Screening af bioaktive nanopartikler i phagocytiske immunceller til inhibitorer af Toll-lignende Receptor Signalering

Medicine
 

Summary

Toll-lignende receptor (TLR) signalering spiller en vigtig rolle i patofysiologien af ​​mange humane inflammatoriske sygdomme, og regulering af TLR-responser af bioaktive nanopartikler forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande. THP-1-cellebaserede reporterceller tilvejebringer en alsidig og robust screeningsplatform til identifikation af nye inhibitorer af TLR-signalering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Farmakologisk regulering af Toll-lignende receptor (TLR) reaktioner har stort løfte i behandlingen af ​​mange inflammatoriske sygdomme. Der har imidlertid været begrænsede forbindelser hidtil til at dæmpe TLR-signalering, og der har ikke været klinisk godkendte TLR-hæmmere (undtagen det anti-malariale lægemiddelhydroxychloroquin) i klinisk anvendelse. I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanoteknologi kan manipulation af immunrespons ved hjælp af nanoapparater give en ny strategi til behandling af disse sygdomme. Her præsenterer vi en high-throughput screeningsmetode til hurtigt at identificere nye bioaktive nanopartikler, der hæmmer TLR-signalering i fagocytiske immunceller. Denne screeningsplatform er bygget på THP-1-cellebaserede reporterceller med kolorimetriske og luciferaseanalyser. Reportercellerne er konstrueret fra den humane THP-1 monocytiske cellelinie ved stabil integration af to inducerbare reporterkonstruktioner. Den ene udtrykker et udskilt embryonalt alkalisk phosphatase (SEAP) genUnder kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og AP-1, og den anden udtrykker et udskilt luciferase-reportergen under styring af promotorer inducerbare af interferonregulatoriske faktorer (IRF'er). På grund af TLR-stimulering aktiverer reportercellerne Transkriptionsfaktorer og producerer efterfølgende SEAP og / eller luciferase, som kan detekteres under anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser. Ved anvendelse af et bibliotek af hybrider af peptid-guld nanopartikel (GNP), der blev etableret i vores tidligere undersøgelser som eksempel, identificerede vi en peptid-GNP-hybrid, som effektivt kunne hæmme de to arme af TLR4-signaleringskaskade udløst af dets prototypiske ligand, lipopolysaccharid (LPS). Resultaterne blev valideret ved standard biokemiske teknikker, herunder immunoblotting. Yderligere analyse fastslog, at denne bly hybrid havde et bredt inhibitorisk spektrum, der virker på flere TLR-veje, herunder TLR2, 3, 4 og 5. Denne eksperimentelle tilgang gør det muligt hurtigt at vurdere hvemRa nanopartikel (eller andre terapeutiske forbindelser) kan modulere specifik TLR-signalering i fagocytiske immunceller.

Introduction

Toll-lignende receptorer (TLR'er) er et af hovedelementerne i det medfødte immunsystem, der bidrager til den første forsvarslinje mod infektioner. TLR'er er ansvarlige for at registrere invaderende patogener ved at genkende et repertoire af patogenassocierede molekylære mønstre (eller PAMP'er) og montering af forsvarsreaktioner gennem en kaskade af signaltransduktion 1 , 2 . Der er identificeret 10 menneskelige TLR'er; Bortset fra TLR10, for hvilken liganden (e) forbliver uklare, kan hver TLR genkende en særskilt konserveret gruppe af PAMP'er. For eksempel kan TLR2 og TLR4, primært placeret på celleoverfladen, detektere lipoproteiner og glycolipider fra henholdsvis Gram-positiv og Gram-negativ bakterier; Mens TLR3, TLR7 / 8 og TLR9, der hovedsagelig er til stede i endosomale rum, kan mærke RNA og DNA-produkter fra virus og bakterier 3 . Når stimuleret af PAMP'er udløser TLR'er væsentlige immunresponser ved at frigive pro-infLammatoriske mediatorer, rekrutterings- og aktiverende effektorimmunceller og koordinering af efterfølgende adaptive immunhændelser 4 .

TLR-signaltransduktionen kan simpelthen kategoriseres i to hovedveje 5 , 6 . Den ene er afhængig af adapter-myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) - den MyD88-afhængige vej. Alle TLR'er undtagen TLR3 anvender denne vej til aktivering af kaktakaktiver kappa-lette kædeforstærkere af aktiverede B-celler (NF-KB) og mitogenassocierede proteinkinaser (MAPK'er), hvilket fører til ekspression af proinflammatoriske mediatorer, såsom TNF- A, IL-6 og IL-8. Den anden vej benytter TIR-domæne-indeholdende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) - den TRIF-afhængige eller MyD88-uafhængige vej - for at aktivere interferon (IFN) regulatoriske faktorer (IRF'er) og NF-KB, hvilket resulterer i produktion af Type I IFN'er. Intact TLR signaleringEr afgørende for vores daglige beskyttelse mod mikrobielle og virale infektioner; Defekter i TLR signalveje kan føre til immunsvigt og er ofte skadelige for menneskers sundhed. 7

TLR-signalering er imidlertid et "dobbeltkantet sværd" og overdreven, ukontrolleret TLR-aktivering er skadelig. Overaktive TLR-reaktioner bidrager til patogenesen i mange akutte og kroniske humane inflammatoriske sygdomme 8 , 9 . F.eks. Skyldes sepsis, som er karakteriseret ved systemisk inflammation og multiorganskader, primært akutte, overvældende immunresponser mod infektioner, idet TLR2 og TLR4 spiller en afgørende rolle i sepsispatofysiologien 10 , 11 , 12 . Derudover har TLR5 vist sig at bidrage til kronisk lungebetændelse hos patienter med cystisk fibrose 13, 14 . Desuden er dysreguleret endosomal TLR-signalering (f.eks. TLR7 og TLR9) stærkt forbundet med udvikling og progression af flere autoimmune sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid arthritis (RA) 15 , 16 . Disse konvergerende bevislinier identificerer TLR-signalering som et potentielt terapeutisk mål for mange inflammatoriske sygdomme 17 .

Selv om farmakologisk regulering af TLR-responser forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande, er der desværre i øjeblikket meget få forbindelser klinisk tilgængelige til at hæmme TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Dette skyldes dels kompleksiteten og redundansen af ​​TLR-veje involveret i immune homeostasen og sygdomspatologien. Derfor søger efter roman, potenTerapeutiske midler til målretning af flere TLR-signalveje kunne bygge bro over et grundlæggende hul og overvinde udfordringen ved at fremme TLR-hæmmere ind i klinikken.

I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanovidenskab og nanoteknologi fremkommer nanodevices som næste generation TLR modulatorer på grund af deres unikke egenskaber 19 , 20 , 23 . Nanoskala-størrelsen gør det muligt for disse nano-terapeutiske stoffer at få en bedre biofordeling og vedvarende omsætning 24 , 25 , 26 . De kan yderligere funktionaliseres for at opfylde de ønskede farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler 27 , 28 , 29 . Mere spændende opstår biaktiviteten af ​​disse nye nanodevices fra deres egenskaber, som kan skræddersyes tilSpecifikke medicinske anvendelser, snarere end blot at virke som et leveringsmiddel til et terapeutisk middel. For eksempel blev et HDD-lignende nanopartikel med høj densitet designet til at hæmme TLR4-signalering ved fjernelse af TLR4-liganden LPS 23 . Derudover har vi udviklet et peptid-guld nanopartikel hybrid system, hvor de dekorerede peptider kan ændre overfladeegenskaberne af guld nanopartikler, og tillade dem at have forskellige bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Dette gør dem til en speciel klasse af stof (eller "nanoteknologi") som næste generations nano-terapeutik.

I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at identificere en ny klasse af peptid-guld nanopartikler (peptid-GNP) hybrider, der potentielt kan inhibere flere TLR signalveje i fagocytiske immunceller 32 , 33 . Tilgangen er baseret på kommercielt tilgængelige THP-1 reportercellelinier. Reportercellerne består af to stabile, inducerbare reporterkonstruktioner: den ene bærer et sekretiseret embryonalt alkalisk phosphatase- (SEAP) -gen under kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og aktivatorprotein 1 (AP-1); Den anden indeholder et secerneret luciferase reportergen under kontrol af promotorer inducerbare af interferon regulatoriske faktorer (IRF'er). Ved TLR-stimulering fører signaltransduktionen til aktiveringen af ​​NF-KB / AP-1 og / eller IRF'er, som tænder reportergenene til hemmeligt SEAP og / eller luciferase; Sådanne hændelser kan let registreres ved anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser med et spektrofotometer eller luminometer. Ved hjælp af denne fremgangsmåde til screening af vores tidligere etablerede bibliotek af peptid-GNP-hybrider, identificerede vi blykandidater, som potentielt kan hæmme TLR4-signalveje. Den inhibitoriske aktivitet af blypeptid-BNP-hybrider blev derefter valideret ved anvendelse af en anden biokemisk tilgang til immunoblotting og evalueret på andre TLR-veje. Denne fremgangsmåde muliggør hurtig og effektiv screening af nye agenter, der retter sig mod TLR-signalveje.

Protocol

1. Fremstilling af cellekulturmedier og reagenser

  1. Forbered det fuldstændige cellekulturmedium R10 ved at tilsætte supplementerne af 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat i RPMI-1640-mediumet.
    1. Forbered udvælgelseskulturmediet R10-Z ved at tilsætte antibiotika Zeocin (200 μg / ml) til R10 for at opretholde ekspressionen af ​​SEAP under kontrol af NF-KB / AP-1-aktivering. For at udvælge celler, der udtrykker både SEAP- og luciferase-reportergener, tilsættes både zeocin (100 μg / ml) og blasticidin (10 μg / ml) til R10 (som R10-ZB).
  2. Forbered SEAP-substratopløsningen ved at opløse en pose af substratpulveret ( f.eks. QUANTI-Blue) i 100 ml ultrapure, endotoksinfri vand i en ren 125 ml glasflaske.
    1. Vask opløsningen forsigtigt og inkuber den ved 37 ° C i 1 time for at sikre fuldstændig opløsning af substraterne.
    2. <Li> Filter opløsningen ved hjælp af en 0,2 μm membran for at sikre dets sterilitet (valgfri) og opbevar den ved 4 ° C op til 2 uger før brug.
  3. Forbered luciferase-substratopløsningen ved at opløse en pose af substratpulveret ( f.eks . QUANTI-Luc) i 25 ml ultraturt, endotoksinfrit vand i et sterilt 50 ml centrifugerør.
    1. Efter opløsning af pulveret helt, brug opløsningen straks. Alternativt opbevares opløsningen ved 4 ° C (op til en uge) eller ved -20 ° C (op til en måned) inden brug.
      FORSIGTIG: Begge substratløsninger er lysfølsomme og bør undgå lyseksponering, når det er muligt. Flere frysning-optøning cykler af opløsningen kan forårsage ustabilitet af substratet og forkorte holdbarheden.
  4. Forbered stamopløsningen af ​​phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) i molekylært dimethylsulfoxid (DMSO) for at have en koncentration på 500 μg / ml. Lav alikvoter af stamopløsningen (10 μl i et 500 μl rør) og opbevar dem ved -20 ° C.
  5. Forbered LPS (E-coli K12) stamopløsning i sterilt, endotoxinfrit vand i en koncentration på 5 mg / ml, og lav alikvoter til langvarig opbevaring ved -20 ° C. Forbered en fungerende LPS-opløsning ved at fortynde stamcellerne LPS i phosphatpufret saltvand (PBS) i en koncentration på 100 μg / ml og opbevar ved -20 ° C før brug.
    FORSIGTIG: Reagenspræparatet til kulturanvendelser skal udføres i et biosikkerhedsskabe, og alle beholderne skal steriliseres inden brug. Gentagne fryse-optøningscykler af PMA- og LPS-opløsninger bør undgås.

2. Kultur af THP-1 reportercelleafledte makrofager

  1. Brug to THP-1 reportercellelinier: THP-1-XBlue og THP-1-Dual-celler. Den førstnævnte har et SEAP-reportergen kontrolleret af NF-KB / AP-1, og sidstnævnte har et dobbelt reportergen-system, det samme SEAP-reportergen og et IRF-kontrolleret luciferase-gen. DetIr-kulturprocedurer er identiske med undtagelse af udvælgelseskulturmedier.
    1. Opdræt en arbejdende cellebeholdning (~ 5 x 106 celler) i 10 ml R10-medium, spind ned cellerne ved 300 xg i 5 minutter. Resuspender cellerne i 10 ml R10-medium og overfør dem til en T75-dyrkningskolbe. Udveksl kulturmediet hver 2-3 dage, indtil cellerne når en tæthed på 1 x 10 6 celler / ml.
    2. Når cellevækst når sin kapacitet, til passage celler reducere celledensiteten i intervallet 2-5 x 10 5 celler / ml, så cellerne kan fortsætte med at vokse.
    3. Efter mindst 1 passage begynder man at dyrke cellerne i udvælgelseskulturmediet: R10-Z for THP-1-XBlue og R10-ZB for THP-1-Dual. Efter dyrkning af cellerne med selektionskulturmedium i mindst 1 passage er cellerne klar til eksperimentet.
      FORSIGTIG: Celleovergrowing kan føre til signifikant celledød; Celle levedygtighed bør opretholde> 98%. Opbevar en fortegnelse over passagenummeret som cellenJeg kan opføre sig forskelligt efter mange passager (> 20 passager).
      BEMÆRK: Cellkulturflasker kan genbruges flere gange for at spare omkostninger; Denne praksis kan imidlertid øge risikoen for generel forurening og krydskontaminering blandt forskellige kolber (hvis man behandler forskellige cellelinjer samtidig). Under medieudveksling og cellepassage sættes centrifugeringen til 300 xg i 5 minutter.
  2. For at udføre reportercelleanalyse indfører frøceller i en 96-brønds fladbundet cellekulturplade og differentierer dem til makrofager. Fremgangsmåderne beskrives i det følgende.
    1. Overfør cellerne fra kolben til et centrifugerør, drej cellerne ned ved 300 xg i 5 minutter og resuspender dem i R10-mediet i en koncentration på 1 x 106 celler / ml. Tilsæt alikvoter af PMA-opløsningen i cellesuspensionerne med en slutkoncentration på 50 ng / ml.
    2. Overfør 100 μL af cellesuspensionerne i hver brønd af 96-viLl plade ved hjælp af en flerkanalspipette. Inkuber pladen ved 37 ° C (i en cellekultur inkubator) i 24 timer.
    3. Efter inkubation fjernes dyrkningsmediet forsigtigt under anvendelse af en vakuumsuger (eller med en flerkanalspipette) og vask forsigtigt cellerne med PBS (100 μl / brønd) to gange; Tilsæt 100 μL frisk R10 medium i hver brønd. Resten cellerne i 2 dage i en inkubator, før du foretager reporterassayet.
      FORSIGTIG: Reststeget er meget vigtigt, så cellerne kan roe sig ned efter PMA-stimulering til deres normale stille status. Dette kan signifikant reducere baggrundssignalerne fra reportergenerne under ustimulerede betingelser.
      BEMÆRK: Efter 24 stimulation med PMA differentieres cellerne i makrofaglignende fænotype med en karakteristik af celleadhæsion i bunden af ​​brønden og et morfologisk træk ved pseudopodier.

3. Screening for potentielle TLR4 nano-inhibitorer ved hjælp af reportercellerne BEMÆRK: Da TLR4-signalering bruger både MyD88-afhængige og TRIF-afhængige veje, vælges den som det primære mål for at omfatte en lang række TLR-signalveje. THP-1-XBlue-reporterceller anvendes primært til at undersøge NF-KB / AP-1-aktiveringen, mens THP-1-Dual-celler er til IRF-aktivering fra den TRIF-afhængige signaltransduktion.

  1. Identificer den optimale LPS dosis ved at generere en dosis-respons kurve før screeningen.
    1. Fortynd den aktive LPS-opløsning til en slutkoncentration på 0,01 - 100 ng / mL i R10-medium (gør fortynding i log10 skala). Layout plade design og fortynding i en 96-brønds rundbundet kulturplade. Sørg for, at hver brønd har mindst 110 μL opløsning efter fortynding.
    2. Fjern forsigtigt kulturmediet fra den celle-podede plade (fra 2.2.3) under anvendelse af en vakuumsuger.
    3. Overfør det LPS-holdige R10-medium, der er fremstillet i fortyndingspladen (3.1.1) iNto kulturpladen i henhold til udformningen af ​​prøverne. Inkuber pladen ved 37 ° C (i en cellekultur inkubator) i 24 timer.
    4. Om 24 timer overføres supernatanterne forsigtigt (80 μL / brønd) til en ny 96-brønds rundbundet plade. Gennemfør den kolorimetriske og / eller luciferase luminescensassay på disse opløsninger med det samme eller opbevar dem ved 4 ° C (flere timer) eller -20 ° C (dage) forud for assayudviklingen.
      BEMÆRK: Designet af plade layout skal være enkelt og klart for eksperiment og data analyse. For hver tilstand bør 2-4 replikater overvejes. Indsæt altid en negativ kontrolgruppe (LPS null). Det anbefales at anvende THP-1-XBlue-celler til aktivering af NF-KB / AP-1, da Dual-cellerne har en relativ høj baggrund for aktivering af NF-KB / AP-1 efter at være differentieret til makrofager. Det er imidlertid muligt at anvende Dual-cellerne til rapportering af både NF-KB / AP-1 og IRF-aktivering.
  2. Udvikle farvenImetrisk analyse for NF-KB / AP-1-aktiveringen og luciferase luminescensassayet til IRF-aktivering.
    1. For at vurdere NF-KB / AP-1-aktiveringen overføres 20 μl supernatant af hver prøve til en ny 96-brønds fladbundet kulturplade; Og tilsæt 180 l af forvarmet SEAP-substratopløsning i hver brønd. Inkuber pladen ved 37 ° C i 1 - 2 timer for at give farveudviklingen (lyserød til mørk blå). Opsaml absorptionen ved 655 nm på en tallerkenlæser.
      FORSIGTIG: Inkubationstiden kan varieres ud fra farveudviklingen (30 min op til inkubation natten over). Det anbefales at vente, indtil den optiske densitet (OD) i den mørkeste farve når over 1, samtidig med at farvemætningens modning (OD> 3) undgås.
    2. Til analyse af IRF-aktivering, overfør 10 μl supernatant af hver prøve til en 96-brønds, klar bundbundet hvid plade. Tilsæt luciferaseopløsningen (50 μl) og saml straks luminescensen wEll ved godt.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge en luminescenspladelæser med en autoinjektionsfunktion for at sikre konsistensen i luminescensaflæsningen fra godt til godt og fra plade til plade. Hvis substratopløsningerne injiceres manuelt, skal du sikre en konsekvent inkubationstid og læseopsætning for hver brønd.
  3. Gennemfør screeningsassayet på forskellige peptid-BNP-hybrider med 10 ng / mL LPS-stimulering (baseret på 3.1). Følg den samme procedure i 3.2 til reporteranalysudviklingen.
    1. Koncentrer peptid-GNP-hybriderne til 200 nM i R10-medium ved anvendelse af centrifugeringsmetoden. Centrifug 20 volumener af hybridopløsningen (10 nM) ved 18.000 xg i 30 minutter, og kassér forsigtigt supernatanterne. Saml hybriderne (i bunden af ​​røret) i et rør, vask dem med PBS to gange, og suspender hybriderne igen i et rumfang af R10-mediet.
    2. Bland lige mængder af de koncentrerede hybrider ogLPS (20 ng / ml) indeholdende R10-medium for at have en slutkoncentration af hybriderne og LPS til henholdsvis 100 nM og 10 ng / ml.
    3. Fjern dyrkningsmediet fra den dyrkede plade (2.2.3) og tilsæt 100 μl af den blandede opløsning i hver brønd (3 replikater for hver tilstand); Inkludere en negativ kontrol (kun medium) og en LPS kontrol (10 ng / mL LPS uden hybrider).
    4. Efter 24 h inkubation ved 37 ° C overføres mediet af hver brønd i et rør og centrifuger rørene ved 18.000 xg, 4 ° C i 30 minutter. Opsaml supernatanterne (50-80 μL / rør) i en 96-brønds rundbundet plade og udfør reporterassayet som beskrevet i 3.2.
      FORSIGTIG: Når du kasserer supernatanterne efter centrifugering, skal du ikke agitere hybriderne i bunden af ​​røret.
      BEMÆRK: Centrifugeringen i trin 3.3.4 er meget vigtig for at fjerne de ikke-internaliserede nanopartikelhybrider fra dyrkningsmediet og kan undgå hybrids interferens med coLorimetrisk / luminescens aflæsninger. Dette skyldes, at guld nanopartikler kan absorbere brede bølgelængder af lys afhængigt af deres størrelse og agglomerering.

4. Validering af potentielle kandidaters inhiberende virkning

BEMÆRK: For at bekræfte den hæmmende effekt af de potentielle kandidater fra screeningen, anvendes to fremgangsmåder. Den ene er at undersøge dosisresponserne af stimulanterne (LPS) ved en fast hybridkoncentration (eller omvendt); Den anden er at se direkte på inhiberingen på NF-KB / AP-1 og IRF3 signalerne via immunoblotting.

  1. I fremgangsmåde 1 udfører reporterassayet med 100 nM af blyhybriderne og to LPS-koncentrationer ved 1 ng / mL og 10 ng / mL efter de samme procedurer beskrevet i 3.3. Inkluder en inaktiv hybrid (baseret på screeningsresultaterne) som en hybrid kontrol til sammenligning.
  2. For den immunoblottende tilgang skal du følge standarden eXperimentalprocedurer.
    1. Kultur THP-1-celler i R10-medium, frø cellerne ind i en 12-brønds kulturplade (2 x 106 celler / brønd) og differentiere dem i makrofager ved at behandle cellerne med 50 ng / ml PMA i 24 timer efterfulgt af hvile I 2 dage.
    2. Efter celledifferentiering stimulerer celler med 10 ng / mL LPS med / uden hybriderne (100 nM) over tid (op til 4 timer). På forskellige tidspunkter (0, 5, 15, 30, 60, 120 og 240 min) fremstilles cellelysaterne til immunblotting. Inkluder en inaktiv hybrid som en kontrol.
    3. Probe signalerne for IκBa, phosphoryleret p65 og phosphoryleret IRF3 for at undersøge den inhibitoriske virkning af blyhybriderne på aktiveringen af ​​NF-KB og IRF3. Probe β-actin og totale IRF3 signaler som interne kontroller.
      BEMÆRK: Signaltransduktionen opstår ofte meget hurtigere (om et par timer), så udtrykket af reporterenzymerne SEAP og luciferase (24 timer). Det anbefales at også perforMa levedygtighedsassay af de testede hybrider efter 24 timer som en anden valideringsmetode.

5. Evaluering af TLR-specificiteten

BEMÆRK: For at undersøge TLR-specificiteten af ​​blypeptid-GNP-hybriden, testes andre TLR-signalveje, herunder TLR2, TLR3 og TLR5. TLR7, 8 og 9 er udelukket, fordi de THP-1-afledte makrofager ikke reagerer godt på stimuleringen af ​​disse TLR'er på grund af manglen på TLR7, 8 og 9-ekspression i makrofager 34 .

  1. Test forskellige koncentrationer (1 ng / ml til 25 μg / ml) af liganderne specifikke for TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I: C) og TLR5 (flagellin) på begge reporterceller afledte makrofager for at opnå den optimale koncentration efter samme Procedure i 3.1 og 3.2.
  2. Behandle cellerne med blandingerne af blyhybriden (100 nM) og hver TLR-ligand ved koncentrationen opnået fra 5.1 for at evaluere den hemmende specificitet af blyhYbrid ifølge den eksperimentelle procedure beskrevet i 3.3. Inkluder den inaktive hybrid som en kontrol til sammenligning.

Representative Results

Den samlede eksperimentelle tilgang er illustreret i figur 1 . De to THP-1-reportercellelinier, THP-1-XBlue og THP-1-Dual, anvendes til hurtig screening af TLR-responserne ved at undersøge aktiveringen af ​​henholdsvis NF-KB / AP-1 og IRF'er. Aktiveringen af ​​NF-KB / AP-1 kan påvises ved hjælp af SEAP-kolorimetrisk analyse, mens IRF-aktivering overvåges ved luciferase luminescens. De monocytiske THP-1-celler kan let afledes i makrofager for at screene nanodevicesne for deres immunmodulerende aktivitet på de medfødte fagocytiske immunceller. Med reportersystemet kan screeningen udføres på en høj gennemstrømningsmodus; En sådan tilgang er alsidig til opdagelsen af ​​nye immunoterapeutika, især målrettet mod medfødt immunsignalering, såsom TLR-signalering.

Screeningsproceduren og repræsentative resultater er vist i figur 2A Og 2B ). Forskellige koncentrationer af TLR liganderne (TLR4 som et eksempel) testes først for at opnå den optimale koncentration til den egentlige screening af peptid-GNP-hybriderne. TLR4-stimuleringen med LPS resulterede i aktiveringen af ​​NF-KB / AP-1 og produktionen af ​​SEAP. Det frigivne SEAP konverterede substratet og ændrede dets fotofysiske egenskab, som kunne overvåges ved at skifte i lysabsorptionen, hvilket resulterede i opløsningsfarveændringen ( figur 2C ). En sådan ændring er proportional med mængden af ​​SEAP frigivet ved stimulering og kan kvantificeres ved at måle absorbansen ved 655 nm på et spektrofotometer ( figur 2D ). På samme måde førte aktiveringen af ​​IRF'er (udløst af LPS) til ekspression af luciferaserE, som katalyserede substratet til frembringelse af luminescens ( figur 2E ). Baseret på disse dosisresponser blev en optimal koncentration af LPS (10 ng / ml) anvendt til at screene et lille tidligere etableret bibliotek af peptid-GNP-hybrider ( tabel 1 ). Fremstillingen af ​​hybriderne og deres fysisk-kemiske egenskaber blev beskrevet i vores tidligere publikationer 30 , 31 , 32 . Fra screeningen blev en gruppe hybrider (P12 og dets derivater) identificeret for deres potente inhiberende aktivitet på både NF-KB / AP-1 og IRF-aktivering udløst af LPS ( figur 2F ); Det var interessant, at hybrid P13, som var lidt forskellig fra P12 i peptidovertræk, ikke havde nogen hæmmende aktivitet, som kunne tjene som en hybrid kontrol til sammenligning. P13-derivaterne viste forskellige grad af mild inhiberende aktivitet afhængig af otheR dekoreret peptid på overfladen.

Efter identifikation af blyhybriden er det vigtigt at validere den inhiberende aktivitet. Inhiberingen blev først bekræftet ved at undersøge hybridets forskellige forhold til LPS for at udelukke potentielle falske positive resultater på grund af tekniske artefakter. Efterhånden som koncentrationen af ​​LPS øgedes, reducerede den inhiberende virkning af hybrid (ved en fast koncentration) som forventet ( figur 3A Og 3B ). For yderligere at sikre, at den observerede inhibering fra reporterassaysne virkelig var et resultat af nedregulering af NF-KB og IRF-signalering med blyhybriden, blev immunoblottingen udført for direkte at vurdere proteinsignaltransduktionen over tid. Aktiveringen af ​​NF-KB og IRF3 blev undersøgt ved probing af phosphoryleringen af ​​NF-KB subunit p65 og nedbrydning af NF-KB inhibitoren IκBa og phosphorYlation af henholdsvis IRF3. Som vist i figur 3C kunne bly hybrid P12 reducere p65 phosphorylering, inhibere IκBa nedbrydning og forsinket IRF3 phosphorylering, medens den inaktive hybrid P13 ikke kunne (data ikke vist). Alle disse resultater bekræftede, at den identificerede blyhybrid var i stand til at inhibere LPS-medieret TLR4-signalering ved nedregulering af både NF-KB og IRF3-aktivering.

Udover TLR4-signalering blev den inhibitoriske aktivitet af blyhybriden yderligere evalueret på andre TLR-veje, herunder TLR2, TLR3 og TLR5 for at adressere TLR-specificiteten. Som vist i figur 4 var blyhybrid P12 i stand til at reducere TLR2- og TLR5-medieret NF-KB / AP-1-signalering såvel som TLR3-medieret IRF-aktivering; Igen viste den inaktive hybrid P13 ingen hæmmende aktivitet. Disse resultater antyder, at den identificerede blyhybrid har en potent hæmning Ry aktivitet på flere TLR pathways.

figur 1
Figur 1: Samlet eksperimentel tilgang af høj gennemstrømnings screening af TLR-inhibitorer ved anvendelse af reportercelleanalysen. To reportercellelinier anvendes: THP-1-XBlue og THP-1-Dual. Den førstnævnte har et SEAP-reportergen under kontrol af NF-KB / AP-1-aktivering, medens det dobbelte system har et yderligere luciferase-reportergen under kontrol af IRFs-aktivering. Disse celler kan let differentieres i makrofager til høj gennemstrømning screening af immune modulatoriske nanopartikler på medfødt immun signalering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
Figur 2: High-throughput screening af nano-inhibitorer på TLR4 signalering.
( A ) En ordning med eksperimentelle procedurer. ( B ) Et optisk mikroskopisk billede af differentierede makrofager (200x forstørrelse). ( C ) Et repræsentativt billede af opløsningsfarven ændres fra SEAP-reporterassayet; Farven på substratopløsningen blev til lilla eller mørkeblå (fra originalrosa) afhængigt af SEAP-udtrykket i dyrkningsmediet. ( D ) Kvantitativ analyse af SEAP-substratabsorptionen ved 655 nm som respons på LPS-stimulering. ( E ) Luciferase-luminescensen fra IRF-reportersystemet i forhold til LPS-stimulering. ( F ) High-throughput screening identifikation af blypeptid-GNP hybrid P12 og dets derivater i inhibering af både NF-KB / AP-1 og IRF-veje for TLR4-signalering; Hybridkoncentrationen = 100 nM; LPSKoncentration = 10 ng / ml; Linjen repræsenterer middel ± standardafvigelse N = 2. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Validering af den inhiberende aktivitet af blyhybriden. Bekræftelse af den inhibitoriske virkning af blyhybriden med forskellige koncentrationer af LPS på både ( A ) SEAP og ( B ) luciferase reporter-systemer. ( C ) Bekræftelse af inhiberingen af ​​blyhybriden på NF-KB og IRF3-signaleringen via immunoblotting. Den inaktive hybrid P13 blev anvendt som en hybrid kontrol til sammenligning. Hybridkoncentrationen = 100 nM; LPS-koncentrationen = 10 ng / ml; Linjen repræsenterer middel ± standardafvigelse N = 3; * Og *** angiver p <0,05 aNd p <0,001, ved hjælp af envejs ANOVA-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Hjerteffekt af blyhybriden på andre TLR-signalveje.
Inhiberingen af ​​NF-KB / AP-1 ved blyhybriden efter TLR2-stimuleringen (Pam3CSK4 = 1 ng / ml) ( A ) og TL5-stimulering (flagellin = 100 ng / mL) ( B ). ( C ) Reduktionen af ​​både NF-KB / AP-1 og IRF-signalering ved hjælp af blyhybriden efter TLR3-stimuleringen (poly I: C = 25 μg / ml). Hybridkoncentrationen = 100 nM; Linjen repræsenterer middel ± standardafvigelse N = 3; *, ** og *** angiver henholdsvis p <0,05, p <0,01 og p <0,001Envejs ANOVA analyse; Ns: ikke-signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1
Tabel 1: Et lille bibliotek af peptid-BNP-hybrider etableret i vores tidlige studier.
Hybriderne er lavet af en guld nanopartikelkerne (~ 13 nm i diameter) og forskellige hexapeptidbelægninger på overfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Da TLR er involveret i patogenesen af ​​mange inflammatoriske sygdomme, er de fremkommet som terapeutiske mål for moduleringen af ​​immunresponser og inflammatoriske tilstande. Den kliniske udvikling af terapeutiske midler til at inhibere TLR-signalveje har imidlertid haft begrænset succes til dato. Det antimalariale lægemiddel hydroxychloroquin, der hæmmer TLR7 og TLR9, er i klinisk anvendelse 35 , 36 . Tilsvarende har kun et begrænset antal forbindelser udviklet sig til kliniske forsøg, herunder eritoran, en TLR4-antagonist, der udviser kraftige hæmmende virkninger på LPS-medierede inflammatoriske responser i prækliniske studier 37 , 38 , viste positive resultater i kliniske fase I / II Forsøg 39 , 40 , 41 , men i sidste ende fik fase III forsøg ikke at reducere dødelighedenAf patienter med alvorlig sepsis 42 . Denne mangel har mange mulige årsager, hvoraf en er, at sepsis-associerede inflammatoriske reaktioner ofte udløses gennem flere TLR-veje, og således udelukkende blokering af TLR4 er ikke tilstrækkelig til at reducere den overvældende inflammation. Derfor kan udviklingen af ​​nye potente poly-TLR-hæmmere overvinde sådanne kliniske udfordringer og blive næste generations antiinflammatoriske terapeutiske midler. Den her beskrevne screeningsstrategi og -protokol forventes at fungere som et effektivt eksperimentelt værktøj til undersøgelse af TLR-signalering og endnu vigtigere som en lægemiddelopdagelsesplatform for at fremskynde søgningen efter næste generation TLR-hæmmere.

Denne screening tilgang giver flere fordele ved at søge efter nye TLR hæmmere. For det første kan screeningen opnås på en high-throughput måde ved hjælp af de hurtig, følsomme og kvantitative reportercellesystemer. For det andet, med begge reportercellelinier,Screeningen kan udføres for at dække en lang række TLR-signaleringskaskader, herunder NF-KB / AP-1-vejen og type I-interferon-signalering (via IRF'er); Derfor er de ideelle til screening af flere TLR-veje. For det tredje er disse reporterceller genetisk manipuleret fra den humane monocytiske THP-1 cellelinie, hvilket er et godt modelsystem til at studere interventioner rettet mod den medfødte immunrespons. For det fjerde kan cellelinien let opretholdes, og især kan de differentieres i makrofager; Og da makrofager spiller en nøglerolle i mange sygdomsassocierede inflammatoriske tilstande, tjener de som et ideelt mål for screening af immunoterapeutika rettet mod TLR-signalering. For det femte har monocytter og makrofager en imponerende fagocytisk kapacitet, som muliggør en høj cellulær optagelse af nanopartiklerne, hvilket gør dem særligt egnede til at studere nanoskala terapeutiske midler. Desuden kan denne screeningsprotokol anvendes til at søge efter ikke kun den nano-baserede therApeutiske midler, men også andre typer af bioaktive forbindelser.

Selv om denne screeningsplatform er meget alsidig og robust, skal der bruges en vis forsigtighed for at undgå falsk opdagelse. Screeningen er primært baseret på reporterassayet, som er afhængig af ekspressionen af ​​reportergenet under kontrol af specifikke signalhændelser. Ideelt set er reportergenekspression (SEAP og luciferase) proportional med intensiteten af ​​signaltransduktionsvejen af ​​interesse, og virkningen af ​​lægemiddelkandidatene afspejles i analysebestemmelserne. Imidlertid kan i virkeligheden eventuelle biologiske begivenheder, der forekommer opstrøms for reportergenekspression, påvirke resultatet, nogle gange som fører til en falsk positiv opdagelse. For eksempel kan lav ekspression af SEAP skyldes inhiberingen af ​​proteinsynteseprocessen snarere end fra nedreguleringen af ​​TLR-signalering 43 . For at undgå en sådan falsk opdagelse, identificeres den inhibitoriske aktivitetD kandidater skal altid valideres, og guldstandardmetoden er at se direkte på signalveje via immunoblotting. Et andet vigtigt aspekt ved screening af nanopartikelbaserede terapeutiske midler er overfladeegenskaberne af disse nanodevices. Baseret på overflademodifikatorerne kan nanodevicesne have forskellige biologiske aktiviteter. De kan dog også have ikke-specifik bindingsevne til visse biomolekyler. I tilfælde af ikke-specifik binding til SEAP eller luciferase kan den katalytiske aktivitet til substraterne blive kompromitteret af disse nanodevices, hvilket fører til potentiel falsk opdagelse. Inklusive ekstra kontrolgrupper ( f.eks . Kun nanodevice) i screeningen reducerer risikoen for falsk opdagelse. Sidst men ikke mindst skal cytotoksiciteten af ​​de identificerede blykandidater undersøges for at udelukke cytotoksicitet som en bidragende faktor til falsk opdagelse. Dette kan gøres samtidigt under screeningsprocessen ved anvendelse af et standard levedygtighedsassay ( f.eks .MTS eller MTT) eller i et separat eksperiment.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende støtten fra programmet for professor i Special Appointment (Eastern Scholar) ved Shanghai Higher Learning (HY), startfonden fra Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-støtte fra Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), og finansieringen fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET og HY).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113, (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14, (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227, (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282, (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61, (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22, (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29, (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185, (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11, (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50, (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11, (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188, (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192, (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31, (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77, (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33, (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6, (9), e24374 (2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172, (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7, (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30, (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9, (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186, (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7, (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304, (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7, (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48, (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14, (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38, (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309, (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9, (1), 247-257 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics