Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Dit protocol beschrijft gestabiliseerde en repetitieve cellulaire in vivo beeldvorming van de alvleesklier met een nieuw pancreas intravital imaging venster. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om bewegingsloze, driedimensionale beeldvorming uit te voeren met resolutie tot het cellulaire niveau gedurende drie weken in de alvleesklier van een levende muis. Begin met het voorbereiden van het operatieplatform en het desinfecteren van de oppervlakken met 70% ethanol.

Gebruik na anesthesie een rectale sonde met een homeothermisch geregeld verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te controleren. Verwijder het haar van de linkerflank van de muis en breng alcohol en jodium aan, draai van de incisieplaats naar het buitenoppervlak, ga nooit meer terug naar de incisieplaats en eindig met jodium. Maak vervolgens een incisie van 1,5 centimeter op de linkerflank van de muis, waarbij de huid en de spier worden ontleed.

Gebruik een zwarte of nylon 4-0 hechtdraad om een ringkoord hechtdraad in de incisiemarge uit te voeren. Trek de milt voorzichtig met ringdarm en identificeer de alvleesklier. Plaats het raam op de flank van de muis, passeer de milt en de alvleesklier door de open ruimte van het raam.

Plaats vervolgens voorzichtig de alvleesklier op de plaat van het beeldvenster terwijl u de milt op de open ruimte van het venster plaatst. Injecteer PANC-1 nuclite rood rechtstreeks in de alvleesklier. Gebruik een katheternaald met 31 gauge om druppels n-Butylcyanoacrylaatlijm op de rand van het beeldvenster aan te brengen, zodat er een minimale hoeveelheid lijm wordt aangebracht.

Breng voorzichtig een 12 millimeter rond afdekglas aan op de rand van het beeldvenster. Houd vervolgens de hechtlus vast om in de laterale groef van het raam te passen en bind deze drie keer vast. Ten slotte, om de onderbreking van deze strakke hechtingen te voorkomen wanneer de muizen wakker zijn, snijdt u de maximale proximale plaats van de stropdas.

Begin met het inschakelen van de intravital microscoop, inclusief het laservermogen. Om een vasculaire katheter in te brengen, oefent u druk uit op de proximale kant van de staart met de wijs- en derde vinger. Verwarm indien nodig de staart met een lamp.

Desinfecteer de staartader met een 70% ethanolspray, steek vervolgens een katheter van 30 gauge in de laterale staartader en visualiseer de regurgitatie van bloed in de PE-10-buis. Breng zijden tape aan op de katheter om deze te stabiliseren. Injecteer FITC dextran en TMR dextran, of andere fluorescerende sondes, indien van toepassing, volgens de combinatie van fluorescentiesondes.

Plaats een rectale sonde om de lichaamstemperatuur automatisch te regelen met een homeothermisch verwarmingskussensysteem. Plaats vervolgens het pancreasbeeldvormingsvenster dat tijdens de intravitale microscopie-opstelling is voorbereid in de vensterhouder. Breng de muis over van het operatieplatform naar de beeldvormingsfase.

Om intravitale beeldvorming uit te voeren, begint u met het weergeven van de alvleesklier bij een lage vergroting, zoals vier keer, om het hele beeld van de alvleesklier in het pancreasbeeldvenster te scannen. Zodra het interessegebied is bepaald, schakelt u over naar een lens met een hogere vergrotingsdoelstelling, zoals 20 keer of 40 keer, om beeldvorming op cellulair niveau uit te voeren met een laterale en axiale resolutie van respectievelijk ongeveer 0,5 micrometer en 3 micrometer. Voer Z-stack- of timelapse-beeldvorming uit om de 3D-structuur of dynamiek op cellulair niveau, zoals celmigratie, te observeren.

Intravitale microscopie in combinatie met het pancreas intravital imaging venster biedt op lange termijn weefselstabiliteit die het mogelijk maakt om beeldvorming met hoge resolutie te verkrijgen om individuele eilandjes gedurende maximaal drie weken te volgen. Het venster geïmplanteerd in een C57 zwarte 6 N muis met intraveneus geïnjecteerd anti-CD31 anti-CD31 antilichaam, geconjugeerd met een Alexa 647 fluorofoor, vergemakkelijkte beeldvorming in het hele gebied en verhoogde 3D-beeldvorming van de alvleesklier. Acinaire cellen werden geïdentificeerd in de gemiddelde beelden van pancreasweefsel in het aangrenzende vasculatuur, gevisualiseerd met respectievelijk autofluorescentie en anti-CD31-antilichamen.

Met behulp van de mozaïekbeeldvormingsmethode, die een breedbeeldbeeld combineert met beeldvorming met hoge resolutie, werden ongeveer 40 tot 50 eilandjes met de aangrenzende vasculatuur gevisualiseerd in een MIP-GFP-muis. Een eerdere studie toonde aan dat eilandjes tot drie weken kunnen worden gevolgd met behulp van deze stabiele beeldvormingsmethode. Om kankercellen te visualiseren, werden PANC-1 nuclite rode cellen tijdens de operatie direct in de alvleesklier van de muis geïmplanteerd en werden nabijgelegen vaten gekleurd met anti-CD31 geconjugeerd met Alexa 647.

Met behulp van dit protocol werden wide-field beelden van alvleesklierkanker gegenereerd. Dit hielp de marge van de tumor af te baken en 3D-beelden met hoge resolutie op het niveau van één cel te bereiken. De meest kritieke stap in deze methode is de bekwame implantatie van het pancreasbeeldvormingsvenster in de muis.

Met behulp van andere combinaties van de fluorescerende muiscellen en antilichaamsondes kon dynamische interactie van nabijgelegen cellen met eilandjes of annuleercellen worden geïdentificeerd. Deze methode kan op grote schaal worden toegepast door degenen die de verandering van het eilandje onderzoeken in verschillende pathofysiologische aandoeningen en micro-omgevingen van de alvleesklierkanker in situ.