier. Een ongepaste afstand geeft een kunstmatig verhoogde bloedtoevoer lezen. De fysieke kracht die naar de weefsel- en orgaanbanken door een sondepunt zal microvasculaire bloedstroom verminderen. Minimale druk moet dus worden toegepast bij het nemen van metingen. Een ander punt om op te merken is de kracht van lasers. High-Power lasers in het algemeen verwonden gemakkelijk microvessels in de alvleesklier islet, dus de frequentie van de laserstraal worden gecontroleerd moet, binnen de beperkingen. Voor algemene en temporele metingen, een frequentie van 1 Hz of minder verdient. Om te voorkomen dat de gelokaliseerde uitputting van microvasculaire vasomotion capaciteit (inclusief contractiele en ontspanning) en het additieve effect, worden multipoint vastberadenheid en herpositionering van de site na elke meting voorgesteld in alle experimenten.

In de huidige methode, worden de PU-gegevens gebruikt voor de flux van bloed van de microvasculaire bloedstroom. Vanwege de kenmerken van de microvasculaire bloedstroom in de microcirculatie is het niet haalbaar om de absolute stroom eenheden (bijvoorbeeld mL/min/100 g specifieke organen of weefsels). Daarom is het beoordelingssysteem voor de parameter gebruikt hier is gebaseerd op de relatieve bloed stroom perfusie eenheden. Wavelet-analyse, snelle Fourier-transformatie en andere spectrale analyse-algoritmen zijn gemeenschappelijke methoden die laser Doppler-signalen voeren. In het huidige protocol, wij een aanpak die gebruikmaakt van hemodynamische parameters (dat wil zeggen, bloedverspreiding amplitude, frequentie en relatieve snelheid) zodat de functionele status van microvasculaire vasomotion opgericht. Bovendien, de nauwkeurigheid van de meting is gerelateerd aan de diepte van de doelgroep en het ontwerp van de sonde, die over het algemeen ongeveer 1 mm. Dus kunnen dikker of compacte organen en weefsels niet dienstig voor de toepassing van laser Doppler en voor de huidige methode. Bovendien, omdat de gegevens afgeleid van bloedverspreiding stroom kan worden beïnvloed door andere omstandigheden waardoor merkbare veranderingen, met inbegrip van temperatuur, vochtigheid, externe licht en wijzigingen in de positie van de muizen, moeten sommige regels gehoorzaamd worden tijdens de experimentele procedure. Het laboratorium moet handhaven constante temperatuur en vochtigheid, en externe verlichting moet worden afgeschermd. Het wordt aanbevolen om de muizen om te voorkomen dat wijzigingen in de positie vast te stellen. Het is van mening dat deze strategieën van de beperkingen overwinnen kunnen hierboven vermeld en de nauwkeurigheid van bloed stroom perfusie gegevens zal toenemen.

Het voordeel van het huidige protocol vergelijken met anderen gemeld in de literatuur is dat gevoelige en inspelen op de lokale microvasculaire vasomotion van weefsels en organen juist. Dit vergemakkelijkt de bredere toepassing van de methode voor de beoordeling of het onderzoek van de microcirculatie, met name de functionele status van microvasculaire vasomotion, in zowel laboratorial als klinische onderzoek. De toepassingen omvatten maar zijn niet beperkt tot: ischemie visualisatie, bloed perfusie beoordeling en de evaluatie van de functionele status van microvasculaire vasomotion. Kortom, onze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken en evalueren van de functionele status van de alvleesklier islet microvasculaire vasomotion in muizen in vivo en mogelijk kunnen inspelen op de klinische noodzaak te beoordelen van de microcirculatie functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Peking Unie medische College Jeugd Fonds en de fundamentele middelen voor onderzoek voor de centrale universiteiten (Grant nr. 3332015200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoorVMS-LDF2 Moor Instruments GI80 PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software Moor Instruments GI80-1 Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration base Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration flux standard Moor Instruments GI-cal Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer Johnson and Johnson #1955685 Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips Johnson and Johnson #1297006 Confirm hyperglycemia
Streptozotocin Sigma-Aldrich S0130 Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P3761 Working concentration 3 %
Ethanol Sinopharm Inc. 200121 Working concentration 75 %
Sucrose Amresco 335 Working concentration 10 %
Medical gauze China Health Materials Co. S-7112 Surgical
Blunt-nose forceps Shang Hai Surgical Instruments Inc. N-551 Surgical
Surgical tapes 3M Company 3664CU Surgical
Gauze sponge Fu Kang Sen Medical Device CO. BB5447 Surgical
Scalpel Yu Lin Surgical Instruments Inc. 175C Surgical
Skin scissor Carent 255-17 Surgical
Suture Ning Bo Surgical Instruments Inc. 3325-77 Surgical
Syringe and 25-G needle MISAWA Inc. 3731-2011 Scale: 1 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144, (5), 605-616 (2005).
  2. Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50, (1), 204-211 (2007).
  3. Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12, (6), 781-787 (2014).
  4. Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586, (14), 3301 (2008).
  5. De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19, (1), 5-18 (2012).
  6. Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27, (10), 597-604 (1980).
  7. Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13, (1), 1-9 (2016).
  8. Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16, (1), 11-22 (2017).
  9. Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181, (1), 77-84 (1986).
  10. Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19, (3), 498-511 (2014).
  11. de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16, (1), 23-31 (2016).
  12. Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60, (3), 659-666 (2013).
  13. Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23, (1), 44-52 (2016).
  14. Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10, (3), 270-276 (2013).
  15. Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34, (3), 180-188 (2013).
  16. Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23, (6), 447-455 (2016).
  17. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25-33 (2016).
  18. Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8, (2), 356-361 (2014).
  19. Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31, (1), 1-8 (2016).
  20. Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61, (3), 439-444 (2015).
  21. Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101, (3), 301-308 (2014).
  22. Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, (11), 2980-2986 (2012).
  23. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, (4-5), 403-438 (2007).
  24. Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113, (5), 748-755 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics