Toll-lignende receptor (TLR) signalering spiller en vigtig rolle i patofysiologien af mange humane inflammatoriske sygdomme, og regulering af TLR-responser af bioaktive nanopartikler forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande. THP-1-cellebaserede reporterceller tilvejebringer en alsidig og robust screeningsplatform til identifikation af nye inhibitorer af TLR-signalering.
Farmakologisk regulering af Toll-lignende receptor (TLR) reaktioner har stort løfte i behandlingen af mange inflammatoriske sygdomme. Der har imidlertid været begrænsede forbindelser hidtil til at dæmpe TLR-signalering, og der har ikke været klinisk godkendte TLR-hæmmere (undtagen det anti-malariale lægemiddelhydroxychloroquin) i klinisk anvendelse. I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanoteknologi kan manipulation af immunrespons ved hjælp af nanoapparater give en ny strategi til behandling af disse sygdomme. Her præsenterer vi en high-throughput screeningsmetode til hurtigt at identificere nye bioaktive nanopartikler, der hæmmer TLR-signalering i fagocytiske immunceller. Denne screeningsplatform er bygget på THP-1-cellebaserede reporterceller med kolorimetriske og luciferaseanalyser. Reportercellerne er konstrueret fra den humane THP-1 monocytiske cellelinie ved stabil integration af to inducerbare reporterkonstruktioner. Den ene udtrykker et udskilt embryonalt alkalisk phosphatase (SEAP) genUnder kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og AP-1, og den anden udtrykker et udskilt luciferase-reportergen under styring af promotorer inducerbare af interferonregulatoriske faktorer (IRF'er). På grund af TLR-stimulering aktiverer reportercellerne Transkriptionsfaktorer og producerer efterfølgende SEAP og / eller luciferase, som kan detekteres under anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser. Ved anvendelse af et bibliotek af hybrider af peptid-guld nanopartikel (GNP), der blev etableret i vores tidligere undersøgelser som eksempel, identificerede vi en peptid-GNP-hybrid, som effektivt kunne hæmme de to arme af TLR4-signaleringskaskade udløst af dets prototypiske ligand, lipopolysaccharid (LPS). Resultaterne blev valideret ved standard biokemiske teknikker, herunder immunoblotting. Yderligere analyse fastslog, at denne bly hybrid havde et bredt inhibitorisk spektrum, der virker på flere TLR-veje, herunder TLR2, 3, 4 og 5. Denne eksperimentelle tilgang gør det muligt hurtigt at vurdere hvemRa nanopartikel (eller andre terapeutiske forbindelser) kan modulere specifik TLR-signalering i fagocytiske immunceller.
Toll-lignende receptorer (TLR'er) er et af hovedelementerne i det medfødte immunsystem, der bidrager til den første forsvarslinje mod infektioner. TLR'er er ansvarlige for at registrere invaderende patogener ved at genkende et repertoire af patogenassocierede molekylære mønstre (eller PAMP'er) og montering af forsvarsreaktioner gennem en kaskade af signaltransduktion 1 , 2 . Der er identificeret 10 menneskelige TLR'er; Bortset fra TLR10, for hvilken liganden (e) forbliver uklare, kan hver TLR genkende en særskilt konserveret gruppe af PAMP'er. For eksempel kan TLR2 og TLR4, primært placeret på celleoverfladen, detektere lipoproteiner og glycolipider fra henholdsvis Gram-positiv og Gram-negativ bakterier; Mens TLR3, TLR7 / 8 og TLR9, der hovedsagelig er til stede i endosomale rum, kan mærke RNA og DNA-produkter fra virus og bakterier 3 . Når stimuleret af PAMP'er udløser TLR'er væsentlige immunresponser ved at frigive pro-infLammatoriske mediatorer, rekrutterings- og aktiverende effektorimmunceller og koordinering af efterfølgende adaptive immunhændelser 4 .
TLR-signaltransduktionen kan simpelthen kategoriseres i to hovedveje 5 , 6 . Den ene er afhængig af adapter-myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) – den MyD88-afhængige vej. Alle TLR'er undtagen TLR3 anvender denne vej til aktivering af kaktakaktiver kappa-lette kædeforstærkere af aktiverede B-celler (NF-KB) og mitogenassocierede proteinkinaser (MAPK'er), hvilket fører til ekspression af proinflammatoriske mediatorer, såsom TNF- A, IL-6 og IL-8. Den anden vej benytter TIR-domæne-indeholdende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) – den TRIF-afhængige eller MyD88-uafhængige vej – for at aktivere interferon (IFN) regulatoriske faktorer (IRF'er) og NF-KB, hvilket resulterer i produktion af Type I IFN'er. Intact TLR signaleringEr afgørende for vores daglige beskyttelse mod mikrobielle og virale infektioner; Defekter i TLR signalveje kan føre til immunsvigt og er ofte skadelige for menneskers sundhed. 7
TLR-signalering er imidlertid et "dobbeltkantet sværd" og overdreven, ukontrolleret TLR-aktivering er skadelig. Overaktive TLR-reaktioner bidrager til patogenesen i mange akutte og kroniske humane inflammatoriske sygdomme 8 , 9 . F.eks. Skyldes sepsis, som er karakteriseret ved systemisk inflammation og multiorganskader, primært akutte, overvældende immunresponser mod infektioner, idet TLR2 og TLR4 spiller en afgørende rolle i sepsispatofysiologien 10 , 11 , 12 . Derudover har TLR5 vist sig at bidrage til kronisk lungebetændelse hos patienter med cystisk fibrose 13, 14 . Desuden er dysreguleret endosomal TLR-signalering (f.eks. TLR7 og TLR9) stærkt forbundet med udvikling og progression af flere autoimmune sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid arthritis (RA) 15 , 16 . Disse konvergerende bevislinier identificerer TLR-signalering som et potentielt terapeutisk mål for mange inflammatoriske sygdomme 17 .
Selv om farmakologisk regulering af TLR-responser forventes at være gavnlig under mange inflammatoriske tilstande, er der desværre i øjeblikket meget få forbindelser klinisk tilgængelige til at hæmme TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Dette skyldes dels kompleksiteten og redundansen af TLR-veje involveret i immune homeostasen og sygdomspatologien. Derfor søger efter roman, potenTerapeutiske midler til målretning af flere TLR-signalveje kunne bygge bro over et grundlæggende hul og overvinde udfordringen ved at fremme TLR-hæmmere ind i klinikken.
I lyset af de hurtige fremskridt inden for nanovidenskab og nanoteknologi fremkommer nanodevices som næste generation TLR modulatorer på grund af deres unikke egenskaber 19 , 20 , 23 . Nanoskala-størrelsen gør det muligt for disse nano-terapeutiske stoffer at få en bedre biofordeling og vedvarende omsætning 24 , 25 , 26 . De kan yderligere funktionaliseres for at opfylde de ønskede farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler 27 , 28 , 29 . Mere spændende opstår biaktiviteten af disse nye nanodevices fra deres egenskaber, som kan skræddersyes tilSpecifikke medicinske anvendelser, snarere end blot at virke som et leveringsmiddel til et terapeutisk middel. For eksempel blev et HDD-lignende nanopartikel med høj densitet designet til at hæmme TLR4-signalering ved fjernelse af TLR4-liganden LPS 23 . Derudover har vi udviklet et peptid-guld nanopartikel hybrid system, hvor de dekorerede peptider kan ændre overfladeegenskaberne af guld nanopartikler, og tillade dem at have forskellige bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Dette gør dem til en speciel klasse af stof (eller "nanoteknologi") som næste generations nano-terapeutik.
I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at identificere en ny klasse af peptid-guld nanopartikler (peptid-GNP) hybrider, der potentielt kan inhibere flere TLR signalveje i fagocytiske immunceller 32 , </suP> 33 . Tilgangen er baseret på kommercielt tilgængelige THP-1 reportercellelinier. Reportercellerne består af to stabile, inducerbare reporterkonstruktioner: den ene bærer et sekretiseret embryonalt alkalisk phosphatase- (SEAP) -gen under kontrol af en promotor inducerbar af transkriptionsfaktorerne NF-KB og aktivatorprotein 1 (AP-1); Den anden indeholder et secerneret luciferase reportergen under kontrol af promotorer inducerbare af interferon regulatoriske faktorer (IRF'er). Ved TLR-stimulering fører signaltransduktionen til aktiveringen af NF-KB / AP-1 og / eller IRF'er, som tænder reportergenene til hemmeligt SEAP og / eller luciferase; Sådanne hændelser kan let registreres ved anvendelse af deres tilsvarende substratreagenser med et spektrofotometer eller luminometer. Ved hjælp af denne fremgangsmåde til screening af vores tidligere etablerede bibliotek af peptid-GNP-hybrider, identificerede vi blykandidater, som potentielt kan hæmme TLR4-signalveje. Den inhibitoriske aktivitet af blypeptid-BNP-hybrider blev derefter valideret ved anvendelse af en anden biokemisk tilgang til immunoblotting og evalueret på andre TLR-veje. Denne fremgangsmåde muliggør hurtig og effektiv screening af nye agenter, der retter sig mod TLR-signalveje.
Da TLR er involveret i patogenesen af mange inflammatoriske sygdomme, er de fremkommet som terapeutiske mål for moduleringen af immunresponser og inflammatoriske tilstande. Den kliniske udvikling af terapeutiske midler til at inhibere TLR-signalveje har imidlertid haft begrænset succes til dato. Det antimalariale lægemiddel hydroxychloroquin, der hæmmer TLR7 og TLR9, er i klinisk anvendelse 35 , 36 . Tilsvarende har kun et begrænset antal forbin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende støtten fra programmet for professor i Special Appointment (Eastern Scholar) ved Shanghai Higher Learning (HY), startfonden fra Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-støtte fra Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), og finansieringen fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET og HY).
THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |